זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

Summary

היישום של desorption זמן בסיוע מטריקס לייזר / יינון של טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה (MS) ישירות למרק תרבות דם מזרז את זיהוי של חיידקים. השיטה שהוצגה היא שיטה מהירה ואמינה לזיהוי של חיידקים גראם שליליים ישירות ממרק תרבות דם.

Abstract

תפקיד חשוב של המעבדה למיקרוביולוגיה הקלינית הוא לספק זיהוי מהיר של חיידקי גורמי זיהום דם. זיהוי מסורתי דורש תת התרבות של מרק תרבות הדם אותת עם זיהוי זמין רק לאחר שמושבות על אגר מוצק הבשילו. MALDI-TOF MS היא שיטה אמינה, מהירה לזיהוי של רוב החיידקים רלוונטיים מבחינה קלינית, כאשר חלים על מושבות על תקשורת מוצקה. היישום של MALDI-TOF MS ישירות למרק תרבית דם הוא גישה אטרקטיבית שכן יש פוטנציאל להאצת זיהוי מינים של חיידקים ולשפר את הניהול קליני. עם זאת, בעיה חשובה להתגבר היא ההסרה טרום הניתוח של רפים, חלבונים להתערב והמוגלובין הכלולים בדגימות דם שתרבות, אם לא יוסרו, להפריע לספקטרום MS ויכול לגרום לציון הזדהות אפליה בלתי מספיק או נמוך. בנוסף יש צורך להתרכז bacterIA לפתח ספקטרום באיכות מספקת. השיטה המוצגת מתארת ​​את הריכוז, טיהור, והפקה של חיידקים גראם שליליים המאפשרים זיהוי המוקדם של חיידקים ממרק תרבות הדם אותת.

Introduction

חולים עם זיהום דם (BSI) עקב חיידקים ימשיכו להיות גבוהה לתמותה בבית החולים, החל 6-48% ^1. המשלוח של אנטיביוטיקה אמפירית מתאימה מקדם הישרדות ובתת הקבוצה של חולים עם אלח דם חמור, כל עיכוב של שעה לטיפול מתאים בקורלציה לירידה בהישרדות ^2,3. בהתאם לכך, מטרה מרכזית של המעבדה הקלינית היא לזהות במהירות, לזהות ולתקשר את נוכחותם של חיידקים בתרביות דם להודיע ​​החלטות קליניות. זה כבר הוכיח כי יש לו את המעבדה למיקרוביולוגיה ההשפעה הגדולה ביותר על טיפול מיקרוביאלית בעת דיווח על כתם גראם ⁴ ולאחרונה, מחקר תצפיתי, הוכיח כי זמן desorption הלייזר בסיוע מטריקס / יינון של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF MS) מבוצע ישירות על מרקי תרבות הדם להשפיע על קביעת בלמעלה שלישית של BSI אחת נגרמים על ידי חיידקים גראם שליליים ^5.

"Jove_content"> הפיתוח המסחרי של MALDI-TOF MS הוביל לכלי מעבדה יעיל לזיהוי מיקרואורגניזמים ^6,7. טכנולוגיית החברה מבוססת היטב וכבר השתלבה במעבדות רבות לזיהוי מהיר ומדויק של מיקרואורגניזמים, הפרד, ^6,8 תקשורת המוצק. היישום הישיר של MALDI-TOF MS לתרבות דם מרק (BC) שסמן "חיובי" לערעורי מיקרואורגניזמים לשני הרופאים ומנהלי מעבדה בגלל הפוטנציאל להשיג זיהוי מוקדם של מיקרואורגניזמים בעלות נמוכה.

התועלת הקלינית של יישום הישיר של MALDI-TOF MS למרק תרבית הדם הייתה מוגבלת על ידי מגוון הרחב של רגישויות שנצפו בהשוואה לשיטות המבוססות על תרבות פנוטיפי סטנדרטית של הזדהות, עם דיווחים על זיהוי המוצלח של חיידקים גראם שליליים הנעים 47-98.9 % ^9-11. הווריאציה ברגישות סבירהמתייחס להרכב לפנה"ס המרק, ריכוז חיידקים ראשוני, הווריאציה בשיטות הכנת מדגם, כמו גם המערך של אורגניזמים שליליים גרם נתקלו באוכלוסיות מחקר ^9. לעומת פרוטוקולים שפורסמו אחרים אלה בשיטה שהוצגה כאן תמנע את השימוש באתנול, אמוניום כלוריד או אצטוניטריל נוסף (לא מטריצה). כתוצאה מכך גלולה החיידקים תישאר קיימא (עד לנקודה של מיצוי חלבון) המאפשרת לשיטות בדיקת רגישות פנוטיפי פוטנציאל להיות מיושמות ישירות לאורגניזמים אלה במרק. בנוסף, השיטה שהוצגה הוכח להיות זול, אמין ומהיר עם זיהוי חיידקים זמין בתוך 25 דקות של תוצאות כתם תרבות הדם גרם, עם מינימליות "ידיים על" זמן ^12.

שיטה זו היא פרוטוקול פשוט בתוך בית הספין תמוגה ניצול מיצוי חומצה פורמית מיושם ישירות למרקי תרבית דם חיוביים לזהות b השלילית גראםacteria עם טכנולוגית MALDI-TOF MS.

Protocol

1. דם תרבות Broths דגל כמו "חיובי"

1. הסר את בקבוק תרבית הדם אותת מארון הדגירה ניטור הרציף ולמקם אותו לתוך ארון בטיחות ביולוגי. הערה: בקבוקים יכולים להכיל מיקרואורגניזמים מסוכנים ואמצעי זהירות אוניברסלית צריכים להיות אחריו. בשל הסיכון של אירוסולים זיהומיות בדגימה, כל הליכי הדגימה חייבים להתבצע בזרימה למינרית בטיחות ביולוגית Class II.

2. גראם הכתם מוכן

1. הכן את כתם גראם ממרק תרבות הדם אותת לפי פרוטוקולים מוסדיים מקומיים. הערה: כאשר אורגניזמים שליליים גרם מזוהים על מיקרוסקופיה מרק תרבות דם מעובד לפי השיטה הבאה. כאשר אורגניזמים גראם חיוביים מזוהים, שיטה מולקולרית חלופית מיקוד זיהוי גנטי וסמני התנגדות מוחלת על המרק (לא התייחס במאמר זה) ^13.

דואר "> 3. העברת מסומנות דם תרבות מרק לTube הפרדת סרום

1. לערבב בעדינות את בקבוק תרבית דם על ידי היפוך 2-3x.
2. בתוך ארון הבטיחות הביולוגי לצרף מזרק 10 מיליליטר למכשיר העברת דם בטיחות.
3. לחבר את ההתקן להעברת דם לבקבוק תרבית דם ולסגת 5 מיליליטר של המרק לתוך המזרק. מעביר את המרק לפני הספירה aspirated לתוך צינור מפריד בסרום.

4. ריכוז של דם תרבות מרק

1. צנטריפוגות צינור הפרדת הסרום ב1,250 XG במשך 15 דקות אשר מסירה כמות גדולה של תאי דם אדומים.
2. לשאוב וזורקים supernatant באמצעות להיות זהיר, כדי להשאיר כ 1 מיליליטר של המעיל באפי מייד מעל ממשק ג'ל / נוזל טפטפת העברה סטרילי. הערה: הבקבוקים אירוביים להראות הפרדה ברורה של תאי דם אדומים לחלק התחתון של הצינור עם ממשק ג'ל / הנוזל המופיע בצבע לבן אטום. לעומת זאת, כאשרמוחל על מרק תרבות דם אנאירובי ממס ממשק ג'ל / הנוזל מופיע כצבע אדום עמוק בשל מרכיבי תא דם אדום lysed שנותרו תלויים בsupernatant.

5. חזור על צעדים לשטוף צנטריפוגה

1. בעדינות מערבב את 1 מיליליטר של נוזל שעבר מעיל באפי מעל ממשק ג'ל עם פיפטה סטרילית ולאחר מכן להעביר את כל הנפח לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. צנטריפוגות הצינור החדש ב288 XG במשך 30 שניות.
2. מעביר את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק חד פעמית 1 מיליליטר לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר וזורקים את הצינור עם גלולה. הערה: זה הוא קריטי בשלב זה שטיפול נלקח כדי למנוע את ההעברה של גלולה. זה חשוב במיוחד עבור דגימת מעובדת מהבקבוק לפני הספירה אנאירובי כsupernatant נשאר פיגמנט והגלולה היא לא תמיד נראית בבירור.

6. תמוגה של תאים שיורית

1. צנטריפוגה את הדגימה ב18,407 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשאוב (ונזרקתי) supernatant באמצעות פיפטה העברת קנס הטה לעזוב נוזל שיורי קטן ככל האפשר מבלי להפריע גלולה.
2. Resuspend את כדור שיורי ב 1 מיליליטר של DNAse סטרילי ומים חופשיים RNAse ידי pipetting למעלה ולמטה. שימו לב: מחברים אחדים תיארו את השימוש בפתרוני אלכוהול במקום של מים סטריליים כדי resuspend את הכדור אשר הופך את החיידקים שאינם בת קיימא.
3. צנטריפוגה פתרון resuspended ב18,407 XG דקות 1.

7. הפקה של חלבונים חיידקיים

1. לשאוב וזורקים supernatant, שוב באמצעות שאיפה עם טפטפת טיפ מצוין להבטיח כי הרבה נוזלים ככל האפשר מוסר.
2. Resuspend את הכדור ב10 חומצה פורמית μl (70% V / V). הערה: חומצה פורמית יכולה להשפיע על הגוף אם הוא בשאיפה, או אם הוא בא במגע עם עור. בעת הכנה או מניפולציה פתרונות זה recommended שצוות משתמש בארון קטר, בנוסף לציוד מגן אישי.
3. מערבבים היטב באמצעות פיפטה כדי להבטיח פתרון resuspended הומוגנית. באמצעות קצה פיפטה לשבש את גלולה פיזית עשוי להיות נחוץ כדי להבטיח פתרון הומוגני יותר.

8. הכנת MALDI-TOF פלייט היעד

1. לחסן צלחת יעד MALDI-TOF נקי עם 2 μl של ההשעיה מוכנה לכל נקודת יעד. הכן 3 אתרי יעד עבור כל דגימה כדי להתגבר על הבעיה מדי פעם נכשל קורא.
2. לאפשר את צלחת יעד MALDI-TOF לייבוש. קצב הייבוש יכול להיות מוגבר על ידי הצבת הצלחת על קצה מנדף על מנת למקסם את זרימת אוויר על פני הצלחת.
3. כיסוי כל נקודה מיובשת עם 1 μl של פתרון מטריקס (10 מ"ג / מיליליטר חומצת α-Cyano-4-hydroxycinnamic (HCCA), אצטוניטריל 50%, 2.5% חומצת trifluoroacetic). הערה: מטריקס פתרון יכול להשפיע על הגוף אם הוא בשאיפה, או אם הוא בא בcontact עם עור. בעת ההכנה או מניפולציה פתרונות מומלץ שצוות ישתמש ממשלת קטר, בנוסף לציוד מגן אישי.
4. לאפשר את צלחת יעד MALDI-TOF להתייבש על קצה ארון קטר כפי שתואר לעיל. ודא הכנה הומוגנית ממלאת כל אחת מנקודות היעד על הצלחת.

9. מקום MALDI-TOF פלייט היעד לספקטרומטר המסה

1. הכנס את צלחת יעד MALDI-TOF לתוך ספקטרומטר מסת MALDI-TOF. להבטיח את הצלחת יושבת מיושר עם צלחות קפיץ. הערה: אל תכניס את צלחת היעד עד שכל נקודות היעד הן יבשות.
2. להבטיח את חותמת הגומי נקיה של מוך, אבק ושיער כדי לאפשר יכולים להיווצר תנאי הוואקום הנדרשים.
3. סגור את המכסה שלב MALDI-TOF ולאחר מכן לחץ על הכפתור "כניסה / יציאה" על החלק הקדמי של המכשיר. המכסה תנעל עכשיו ולאפשר הוואקום הנחוץ כדי להיות שנוצר.

10. MALDI-TOF MS Spectra רכישה

1. פתח את Biotyping MALDI ותוכנת FlexControl.
2. בתוך תוכנת הקלדה בחר "סיווג חדש" מהתפריט הנפתח שכותרתו "קובץ". תן שם לפרויקט ולאחר מכן בחר "חדש". בחר "הבא" כדי להשלים את ההתקנה בתוך תוכנת הקלדה.
3. בתוך חלון תוכנת הבקרה לזהות הגרפי של צלחת היעד שעל מסך. הדגש את נקודות יעד MALDI-TOF הנמצאות בשימוש על ידי הזזת העכבר מעל הכתמים מחוסן, תוך כדי החזקת לחצן העכבר השמאלי.
4. להשתמש בלחצן הימני של העכבר כדי ללחוץ בכל מקום בעמדות היעד שנבחרו ולאחר מכן בחר באפשרות "להוסיף analytes" מהתפריט הנפתח.
5. הוספת פרטי זיהוי תרבית דם לעמודה "מזהה" לכל אחת מנקודות היעד ולחץ על "הבא" כאשר יושלמו.
6. בחר את מסד הנתונים המסחריים "טקסונומיה" ספקטרה ובחר "הבא". הערה: Laboratories עשוי לנצל נוסף בבית או מאגרי מידע מסחריים כדי להגדיל את המספר של ספקטרום התייחסות.
7. לחץ על "סיום" וMS MALDI-TOF יחל יצירת ספקטרום. הערה: הגדרות MALDI-TOF היו כמו לכל ההגדרות של הייצור (במצב ליניארי חיובי, 60 תדר לייזר הרץ, 20 מתח האצת KV, 16.7 מתח IS2 KV, 170 עיכוב חילוץ NSEC, ו2,000-20,137 טווח m / z).
8. אם תוכנת MALDI הבקרה לא מצליחה לייצר פסגות, רכישה ידנית של ספקטרום ניתן לבצע (שיטה אינה מתוארת).

11. פרשנות ניתוח הודעה של MALDI-TOF עשרות MS

1. ברגע שהספקטרום נרכש והניתוח הושלם, בחר בלחצן "+" לצד זיהוי מינים על תוכנת הקלדה כדי להרחיב את רשימת זיהוי לכל יעד.
2. ללמוד 5 הזדהויות העליונים, וציין אם 5 העליונים הם דומים. 5 סוגים העליונים צורמים עם ציוני ≥ 1.7 של אותו היעדהנקודה העלתה את האפשרות מעורב מרקים. שים לב: יש טכנולוגית MALDI-TOF רגישות עניים לגילוי מעורבים מרקים. לדוגמא, כאשר מרק מכיל מינים מעורבים ציון גבוה ביטחון יכול להיות מזוהה רק עבור אחד המינים המעורבים.
3. כאשר ≥ ציון 2.0 הוא ציין עבור ההתאמה הגבוהה ביותר בנקודת יעד, לדווח על המינים.
4. כאשר הציון הגבוה ביותר בנקודת יעד ≥ 1.7, אבל <2.0, לדווח על הסוגים בלבד. אם קריטריונים נוספים של 5 הזדהויות העליונים הם concordant, ולאחר מכן לדווח לרמת מין.

12. הסרת פלייט MALDI-TOF היעד

1. כאשר כל הספקטרום הוא עיתונות מלאה על הכפתור "כניסה / יציאה" במחשב MALDI-TOF.
2. פתח את קיבול צלחת יעד MALDI-TOF ולהסיר את צלחת יעד MALDI-TOF.
3. אם באמצעות צלחת לשימוש חוזר MALDI-TOF יעד, כל נקודות היעד נקיות באמצעות אלכוהול ולאחסן את צלחת MALDI-TOF ב RT פעם אחת שהוא נקי ויבש.

תוצאות

MALDI-TOF MS הספקטרום שנוצר הם בהשוואה למסד נתוני ההתייחסות המשולבת של ספקטרום. ציון לוגריתמים מוקצה לביטחון של המשחק בין בודד המבחן ואת מסד הנתונים ההתייחסות מבודדת, עם המלצת ≥ ציון 1.7 הנדרש לזיהוי סביר לרמת סוגים (איור 1) ו≥ 2.0 לזיהוי סביר למינים (איור 2).

Discussion

חשוב בעת החלת MALDI-TOF MS למרק תרבית דם שהצעדים שלאחר צנטריפוגה מבוצעים בזהירות מספקת לא לערבב את המרכיבים המופרדים. זה חשוב במיוחד כדי להסיר את מרכיבי תרבות דם וחלבונים תאיים אנושיים, כולל המוגלובין, אשר עשוי לייצר קוצים מפריעים לספקטרום MALDI-TOF.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer - Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software