Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Resumo

A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.

Resumo

Um papel importante do laboratório de microbiologia clínica é proporcionar a rápida identificação de bactérias que causam infecção na corrente sanguínea. Identificação tradicional exige a sub-cultura do sinalizou caldo de cultura de sangue com a identificação disponível somente depois colônias em agar sólido amadureceram. MALDI-TOF MS é um método fiável, rápido para a identificação da maioria das bactérias clinicamente relevantes, quando aplicado para colónias em meios sólidos. A aplicação de MALDI-TOF MS diretamente ao caldo de cultura de sangue é uma abordagem atraente, pois tem potencial para acelerar a identificação de espécies de bactérias e melhorar a gestão clínica. No entanto, um problema importante para superar é a remoção de pré-análise de interferentes resinas, proteínas e hemoglobina contidos em amostras de cultura do sangue, que, se não for removido, interferem com os espectros de MS e pode resultar em pontuações suficientes ou baixos de identificação de discriminação. Além disso, é necessário concentrar a bactériaia para desenvolver espectros de qualidade suficiente. O método apresentado descreve a concentração, purificação e extração de bactérias Gram negativas que permitem a identificação precoce de bactérias a partir de um caldo de cultura de sangue sinalizado.

Introdução

Os pacientes com infecção de corrente sanguínea (BSI), devido a bactérias continuam a ter alta taxa de mortalidade intra-hospitalar, que vão 6-48% ^1. A entrega de antibiótico empírico adequado promove a sobrevivência e no subgrupo de pacientes com sepse grave, a cada hora de atraso para a terapêutica adequada se relaciona à diminuição da sobrevivência ^{de 2,3.} Assim, um objectivo-chave do laboratório clínico é detectar rapidamente, identificar e comunicar a presença de bactérias em hemoculturas para informar as decisões clínicas. Tem sido demonstrado que o laboratório microbiológico tem a maior influência sobre a terapia antimicrobiana no momento de relatar a coloração de Gram e ⁴ recentemente, um estudo de observação demonstraram que o tempo de dessorção a laser assistida por matriz / ionização de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) realizado diretamente em caldos de cultura de sangue influenciar a prescrição em mais de um terço da BSI causada por bactérias Gram negativas ^5.

O desenvolvimento comercial de MALDI-TOF MS levou a uma ferramenta de laboratório eficaz para a identificação de microrganismos ^6,7. A tecnologia está agora bem estabelecida e tem sido integrado em muitos laboratórios para a identificação rápida e precisa dos microorganismos isolados em ^6,8 meios sólidos. A aplicação direta de MALDI-TOF MS para hemocultura (BC) caldo que sinalizaram "positivo" para microorganismos apela para os clínicos e gestores de laboratório por causa do potencial para obter a identificação precoce de microorganismos com baixo custo.

A utilidade clínica da aplicação directa de MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue tem sido limitada pela ampla gama de sensibilidades observadas quando comparado com os métodos baseados cultura fenotípica padrão de identificação, com relatos de uma identificação bem sucedida de bactérias Gram-negativas variam 47-98,9 ^9-11%. A variação na sensibilidade provávelrelaciona-se com a composição BC caldo, a concentração bacteriana inicial, a variação dos métodos de preparação da amostra, bem como a gama de organismos gram-negativos encontrados em populações de estudo ^9. Em comparação com estes outros protocolos publicados pelo método aqui apresentado evita a utilização de etanol, cloreto de amónio ou (não-matriz) acetonitrilo adicional. Como resultado, o pellet bacteriano permanecerá viável (até o ponto de extração de proteínas) permitindo potenciais métodos de análise fenotípica de susceptibilidade para ser aplicado diretamente a estes organismos em caldo. Além disso, o método apresentado tem sido mostrado a ser barato, fiável e rápida, com a identificação de bactérias disponíveis dentro de 25 min dos resultados de cultura de sangue Gram mancha, com o mínimo 'mãos no tempo ^12.

Este método é um protocolo simples em casa spin-lise utilizando extração ácido fórmico aplicados diretamente para caldos de cultura de sangue positivos para identificar Gram negativo bacteria com tecnologia de MALDI-TOF MS.

Protocolo

1. Sangue Cultura Caldos Bandeira como "positiva"

1. Retire a garrafa de hemocultura sinalizou a partir do contínuo monitoramento do gabinete de incubação e coloque-o em uma cabine de segurança biológica. Nota: Os frascos podem conter microorganismos perigosos e precauções universais precisam ser seguidas. Devido ao risco de aerossóis infecciosos em amostragem, todos os procedimentos de amostragem deve ser realizada em um Biossegurança Classe II câmara de fluxo laminar.

2. Gram Stain é preparado

1. Prepare uma coloração de Gram do caldo de cultura de sangue sinalizada conforme protocolos institucionais locais. Nota: Quando organismos Gram negativos são identificados em microscopia o caldo de cultura do sangue é processada de acordo com o seguinte método. Quando os organismos Gram-positivas são identificadas, um método molecular alternativa visando a identificação genética e marcadores de resistência é aplicada ao caldo (não abordados neste artigo) ^13.

e "> 3. Transferência de Cultura de sangue sinalizadas Caldo de um tubo de separação do soro

1. Misture suavemente o frasco de cultura de sangue invertendo 2-3x.
2. Dentro da cabine de segurança biológica anexar uma seringa de 10 ml para um dispositivo de transferência de sangue de segurança.
3. Anexar o dispositivo de transferência de sangue para o frasco de cultura de sangue e retirar 5 ml de caldo dentro da seringa. Transferir o caldo BC aspirado para um tubo de separação de soro.

4. Concentração de Sangue cultura Caldo

1. Centrifuga-se o tubo de separação de soro a 1250 x g durante 15 min, que remove um grande volume de células vermelhas do sangue.
2. Aspirar e desprezar o sobrenadante utilizando uma pipeta de transferência estéril tendo o cuidado de deixar cerca de 1 ml de creme leucocitário imediatamente acima da interface gel / fluido. Nota: As garrafas aeróbias mostram uma clara separação das células vermelhas do sangue para o fundo do tubo com a interface gel / fluido aparecendo uma cor branca opaca. Em contraste, quandoaplicado ao caldo de cultura do sangue anaeróbio lítico a interface gel / fluido aparece como uma cor vermelho escuro, devido aos componentes de glóbulos vermelhos lisados ​​permanecendo suspensas no sobrenadante.

5. Repita os passos de lavagem Centrifugação

1. Agitar suavemente as últimas 1 ml de buffy coat fluido acima da interface de gel com uma pipeta estéril e então transferir todo o volume para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifuga-se o tubo de novo a 288 xg durante 30 seg.
2. Transferir o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml descartável de plástico de transferência para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL e rejeitar o tubo com o sedimento. Nota: É essencial nesta fase que seja tomado cuidado para evitar a transferência do sedimento. Isto é particularmente importante para um espécime a ser processado a partir da garrafa BC anaeróbico como o sobrenadante permanece pigmentado e o sedimento nem sempre é vista claramente.

6. Lise de células residuais

1. Centrifugar as amostras a 18.407 xg durante 1 min e, em seguida, aspirado (e descarte) do sobrenadante utilizando uma pipeta fina de transferência de ponta para deixar o mínimo de líquido residual quanto possível, sem perturbar o sedimento.
2. Ressuspender o sedimento residual em 1 ml de DNAse e RNAse estéril livre de água por pipetagem cima e para baixo. Nota: Alguns autores descreveram o uso de soluções de álcool em vez de água estéril para ressuspender o sedimento que torna as bactérias não-viáveis.
3. Centrifugar a solução ressuspensas a 18.407 xg durante 1 min.

7. Extração de Proteínas de Bactérias

1. Aspirar e desprezar o sobrenadante, novamente por meio de aspiração com uma pipeta de ponta fina assegurar que tanto líquido quanto possível seja removida.
2. Ressuspender o sedimento em 10 mL de ácido fórmico (70% v / v). Nota: O ácido fórmico pode afetar o corpo, se for inalado ou se entrar em contacto com a pele. Ao preparar ou manipular soluções é recommended que o pessoal usar um gabinete de fumo, além de equipamentos de proteção individual.
3. Misturar bem utilizando a pipeta para assegurar uma solução homogénea ressuspensas. Com a ponta da pipeta para perturbar fisicamente o sedimento pode ser necessário para assegurar uma solução mais homogénea.

8. Preparação de MALDI-TOF-alvo Placa

1. Inocular um prato limpo alvo de MALDI-TOF com 2 mL da suspensão preparada por local alvo. Prepare três sítios-alvo para cada amostra para superar o problema ocasional de não lê.
2. Permitir que a placa-alvo MALDI-TOF para secar. A taxa de secagem pode ser aumentada colocando o prato na extremidade do exaustor de fumos para maximizar o fluxo de ar ao longo da placa.
3. Overlay cada local seco com 1 ul da solução de matriz (10 mg / ml de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA), 50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético a 2,5%). Nota: solução de matriz pode afectar o corpo se inalada ou se entra em Contact com a pele. Ao preparar ou manipular soluções recomenda-se que o pessoal usar um gabinete de fumo, além de equipamentos de proteção individual.
4. Permitir que a placa alvo de MALDI-TOF para secar sobre a extremidade da câmara de exaustão tal como descrito acima. Certifique-se de uma preparação homogênea preenche cada um dos pontos de destino na placa.

9. Lugar MALDI-TOF-alvo Placa para o Espectrômetro de Massa

1. Insira a placa-alvo MALDI-TOF para espectrômetro de massa MALDI-TOF. Verifique se a placa está sentado nivelado com as placas de mola. Nota: não insira a placa alvo até que todos os pontos-alvo estão secos.
2. Verifique se a borracha de vedação está limpa de fiapos, poeira e cabelo para permitir que as condições de vácuo exigidas pode ser criado.
3. Feche a tampa fase MALDI-TOF e pressione o botão "in / out" na parte da frente do instrumento. A tampa agora irá bloquear e permitir que o vácuo necessário para ser criado.

10. MALDI-TOF MS Spectra Aquisição

1. Abra o MALDI Biotipagem e software FlexControl.
2. Dentro do software Typing selecione "nova classificação" no menu suspenso chamado "arquivo". Nomeie o projeto e em seguida, selecione "novo". Selecione "Next" para concluir a instalação do software de digitação.
3. Dentro da janela do software de Controle identificar o gráfico na tela da placa-alvo. Destaque os pontos-alvo MALDI-TOF que estão em uso, movendo o mouse sobre os pontos inoculados, mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse.
4. Use o botão direito do mouse para clicar em qualquer lugar nas posições de destino selecionadas e, em seguida, selecione "adicionar Analitos" a partir do menu suspenso.
5. Adicionar hemocultivos detalhes de identificação para a coluna "ID" para cada um dos pontos de destino e clique em "next" quando terminar.
6. Selecione a opção "taxonomia" banco de dados espectros comercial e selecione "Avançar". Nota: Labotórios pode utilizar adicional in-house ou bases de dados comerciais para aumentar o número de espectros de referência.
7. Clique em "Finish" e MALDI-TOF MS começará gerar espectros. Nota: As configurações de MALDI-TOF foram conforme as definições do fabricante (modo linear positivo, 60 freqüências de laser Hz, 20 kV de tensão de aceleração, 16,7 kV de tensão IS2, 170 ns de atraso extração e 2,000-20,137 faixa m / z).
8. Se o software de controlo de MALDI não permite gerar picos, aquisição manual dos espectros podem ser realizados (método não descrito).

11. Análise Pós Interpretação de MALDI-TOF MS Scores

1. Uma vez que os espectros são adquiridos e análise estiver concluída, selecione o botão "+" ao lado de identificação das espécies sobre o software de digitação para expandir a lista de identificação para cada alvo.
2. Estude os top 5 identificações, observando se o top 5 são semelhantes. Discordantes top 5 gêneros com pontuação ≥ 1,7 do mesmo alvolocal levantou a possibilidade de caldos mistos. Nota: tecnologia MALDI-TOF tem pouca sensibilidade para a detecção de caldos mistos. Por exemplo, quando um caldo contém espécies mista uma pontuação elevada confiança pode ser identificado por apenas uma das espécies mistas.
3. Quando uma pontuação ≥ 2,0 é anotado para o maior jogo em um local de destino, informar a espécie.
4. Quando a maior pontuação em um ponto alvo é ≥ 1,7, mas <2,0, informe apenas os gêneros. Se os critérios adicionais dos top 5 identificações são concordantes, em seguida, informar ao nível de espécie.

12. Remoção de MALDI-TOF-alvo Placa

1. Quando todos os espectros são de imprensa completo o botão "in / out" na máquina MALDI-TOF.
2. Abra o MALDI-TOF placa-alvo recipiente e retire a placa de alvo MALDI-TOF.
3. Se estiver usando uma placa-alvo MALDI-TOF reutilizável, limpar todos os pontos de destino usando álcool e armazenar a placa de MALDI-TOF na RT, uma vez que está limpa e seca.

Resultados

A MALDI-TOF MS espectros gerados são comparados com a base de dados de espectros de referência integrada. A pontuação logarítmica é atribuído pela confiança do jogo entre o isolado de teste eo banco de dados de referência isola, com a recomendação de uma pontuação ≥ 1.7 necessário para provável identificação ao nível de gêneros (Figura 1) e ≥ 2.0 para provável identificação de espécies (Figura 2). Comunicar ao nível de espécie, quando a pontuação ≥ 1,7 e...

Discussão

É importante quando se aplica MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue que as etapas de pós centrifugação são realizados com o cuidado suficiente para não remixar os componentes separados. É particularmente importante para remover os constituintes de culturas de sangue e as proteínas celulares humanas, incluindo a hemoglobina, o que pode produzir picos interferindo com o espectro de MALDI-TOF.

Embora MS fabrica recomendo cortar de pontuação ≥ 2,0 para as espécies e ≥ 1,7 p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software