Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

Резюме

Применение матрицы-лазерной десорбцией / время ионизации полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (MS) непосредственно к культуре крови бульона ускоряет идентификацию бактерий. Представленный метод является быстрым и надежным методом идентификации грамотрицательных бактерий непосредственно из культуры крови бульоне.

Аннотация

Важную роль в клинической лаборатории микробиологии является обеспечение быстрой идентификации бактерий, вызывающих инфекции кровотока. Традиционный идентификация требует суб-культуру сигнальное культуры крови бульоне с идентификации доступных только после колоний на твердой агар созрели. MALDI-TOF MS является надежным, быстрый способ идентификации большинства клинически значимых бактерий при нанесении на колоний на твердых средах. Применение MALDI-TOF MS непосредственно к культуре крови бульона является привлекательным подход, поскольку он имеет потенциал для ускорения идентификации видов бактерий и улучшить клиническое управление. Тем не менее, важной проблемой для преодоления является удаление предварительно анализ интерферирующих смол, белков и гемоглобина, содержащихся в культуре образцов крови, которые, если их не удалить, мешают MS спектров и может привести к недостаточному или низкими оценками идентификации дискриминации. Кроме того, необходимо сосредоточиться BacterИ.А. развивать спектры достаточно высокого качества. Представленный метод описывает концентрацию, очищение, и извлечение грамотрицательных бактерий, позволяющих раннего выявления бактерий из сигнальном культуры крови бульоне.

Введение

Пациенты с инфекции кровотока (BSI) из-за бактерий по-прежнему имеют высокую смертность в стационаре, начиная от 6-48% ^1. Доставка соответствующего эмпирического антибиотика способствует выживанию и в подгруппе пациентов с тяжелым сепсисом, каждый час задержки в соответствующей терапии коррелирует со снижением выживаемости ^2,3. Соответственно, одной из ключевых задач клинической лаборатории является быстрое обнаружения, идентификации и общайтесь присутствие бактерий в культурах крови сообщить клинические решения. Было показано, что микробиологическая лаборатория имеет наибольшее влияние на антимикробной терапии на момент отчетности Граму ⁴ и недавно, обсервационное исследование показало, что время матрица-активированная лазерная десорбция / ионизация массового полета спектрометрии (MALDI-TOF MS) выполняется непосредственно на культуры крови бульонов влиять назначения в более чем одной трети BSI, вызванного грамотрицательных бактерий ^5.

Промышленное освоение MALDI-TOF MS привело к действенным лабораторного инструмента для идентификации микроорганизмов ^6,7. Технология в настоящее время хорошо известны и была интегрирована в многих лабораториях для быстрого и точного определения микроорганизмов, выделенных на твердой среде ^6,8. Прямое применение MALDI-TOF MS культуры крови (до н.э.) бульона, что дали понять, "позитивный" для микроорганизмов обращений в обоих клиницистов и лабораторного менеджеров из-за возможности получения более раннюю идентификацию микроорганизмов при низких затратах.

Клиническая полезность прямого применения MALDI-TOF MS к культуре крови бульона было ограничено широким диапазоном чувствительности наблюдаемых по сравнению со стандартным фенотипическая культуры на основе методов идентификации, с сообщениями о успешной идентификации грамотрицательных бактерий, начиная от 47-98.9 % ^9-11. Изменение чувствительности всегоотносится к композиции бульона BC, начальной концентрации бактерий, вариации методов подготовки образцов, а также массив грамотрицательных организмов, встречающихся в популяции исследования ^9. По сравнению с этими другими опубликованными протоколами метод, представленный здесь избегает использования этанола, хлорид аммония или дополнительного (не матрица) ацетонитрила. В результате бактериальный осадок не будет остаются жизнеспособными (до точки экстракции белка), позволяющий потенциальные методы испытаний фенотипический восприимчивость к быть нанесен непосредственно на этих организмов в бульоне. Кроме того, данный способ, как было показано, чтобы быть недорогой, надежный и быстрый с бактериальной идентификации доступных в пределах 25 мин из культуры крови грамотрицательных результатов окраски, с минимальными "руки на" время ^12.

Этот метод представляет собой простой протокол в доме спин-лизис использования добычу муравьиной кислоты наносится непосредственно на положительных культуральных бульонах крови для выявления грамотрицательных бacteria с технологией MALDI-TOF MS.

протокол

1. Кровь Культура Отвары Отметить как «Позитивный»

1. Снимите сигнализируется бутылку культуры кровь из непрерывного мониторинга инкубационного шкафа и поместить его в кабинете биологической безопасности. Примечание: Бутылки могут содержать опасные микроорганизмы и универсальные меры предосторожности должны быть выполнены. В связи с риском инфекционных аэрозолей в выборке, все процедуры отбора проб должны быть выполнены в шкафу с ламинарным потоком биобезопасности класса II.

2. Граму готов

1. Подготовьте Граму от сигнальное культуры крови бульоне в соответствии с местными институциональными протоколов. Примечание: Когда грамотрицательные микроорганизмы идентифицируют по микроскопии культуру крови бульон обрабатывается в соответствии со следующим способом. Когда грамположительные организмы будут определены, альтернативный молекулярный метод таргетинга генетическую идентификацию и маркеры сопротивления применяется в бульон (не рассматриваются в этой статье) ^13.

е "> 3. Передача помеченные крови культуральной жидкости в сыворотке Разделительный Tube

1. Аккуратно перемешайте бутылку культуры крови путем обращения 2-3х.
2. В шкафу биобезопасности приложить 10 мл шприц с передаточным безопасность крови устройства.
3. Установите передачи крови устройства к бутылке культуры крови и вывести 5 мл бульона в шприц. Перенести атмосферный BC бульон в разделительную трубку сыворотки.

4. Концентрация крови культуральной жидкости

1. Центрифуга, отделяющую трубку сыворотки в 1250 мкг в течение 15 мин, который удаляет большой объем эритроцитов.
2. Аспирируйте и отбросить супернатант с помощью стерильной пипетки передачи быть осторожным, чтобы оставить примерно 1 мл светлого сгустка крови непосредственно над интерфейсом гель / жидкости. Примечание: аэробные бутылки показать четкое разделение эритроцитов к нижней части трубы с интерфейсом гель / жидкость появляется непрозрачный белый цвет. В противоположность этому, когдаприменяется к литической анаэробной культуры крови бульона интерфейс гель / жидкость выглядит как темно-красный цвет из-за лизированные компоненты эритроцитов остальные приостановлены в супернатанте.

5. Повторите центрифугирования вымыть шаги

1. Аккуратно перемешайте последние 1 мл поглощающее покрытие жидкости над интерфейсом гель стерильной пипеткой, а затем передать весь объем в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Центрифуга новую трубку при 288 мкг в течение 30 сек.
2. Передача супернатант, используя пластиковые одноразовые 1 мл пипетки передачи в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и выбросить трубку с шариком. Примечание: Очень важно на этом этапе, что осторожность, чтобы избежать передачу таблетки. Это особенно важно для образца обрабатываемой из анаэробного бутылки до н.э. как супернатант остается пигментированный осадок и не всегда хорошо видно.

6. Лизис остаточных клеток

1. Центрифуга образца при 18407 х г в течение 1 мин, а затем аспирата (и выбросить) супернатант с помощью тонкой передачи наконечником пипетки, чтобы оставить как можно меньше остаточной жидкости, насколько это возможно, не нарушая гранул.
2. Ресуспендируют остаточный осадок в 1 мл стерильной ДНКазы и РНКазы свободной воды с помощью пипетки вверх и вниз. Примечание: Некоторые авторы описали использование спиртовых растворах вместо стерильной воды для ресуспендируют осадок которая делает бактерии нежизнеспособных.
3. Центрифуга ресуспендированные решение на 18407 мкг в течение 1 мин.

7. Добыча бактериальных белков

1. Аспирируйте и отбросить супернатант, опять же используя стремление с тонкой пипетки гарантируя, что столько жидкости, сколько возможно удаляется.
2. Ресуспендируют осадок в 10 мкл муравьиной кислоты (70% об / об). Примечание: муравьиная кислота может влиять на тело, если оно вдыхании или если он вступает в контакт с кожей. При подготовке или манипулирования решения оно тecommended, что персонал использовать вытяжной шкаф в дополнение к индивидуальной защиты.
3. Хорошо перемешать с помощью пипетки для обеспечения гомогенной ресуспендировали решение. Использование пипетки физически нарушить гранул могут быть необходимы для обеспечения более гомогенного раствора.

8. Подготовка MALDI-TOF Целевая плиты

1. Привить чистую MALDI-TOF мишень с 2 мкл подготовленной суспензии в целевой точке. Подготовьте 3 целевые сайты для каждого образца, чтобы преодолеть случайные проблему не удалось читает.
2. Разрешить визирная MALDI-TOF для просушки. Скорость сушки может быть увеличена путем размещения пластины на краю вытяжном шкафу, чтобы максимизировать воздушный поток через пластину.
3. Накладываются друг на высушенную место с 1 мкл матричного раствора (10 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA), 50% ацетонитрила, 2,5% трифторуксусной кислоты). Примечание: раствор Матрица может влиять на тело, если оно вдыхании или если он вступает в КонтаКТ с кожей. При подготовке или манипулирования решения рекомендуется персонал использовать вытяжной шкаф в дополнение к индивидуальной защиты.
4. Разрешить целевой пластина MALDI-TOF сушить на краю вытяжном шкафу, как описано выше. Убедитесь, однородная подготовка наполняет каждого из целевых мест на плите.

9. Место MALDI-TOF Целевая плиты в масс-спектрометр

1. Вставьте мишень MALDI-TOF в масс-спектрометра MALDI-TOF. Убедитесь, что пластина сидит на одном уровне с подпружиненных пластин. Примечание: не вставляйте мишень, пока все целевые места не станут сухими.
2. Убедитесь, что резиновое уплотнение чистый пух, пыль и волосы, чтобы требуемые условия вакуумные может быть создан.
3. Закройте этап крышку MALDI-TOF, а затем нажмите кнопку "в / из" на передней панели прибора. Крышка теперь будет блокировать и позволяют необходимости вакуум должен быть создан.

10. MALDI-TOF MS Spectra Приобретение

1. Откройте MALDI Биотипирование и программное обеспечение FlexControl.
2. В программном обеспечении Typing выбрать "новую классификацию" из выпадающего меню под названием "файл". Назовите проект и выберите "Новый". Выберите "Next", чтобы завершить установку в программном обеспечении Typing.
3. В окне программы управления идентифицировать на экране графический подставки цели. Выделите MALDI-TOF целевые места, которые используются, перемещая курсор привитых пятен, удерживая левую кнопку мыши.
4. Используйте правую кнопку мыши щелкните в любом месте на выбранных целевых позиций, а затем выберите "добавить аналитов" из выпадающего меню.
5. Добавить культуры идентификационных крови, чтобы "ИД" колонке для каждой из целевых мест и нажмите кнопку "Далее", когда завершена.
6. Выберите коммерческую "таксономии" Спектры базу данных и выберите "Далее". Примечание: Laboratories может использовать дополнительный в доме или коммерческих баз данных, чтобы увеличить количество эталонных спектров.
7. Нажмите "Finish" и MALDI-TOF MS начнется генерации спектров. Примечание: настройки MALDI-TOF были в соответствии с настройками изготовител (линейный положительном режиме, 60 Гц частоты лазера, напряжение 20 кВ ускорение, 16,7 IS2 напряжение кВ, 170 нс задержки экстракции, и 2,000-20,137 дальности м / з).
8. Если программное обеспечение MALDI управления не в состоянии генерировать пики, ручная приобретение спектров могут быть выполнены (метод не описан).

11. Сообщение Анализ Интерпретация MALDI-TOF MS Scores

1. После того, как спектры приобретаются и анализ завершен, нажмите кнопку "+" рядом с видовой идентификации на программное обеспечение Typing расширить список идентификационный для каждой цели.
2. Исследование 5 лучших идентификации, отметив, если топ-5 аналогичны. Дискордантные топ 5 родов с показателями ≥ 1,7 из той же целипятно поднял вопрос о возможности смешанных бульонов. Примечание: технология MALDI-TOF имеет плохую чувствительность для обнаружения смешанных бульонов. Например, когда бульон содержит смешанное видов высокий балл доверия могут быть идентифицированы в течение только одной из смешанных видов.
3. Когда оценка ≥ 2.0 отличается самой высокой матча на целевой точке, сообщают видов.
4. Когда высокий балл на целевом пятна ≥ 1,7, но <2,0, сообщают только роды. Если дополнительные критерии лучших 5 идентификаций согласованы, то представить видовом уровне.

12. Удаление MALDI-TOF Target плиты

1. Когда все спектры являются полными нажмите кнопку "вход / выход" на машине MALDI-TOF.
2. Откройте MALDI-TOF целевой пластины емкость и снимите мишень MALDI-TOF.
3. При использовании многоразовой MALDI-TOF мишень, чистые все целевые места, используя спирт и хранить MALDI-TOF пластину при комнатной температуре, когда он будет чистым и сухим.

Результаты

Сгенерированный MALDI-TOF MS спектры по сравнению с интегрированной справочной базы данных спектров. Логарифмическая оценка присваивается за доверие матча между тестовой изолята и справочную базу данных изолирует, с рекомендацией счетом ≥ 1,7, необходимых для возможного выявления до уров?...

Обсуждение

Важно при применении MALDI-TOF MS в культуральной жидкости крови, что шаги сообщение центрифугирования выполняются с достаточной осторожностью, чтобы не ремикс разделенных компонентов. Особенно важно, чтобы удалить культуры крови составляющие и клеточных белков человека, включая гемогло?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software