Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l'aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

Résumé

L'application de laser désorption / ionisation de temps assistée par matrice de vol (MALDI-TOF), la spectrométrie de masse (MS) directement à un bouillon de culture de sang accélère l'identification de bactéries. La méthode présentée est une méthode rapide et fiable pour l'identification des bactéries à Gram négatif directement à partir de bouillon de culture de sang.

Résumé

Un rôle important du laboratoire de microbiologie clinique est de fournir une identification rapide de bactéries causant l'infection sanguine. Identification traditionnelle nécessite la sous-culture de signalé bouillon de culture de sang avec identification disponible uniquement après que les colonies sur gélose solide ont mûri. MALDI-TOF MS est une méthode fiable pour l'identification rapide de la majorité des bactéries cliniquement pertinentes lorsqu'il est appliqué à des colonies sur un milieu solide. L'application de MALDI-TOF MS directement bouillon de culture de sang est une approche intéressante car elle a le potentiel d'accélérer l'identification des espèces de bactéries et d'améliorer la gestion clinique. Cependant, un problème important à surmonter est la pré-analyse suppression de brouilleurs résines, des protéines et de l'hémoglobine contenue dans le sang culture spécimens qui, s'il n'est pas retiré, interfèrent avec les spectres MS et peuvent entraîner des scores d'identification discrimination insuffisantes ou faibles. En outre, il est nécessaire de concentrer bacteria pour développer les spectres d'une qualité suffisante. La méthode présentée décrit la concentration, la purification et l'extraction des bactéries Gram négatives permettant l'identification précoce des bactéries à partir d'un bouillon de culture de sang signalé.

Introduction

Les patients atteints d'une infection sanguine (BSI) en raison de bactéries continuent d'avoir une forte mortalité à l'hôpital, allant de 6 à 48% ^1. La livraison de l'antibiotique empirique approprié favorise la survie et dans le sous-ensemble de patients atteints de sepsis sévère, chaque heure de retard à un traitement approprié est corrélée à une diminution de la survie ^{de 2,3.} En conséquence, un objectif clé du laboratoire clinique est de détecter rapidement, identifier et communiquer la présence de bactéries dans les cultures de sang pour éclairer les décisions cliniques. Il a été démontré que le laboratoire de microbiologie a la plus grande influence sur la thérapie antimicrobienne au moment de la notification de la coloration de Gram ⁴ et récemment, une étude d'observation a démontré que le temps de désorption laser assistée par matrice / ionisation de spectrométrie de masse de vol (MALDI-TOF MS) réalisée directement sur ​​des bouillons de culture de sang influencer la prescription dans plus d'un tiers de BSI causée par des bactéries Gram négatif ^5.

Le développement commercial de MALDI-TOF MS a conduit à un outil de laboratoire efficace pour l'identification des micro-organismes ^6,7. La technologie est maintenant bien établie et a été intégrée dans de nombreux laboratoires pour l'identification rapide et précise des micro-organismes isolés sur solide ^6,8 médiatique. L'application directe de MALDI-TOF MS à la culture de sang (BC) de bouillon qui ont signalé «positif» pour les micro-organismes recours à des cliniciens et des gestionnaires de laboratoire en raison de la possibilité d'obtenir une identification plus rapide des micro-organismes à faible coût.

L'utilité clinique de l'application directe de MALDI-TOF MS de bouillon de culture de sang a été limitée par le large éventail de sensibilités observées par rapport aux méthodes basées sur la culture de phénotypique norme d'identification, avec les rapports de l'identification réussie des bactéries Gram négatives allant de 47 à 98,9 ^9-11%. La variation de la sensibilité probableconcerne la composition BC bouillon, la concentration bactérienne initiale, la variation dans les méthodes de préparation des échantillons ainsi que le réseau des organismes Gram négatif rencontrées dans les populations d'étude ^9. Par rapport à ces autres protocoles publiés la méthode présentée ici permet d'éviter l'utilisation de l'éthanol, le chlorure d'ammonium ou supplémentaire (non-matrice) acétonitrile. Par conséquent, le culot bactérien demeure viable (jusqu'à ce que le point d'extraction de la protéine) permettant méthodes potentielles de test phénotypique de susceptibilité à être appliqués directement sur ces micro-organismes dans le bouillon. En outre, la méthode présentée a été montré pour être peu coûteux, fiable et rapide de l'identification bactérienne disponible dans 25 min de la culture de sang Gram résultats de la coloration, avec un minimum de «pratique» du temps ^12.

Cette méthode est un protocole simple en interne spin-lyse en utilisant l'extraction de l'acide formique est appliqué directement sur des bouillons de culture de sang positifs pour identifier Gram négatif bacteria avec la technologie MALDI-TOF MS.

Protocole

1. Hémoculture bouillons Signaler comme «Positive»

1. Retirez la bouteille d'hémoculture signalé du cabinet continue d'incubation de surveillance et le placer dans une enceinte de sécurité biologique. Remarque: Les bouteilles peuvent contenir des micro-organismes dangereux et les précautions universelles doivent être suivies. En raison du risque d'aérosols infectieux dans l'échantillonnage, toutes les procédures d'échantillonnage doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire de biosécurité de classe II.

2. Coloration de Gram est préparé

1. Préparer une coloration de Gram à partir du bouillon de culture de sang signalé conformément aux protocoles institutionnels locaux. Remarque: Lorsque des organismes Gram négatifs sont identifiés sur la microscopie du bouillon de culture de sang est traité selon la méthode suivante. Lorsque des organismes Gram positifs sont identifiés, une méthode moléculaire alternatif visant l'identification génétique et les marqueurs de résistance est appliquée au bouillon (pas abordé dans cet article) ^13.

e "> 3. Transfert de sang Marqué Bouillon de culture à un tube de séparation de sérum

1. Mélanger doucement le flacon d'hémoculture en inversant 2-3x.
2. Au sein de l'enceinte de sécurité biologique fixer une seringue de 10 ml à un dispositif de transfert du sang de sécurité.
3. Attacher le dispositif de transfert du sang vers le flacon de culture de sang et de retirer 5 ml du bouillon dans la seringue. Transférer le bouillon de la Colombie-Britannique aspiré dans un tube de séparation de sérum.

4. Concentration de sang Bouillon de culture

1. Centrifuger le tube de séparation de sérum à 1 250 xg pendant 15 min, ce qui supprime un grand volume de globules rouges.
2. Aspirer et jeter le surnageant à l'aide d'une pipette de transfert stérile en prenant soin de laisser environ 1 ml de la couche leuco-plaquettaire immédiatement au-dessus de l'interface gel / fluide. Remarque: Les bouteilles d'aérobie montrent une nette séparation des globules rouges au fond du tube avec l'interface gel / fluide apparaissant une couleur blanc opaque. En revanche, lorsqueappliqué à la anaérobie bouillon de culture de sang lytique l'interface gel / liquide apparaît comme une couleur rouge foncé en raison des composants de cellules lysées de sang rouge restant en suspension dans le surnageant.

5. Répétez les étapes de lavage centrifugation

1. Mélanger délicatement les dernières 1 ml de buffy manteau fluide au-dessus de l'interface de gel avec une pipette stérile, puis transférer la totalité du volume dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger le nouveau tube à 288 g pendant 30 sec.
2. Transférer le surnageant en utilisant un jetable de 1 ml pipette de transfert en plastique dans un nouveau tube de 1,5 ml et jeter le tube avec le culot. Remarque: Il est essentiel lors de cette étape que l'on prend soin d'éviter le transfert de la pastille. Ceci est particulièrement important pour un échantillon en cours de traitement à partir de la bouteille de BC anaérobie comme le surnageant reste pigmenté et le culot est pas toujours clairement visible.

6. Lyse des cellules résiduelles

1. Centrifugeuse l'échantillon à 18 407 xg pendant 1 min, puis aspirer (et conserver) le surnageant à l'aide d'une amende transfert à bout pipette pour laisser le moins de liquide résiduel que possible sans perturber le culot.
2. Reprendre le culot résiduel dans 1 ml de DNAse et RNAse stérile eau libre par aspiration et refoulement. Remarque: Certains auteurs ont décrit l'utilisation de solutions d'alcool à la place de l'eau stérile pour remettre le culot qui rend les bactéries non viables.
3. Centrifuger la solution remises en suspension à 18 407 g pendant 1 min.

7. Extraction des protéines bactériennes

1. Aspirer et jeter le surnageant, à nouveau par aspiration avec une pointe pipette bien veiller à ce que le plus de liquide possible est retiré.
2. Reprendre le culot dans 10 ul d'acide formique (70% v / v). Remarque: L'acide formique peut affecter le corps si elle est inhalée ou si elle vient en contact avec la peau. Lors de la préparation ou la manipulation de solutions, il est rRecommandés que le personnel utilise une hotte de chimiste en plus de l'équipement de protection individuelle.
3. Bien mélanger à l'aide de la pipette afin d'assurer une remise en suspension solution homogène. Utilisation de l'embout de pipette pour perturber physiquement la pastille peut être nécessaire pour assurer une solution plus homogène.

8. Préparation de MALDI-TOF Plaque de mire

1. Inoculer une assiette propre cible MALDI-TOF avec 2 pi de la suspension préparée par point cible. Préparer trois sites cibles pour chacun des échantillons de surmonter les problèmes occasionnels de lit échoué.
2. Laisser la plaque cible MALDI-TOF à sécher. La vitesse de séchage peut être augmentée en plaçant la plaque sur le bord de la hotte afin d'optimiser le débit d'air à travers la plaque.
3. Superposer chaque spot séché avec 1 pl de la solution de matrice (10 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA), 50% d'acétonitrile, l'acide trifluoroacétique 2,5%). Remarque: solution Matrix peut affecter le corps si elle est inhalée ou si elle vient en contact avec la peau. Lors de la préparation ou la manipulation de solutions, il est recommandé que le personnel utilise une hotte de chimiste en plus de l'équipement de protection individuelle.
4. Laisser la plaque cible MALDI-TOF à sécher sur le bord de la hotte de laboratoire, comme décrit ci-dessus. Assurez-vous une préparation homogène remplit chacun des points cibles sur la plaque.

9. Lieu MALDI-TOF plaque cible dans le spectromètre de masse

1. Insérer la plaque cible MALDI-TOF dans le spectromètre de masse MALDI-TOF. S'assurer que la plaque est assis au ras des plaques de ressort. Remarque: ne pas insérer la plaque cible jusqu'à ce que tous les points cibles sont secs.
2. S'assurer que le joint en caoutchouc est propre de peluches, poussières et des cheveux pour permettre les conditions de vide nécessaires peuvent être créés.
3. Fermez le couvercle du stade MALDI-TOF et puis appuyez sur le bouton "in / out" sur le devant de l'appareil. Le couvercle sera maintenant verrouiller et permettre le vide nécessaire à créer.

10. MALDI-TOF MS Spectra acquisition

1. Ouvrez le MALDI Biotypage et logiciels FlexControl.
2. Dans le logiciel de dactylographie sélectionnez "nouvelle classification" dans le menu déroulant intitulé "fichier". Nommez le projet et puis sélectionnez «nouveau». Sélectionnez "Suivant" pour terminer l'installation du logiciel de dactylographie.
3. Dans la fenêtre du logiciel de contrôle d'identifier le graphique sur l'écran de la plaque cible. Mettre en évidence les points cibles MALDI-TOF qui sont en usage en déplaçant la souris sur les points inoculés tout en maintenant le bouton gauche de la souris.
4. Utilisez le bouton droit de la souris pour cliquer n'importe où sur les postes cibles sélectionnés, puis sélectionnez "ajouter analytes" dans le menu déroulant.
5. Ajouter sang culture détails d'identification de la colonne "ID" pour chacun des points cibles et cliquez sur "Suivant" lorsque vous avez terminé.
6. Sélectionnez la base de données de spectres "de la taxonomie" commercial et sélectionnez "Suivant". Remarque: Labotoires peuvent utiliser supplémentaires en interne ou bases de données commerciales pour augmenter le nombre de spectres de référence.
7. Cliquez sur "Terminer" et le MALDI-TOF MS commencera à générer des spectres. Remarque: Les paramètres MALDI-TOF ont été selon les paramètres de fabrication (en mode linéaire positif, 60 Hz fréquence de laser, 20 kV tension d'accélération, 16,7 kV tension de IS2, 170 ns retard d'extraction, et 2,000-20,137 m / z gamme).
8. Si le logiciel de contrôle MALDI échoue à générer des pics, saisie manuelle des spectres peut être effectuée (méthode non décrite).

11. Analyse de post interprétation de MALDI-TOF MS Partitions

1. Une fois les spectres sont acquis et l'analyse est terminée, cliquez sur le bouton "+" à côté de l'identification des espèces sur le logiciel de dactylographie pour développer la liste d'identification de chaque cible.
2. Étudier le top 5 des identifications, notant si le top 5 sont similaires. Discordants top 5 des genres avec des scores ≥ 1.7 de la même cibleplace a évoqué la possibilité de bouillons mixtes. Remarque: la technologie MALDI-TOF est peu sensible pour la détection de bouillons mixtes. Par exemple, quand un bouillon contient des espèces mixte un score élevé de confiance peut être identifié pour que l'une des espèces mixtes.
3. Quand un score ≥ 2.0 est noté pour le plus grand match sur un point cible, signaler les espèces.
4. Lorsque le score le plus élevé sur un point cible est ≥ 1,7, mais <2,0, rapport que les genres. Si les critères supplémentaires des 5 meilleurs identifications sont concordantes, ensuite rapport au niveau de l'espèce.

12. Enlèvement de la plaque cible MALDI-TOF

1. Lorsque tous les spectres sont presse le bouton "in / out" sur la machine MALDI-TOF.
2. Ouvrez le MALDI-TOF plaque cible récipient et retirer la plaque cible MALDI-TOF.
3. Si vous utilisez une plaque cible MALDI-TOF réutilisables, nettoyer toutes les taches de cibles à l'aide d'alcool et de stocker la plaque MALDI-TOF à température ambiante une fois qu'elle est propre et sèche.

Résultats

Le MS spectres MALDI-TOF généré sont comparés à la base de données de référence intégrée des spectres. Un score logarithmique est attribué pour la confiance du match entre l'isolat de test et la base de données de référence isolats, avec la recommandation d'un score ≥ 1,7 nécessaires à l'identification probable au niveau de la génération (figure 1) et ≥ 2,0 pour une identification probable des espèces (Figure 2). Rapport au niveau de l'espèce lors...

Discussion

Il est important lors de l'application MALDI-TOF MS de bouillon de culture de sang que les étapes de post de centrifugation sont effectuées avec suffisamment de soin à ne pas remixer les composants séparés. Il est particulièrement important de supprimer les constituants de culture de sang et de protéines cellulaires humaines, y compris l'hémoglobine, qui peuvent produire des pointes interférant avec les spectres MALDI-TOF.

Bien que MS fabrique recommander couper du score de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software