Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Resumen

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Resumen

Interneuronas GABAérgicas inhibitorias juegan un papel central dentro de los circuitos neuronales del cerebro. Las interneuronas representan un pequeño subconjunto de la población neuronal (10-20%), pero muestran un alto nivel de heterogeneidad fisiológica, morfológica, y neuroquímicos, que refleja la diversidad de sus funciones. Por lo tanto, la investigación de las interneuronas ofrece importantes conocimientos sobre los principios de organización y funcionamiento de los circuitos neuronales. Esto, sin embargo, requiere un enfoque fisiológico y neuroanatómico integrado para la selección e identificación de tipos de interneuronas individuales. De células enteras de grabación de cortes de cerebro agudos de animales transgénicos, que expresan proteínas fluorescentes bajo los promotores de marcadores-interneuron específica de patch-clamp, proporciona un método eficiente para apuntar y caracterizar propiedades intrínsecas y sinápticas de tipos específicos interneuron electrofisiológicamente. Combinado con tinte de etiquetado intracelular, este enfoque se puede ampliar con mo post-hocanálisis rphological y inmunocitoquímica, que permite la identificación sistemática de las neuronas registradas. Estos métodos se pueden adaptar para adaptarse a una amplia gama de cuestiones científicas sobre las propiedades funcionales de los diversos tipos de neuronas corticales.

Introducción

Circuitos neuronales del hipocampo han sido durante mucho tiempo objeto de un intenso escrutinio, con respecto tanto a la anatomía y la fisiología, debido a su papel esencial en el aprendizaje y la memoria, así como la navegación espacial en los seres humanos y roedores. Igualmente, la organización laminar prominente, pero simple del hipocampo hace de esta región un tema favorito de estudios sobre las propiedades estructurales y funcionales de las redes corticales.

Circuitos del hipocampo se componen de células excitatorias principales (> 80%) y una más pequeña (10-20%), pero muy diversa cohorte de interneuronas inhibidoras ^1-3. Las interneuronas liberan ácido γ-aminobutírico (GABA) desde sus terminales de los axones que actúa en ionotrópicos rápido receptores GABA _A (GABA _A Rs) y los receptores de _GABAB metabotrópicos lentas (Rs GABA _B) ^4. Estos mecanismos inhibitorios se equilibran de excitación y regulan la excitabilidad de las células principales, y por lo tanto laIR temporización y el patrón de descarga. Sin embargo, liberado de interneuronas GABA actúa no sólo en las células principales, sino también en los propios ^5,6 interneuronas. Receptores pre y postsinápticos median la regulación por retroalimentación y las interacciones mutuas inhibitorias entre los diversos tipos de interneuronas. Estos mecanismos inhibitorios en las redes de interneuronas se cree que son fundamentales para la generación y conformación de los patrones de actividad de la población, en particular las oscilaciones a diferentes frecuencias ^7.

Grabación de patch-clamp de célula entera es un método bien establecido para el examen de las propiedades intrínsecas y las interacciones sinápticas de las neuronas. Sin embargo, debido a la gran diversidad de tipos de interneuronas, la investigación de las interneuronas inhibidoras requiere la identificación rigurosa de las células grabadas. Como los tipos de interneuronas del hipocampo se caracterizan por rasgos distintivos morfológicos y la expresión de marcadores neuroquímicos, anatómica combinada y inmunocitoquímica eXAMEN puede proporcionar un medio para determinar la identidad precisa ^6,8,9 interneuron.

En el presente trabajo se describe un enfoque experimental en el que su conjunto de células patch-clamp grabaciones de las neuronas individuales o pares sinápticamente acoplados se combinan con el etiquetado intracelular, seguido de post-hoc de análisis morfológico y inmunocitoquímica, lo que permite la caracterización de lenta GABA _B receptor mediada efectos inhibitorios en interneuronas identificados. A modo de ejemplo, nos centramos en uno de los principales tipos de interneuronas, un subconjunto de las llamadas "células cesto" (BC), que inerva el soma y dendritas proximales de sus metas post-sinápticas y se caracteriza por un "Rematar rápida" (FS) descargar patrón, un axón cubriendo densamente la capa de cuerpo de la célula, y la expresión de la proteína parvalbúmina de unión a calcio (PV) ^10,11. Estas interneuronas muestran grandes corrientes postsinápticas inhibitorias, así como pre prominentemodulación sináptica de su producción sináptica, en respuesta a la activación de GABA _B R ^12. La combinación de las técnicas descritas aquí se puede aplicar igualmente bien para investigar los mecanismos intrínsecos o sinápticas en una variedad de otros tipos de neuronas identificadas.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los procedimientos y de los animales de mantenimiento se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, la Ley Alemana de Bienestar Animal, el Consejo Europeo de la Directiva 86/609 / CEE relativa a la protección de los animales, y las directrices de las autoridades locales (Berlín, T-0215/11 )

1 Preparación de rebanadas de hipocampo aguda-

1. Tome una rata transgénica (17 a 24 días de edad), que expresa la proteína Venus / YFP fluorescente bajo el promotor VGAT, que las etiquetas de la mayoría de las interneuronas inhibitorias corticales ^13. Decapita a la rata. Rápidamente diseccionar el cerebro (<40 seg) en semicongelado, carbogenated (95% O _2/5% CO ₂₎ fluido a base de sacarosa artificial cefalorraquídeo (sacarosa-ACSF, Figura 1A).
2. Evaluar el cerebro de rata diseccionado para la fluorescencia Venus / YFP con una lámpara de 505 nm y filtro de emisión de 515 LED, montado en un par de gafas.
3. Retire la tercera frontal de la corteza y Cerebellum; a continuación, separar los hemisferios, todos con un bisturí. Retire la superficie dorsal de la corteza para proporcionar una superficie plana para pegar el cerebro hacia abajo, como se ha descrito previamente ^14.
4. Cortar rodajas transversales (300 m) de la formación del hipocampo en un vibratome, los hemisferios deben estar rodeados con semicongelado, carbogenated sacarosa-ACSF (Figura 1B) ^14. Retire regiones adicionales de rostral corteza, mesencéfalo y el tronco cerebral. Transferir cada rebanada a una cámara de retención sumergida ACSF que contiene sacarosa, que se carbogenated y se calentó a 35 ° C.
5. Deja las rebanadas de recuperar a 35 º C durante 30 minutos desde el momento de la última rebanada de entrar en la ACSF calentado. Haga esto con el fin de reactivar los procesos metabólicos y facilitar el resellado de los procesos neuronales cortadas. A continuación, traslado a la temperatura ambiente para el almacenamiento (Figura 1C).

2. Fabricación y Llenado de pipetas de registro

1. Pupipetas de parche ll de capilares de vidrio, de modo que se consigue una resistencia de la pipeta de 2-4 mW cuando se llena con filtrado (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 micras) solución intracelular contenía 0,1% de biocitina (para el etiquetado intracelular). Mantenga la solución intracelular enfriado en hielo para evitar la degradación de sus componentes.
2. Llenar pipetas de parche para la identificación de las corrientes postsinápticas con una solución que contiene un bajo Cl fisiológicamente relevante ^- concentración (E _{R (Cl)} = -61 mV; véase la lista de solución).
3. Para grabaciones pareadas para identificar las respuestas mediadas por el receptor presináptica, llenar pipetas de parche con solución intracelular con Ca ^{2 +} de la capacidad tampón de baja para evitar la interferencia con la liberación del transmisor presinápticamente, así como 4 veces mayor concentración de Cl ^- (E _{R (Cl)} = -20 mV) para mejorar la relación señal-ruido de IPSCs observados ⁵ que permiten una evaluación precisa de resp farmacológicaonsiveness. Tenga en cuenta que el cambio de concentración de Cl ^- puede alterar la cinética de IPSC ^15.

3. Whole Cell Patch-clamp grabación de FS-ins

1. Carbogenate la ACSF y se alimentan a través del sistema de perfusión a la cámara de grabación, por medio de una bomba peristáltica (que también elimina ACSF de la cámara de registro a través de una línea de succión, la Figura 2A). Encienda todos los equipos de la configuración en la preparación para la grabación.
2. Transferir una rebanada a la cámara de registro y mantenerlo en su lugar con un anillo de platino encadenan con fibras individuales de seda. Coloque la rebanada de modo que el estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente a través del campo de visión, permitiendo el acceso con 2 pipetas tanto a la str. radiatum y str. oriens simultáneamente (Figuras 2C y 4A).
3. Coloque la cámara en la configuración e iniciar la perfusión de carbogenated y caliente (32-34 º C) Una grabaciónCSF a un caudal de 5-10 ml / min.
4. Evaluar la calidad rebanada bajo la óptica DIC-IR a 40X aumento del objetivo, y visualizar con una cámara CCD se ve en una pantalla. Supongamos buena calidad rebanada si un gran número de células piramidales CA1, moderadamente contrastados redondos (CA1 PC) se puede ver en str. pyramidale a profundidades de 20-30 micras por debajo de una superficie lisa y ligeramente de cráteres (Figura 2C). Rebanadas de mala calidad contienen un gran número de muy contrastados, células reducidas o inflamadas, con una superficie de loncha desigual.
5. Identificar FS putativos interneuronas bajo iluminación de epifluorescencia que las que expresan Venus / YFP (Figura 2B), con gran somata multipolar en o cerca de la str. pyramidale. Seleccione las celdas razonablemente profundo dentro de la rebanada (50-100 m, Figura 2C) con el fin de preservar mejor su integridad morfológica.
6. Monte el electrodo de registro en el soporte de la pipeta en el cabezal de la platina; a continuación, la aplicaciónLY una presión positiva baja (20-30 mBar) a través de la línea de tubo. Bajar la pipeta a la superficie de la rodaja, ligeramente desplazada del centro de la neurona seleccionada.
7. Obtener configuración de la grabación de células enteras como se describió previamente ^14,16 y ver también las figuras 2D y 2E:
   1. Haz objetivo a una celda: Aumenta la presión a 70-80 mbar y bajar rápidamente la pipeta a través de la rebanada justo por encima del soma de la celda seleccionada (Figura 2D, arriba).
   2. Acércate a la célula: Pulse la pipeta contra la membrana de la célula para producir un "hoyuelo" en él (Figura 2D, arriba). Realice este paso con rapidez, a fin de evitar el etiquetado biocitina de las células vecinas.
   3. Crear un sello giga-ohm: Suelte la presión y al mismo tiempo aplicar un comando de 20 mV de tensión a la pipeta. Un sello de giga-ohm (1-50 GΩ; Figura 2D, abajo y la figura 2E medio) typicaliado se desarrolla rápidamente. Una vez sellados, aplicar el potencial de membrana en reposo esperado (típicamente entre -70 y -60 mV) como un comando de voltaje.
   4. Romper a través del parche: Una vez sellada, rompa el parche de membrana con un breve pulso de presión negativa; consiguiendo de esta manera la configuración de célula completa (Figura 2E, parte inferior).
8. Compensar la capacitancia de célula entera y resistencia en serie (R _S). R _s es normalmente 5-20 mW y estable durante un máximo de 120 min. Abandonar las células si el potencial de membrana (V _M) en caso de ruptura a través de más despolarizado que -50 mV; R _S es inicialmente mayor que 30 mW; o cambios R _S por más de 20% en el transcurso de la grabación.
9. Identificar FS-ins por su respuesta (en el modo de corriente-clamp) para una familia de hiper a despolarizante pulsos de corriente (-250 a 250 pA, Figura 2F, arriba). FS-ins relativamente han despolarizado V _M (normalmente -50 to -60 mV), la membrana corta constante de tiempo (<20 ms) y responder a un 500 pA despolarizante de inyección de corriente con un tren de potenciales de acción (AP) a frecuencias> 100 Hz ¹¹ (Figura 2F, parte inferior), que son notablemente diferentes a las de CA1 PC (Figura 2F, medio).

4. extracelular estimulación eléctrica para evocar respuestas mediadas por R GABA _B

1. Para observar las respuestas evocadas sinápticamente, colocar un electrodo de estimulación extracelular (un parche pipeta llena de NaCl 2 M; Resistencia: 0,1-0,3 mW) en el corte en la frontera de str. radiatum y str. -lacunosum moleculare. Coloque el electrodo de 200-300 micras lateral a la soma para prevenir la estimulación eléctrica directa de la célula y minimizar los artefactos de estimulación (figura 3A).
2. Una vez que el electrodo de estimulación se coloca, obtener la grabación de células enteras dela célula y elegido evaluar el fenotipo fisiológico en modo de corriente-clamp como en la sección 3.9 (Figura 3B).
3. Con la neurona registrada en de fijación de voltaje (V _M -65 mV), entregar la estimulación eléctrica de los axones presinápticos a 50 V (~ 500 μA estímulo eficaz) cada 20 segundos, utilizando un aislado estimulador de voltaje constante. Utilice solo los estímulos (100 microsegundos de duración, la figura 3C, la parte superior) para observar GABA _B R IPSCs mediadas, y intercalar con los trenes de múltiples estímulos (a 200 Hz) para producir una mayor liberación del transmisor.
4. Bath aplica ionotrópicos antagonistas de los receptores de glutamato (AMPA del receptor: DNQX [10 M]; receptor NMDA: d-AP5 [50 M]) para revelar el aislado monosináptico IPSC (Figura 3C, media alta). Además de aislar el IPSC mediada R GABA _B con la aplicación de un bloqueador de GABA _A R (gabazine [10 M]; Figura 3C l medioower).
5. Confirmar la resultante lenta corriente de salida (Figura 3C inferior, expandido) como se GABA _B R-mediada por la posterior aplicación de CGP-55845 [5 M] (Figura 3C inferior, sustentada en gris)

5. Emparejados Grabaciones de sinápticamente acoplados FS-IN y CA1 PCs

1. Evaluar el control presináptica mediada por R GABA _B de la transmisión sináptica inhibitoria con grabaciones simultáneas, realizadas entre sinápticamente acoplados pares IN y PC como se describe a continuación.
2. En primer lugar, establecer una grabación de células enteras de un interneuron presináptica (como en la sección 3) y confirmar el fenotipo FS (Figura 4A).
3. Entonces parchear un CA1 PC vecino (20-100 micras distancia, la figura 4A) y aplicar breve supraumbral despolarizante pulsos de corriente (1 ms de duración, 1-5 nA amplitud) a la presináptica IN (celebrada en modo de corriente-clamp) para obtener puntos de acceso. Si un co sinápticaConexion está presente, los puntos de acceso en el resultado IN en IPSCs en el PC CA1, que se celebró en el voltaje-clamp (compensar R _S hasta aproximadamente el 80%).
4. Si es necesario, llene un nuevo electrodo de registro y grabar desde otros PCs CA1 hasta que se encuentre una conexión.
5. Una vez que se establece una conexión, provocar pares de puntos de acceso en el presináptica FS-IN para evaluar tanto la respuesta sináptica unitaria y comportamiento dinámico. Utilice un típico protocolo de dos pulsos de 2 estímulos despolarizantes con un intervalo de 50 ms (Figura 4B).
6. Recoge los rastros de control en las condiciones de base. A continuación, aplicar los GABA _B baclofeno R agonista selectivo (10 m) para la perfusión ACSF, activando así Rs GABA _B, seguido por el antagonista CGP-55845 (5 M), para bloquear totalmente los efectos mediados por el receptor. Recoger ~ 50 trazas durante el estado estacionario de cada condición de medicamento (Figura 4B y C).
7. Una vez que la grabación haya terminado, sellar la membrana somática formando una outside-cabo parche: Lentamente retirar la pipeta desde el cuerpo celular en V-abrazadera y como los R _S aumenta, reducir el V _M a -40 mV. Haga esto para facilitar la formación del parche fuera de salida; a continuación, extraiga la pipeta de la bañera.

6. Análisis de las propiedades electrofisiológicas

1. NOTA: Una multitud de diferentes paquetes de software están disponibles para la adquisición de datos electrofisiológicos. Aquí, WinWCP, se utiliza un programa de Windows en el paquete gratuito Strathclyde Electrofisiología Software, que permite la grabación de hasta 16 canales de entrada analógica y la salida de 10 señales digitales.
2. Filtro de paso bajo de todos los datos a 5-10 kHz y muestra a 20 kHz.
3. Analizar los datos fisiológicos con un análisis conjunto off-line.
   NOTA: Stimfit, un paquete de software de fuente abierta, que incluye un terminal de Python, se utiliza en este caso; sin embargo otras alternativas pueden ser utilizadas fácilmente en su lugar.
   1. Analizar membrana pasiva propiedades de neuronas registradas, adquiridas en la pinza de corriente, de potencial de reposo de la membrana.
   2. Medir la media potencial de reposo de membrana de la línea de base de las respuestas registradas desde el comienzo de la grabación.
   3. Calcular la resistencia de entrada, utilizando la ley de Ohm, de la respuesta de tensión a los impulsos de corriente hiperpolarizantes más pequeños (≤ -50 Pa). Para mejorar la relación señal a ruido, múltiples trazas promedio. Nota: los ejemplos son típicamente promedios de 10 a 50 barridos individuales.
4. Estimar el tiempo de membrana constante aparente ajustando una curva monoexponencial a la decadencia de las respuestas a los más pequeños pulsos de corriente de hiperpolarización.
5. Analizar potencial de acción de forma de onda para determinar el umbral, la amplitud (umbral a pico) y la duración (anchura medida a media altura) provocada por nivel de umbral de despolarización impulsos de corriente.
6. Analizar GABA _B R IPSCs mediados de grabaciones de fijación de voltaje. Filtro traza fuera de línea en500 Hz (filtro Gaussiano) y evaluar la amplitud de pico y la latencia de la respuesta mediada por GABA _B R (en los promedios de al menos 10 restos).
7. Detectar el efecto de GABA _B Rs en la salida inhibitorio de SIN como un cambio en la amplitud de pico de las IPSCs mediadas-R GABA _A medidos entre el pico y la línea de base anterior. Calcular la amplitud media de ≥50 trazas para el período de control y el estado de equilibrio de todas las épocas farmacológicos.

7. Visualización e inmunocitoquímica de FS-Ins

1. A raíz de las grabaciones, fijar las rebanadas por inmersión en paraformaldehído al 4% con 0,1 M tampón fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C.
2. Si rebanadas necesarias pueden ser transferidos a PB y almacenarse hasta ~ 1 semana antes de procesar.
3. Lavar abundantemente en rodajas PB fresco y posteriormente en 0.025 M PB con 0,9% de NaCl (PBS, pH = 7,35).
4. Para reducir anticuerpo unión no específica, bloquear las rodajas de FOr 1 hora a RT en una solución que contiene 10% de suero normal de cabra (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un detergente para permeabilizar membranas) y 0,05% NaN _3, hecha en PBS.
5. Para etiquetar para la expresión PV, utilizar un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PV diluido en una solución que contiene 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN _3, en PBS. Incubar anticuerpos primarios durante 2-3 días a 4 ° C ^12. Enjuague rebanadas a fondo en PBS.
6. Aplicar anti-ratón secundaria de anticuerpos fluorescentes (por ejemplo Alexafluor-546.) Junto con la estreptavidina-proteína de unión a biotina, conjugado con un fluorocromo (por ejemplo, Alexafluor-647); y se incuban en una solución que contiene 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN _3, diluido en PBS e incubar O / N a 4 ° C.
7. Liberalmente enjuague rebanadas 2-3x con PBS seguidos por 2-3 enjuagues en PB. Montar las rebanadas en el portaobjetos de vidrio. Use un 300 micras agar espaciador para evitar el corte de colapsar. Rebanadas cubres con un fluomedio de montaje ciento y el sello con el clavo-barniz.

8. Imaging y Reconstrucción de Visualized FS-Ins

1. Visualice las rebanadas utilizando un microscopio confocal de barrido, con el reportero fluorochome emocionados con la línea de láser adecuado (diodo láser 635 nm para Alexafluor-647; Helio-Neón 543 nm para Alexafluor-546 etiquetado para PV y Argon 488 o 515 nm para Venus / YFP).
2. Tomar imágenes a una resolución apropiada Z-(típicamente 0,5-1 micras pasos, usando un objetivo 20X) para producir una pila Z de toda la célula. Múltiples pilas normalmente se requiere que toda la imagen de la célula, que puede ser cosida digitalmente fuera de línea utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A).
3. Reconstruir la celda de la pila de imágenes unidas utilizando un método de seguimiento semi-automático (simple plugin de Neurite Tracer en paquete de software FIJI / ImageJ ^17, Figura C).
4. Por último, evaluar la PV-inmunoreactividad de la interneuron con una lente de objetivo de alta apertura numérica (60X silicio-inmersión, NA = 1,3). Hacer imágenes del soma, dendritas proximales y axón proximal, o, alternativamente, de terminales de los axones si lavado somática de PV es demasiado fuerte. Las células se consideran inmunorreactivas para PV si inmuno-etiquetado se ve para alinearse con las estructuras Biocitina marcado (Figura 5B).

Resultados

A condición de que la calidad del corte es considerablemente buena, la grabación tanto de CA1 PC y FS-ins se puede conseguir con dificultad mínima. La línea de rata transgénica que expresa Venus / YFP bajo el promotor VGAT ¹³ no identifica inequívocamente FS-ins, o incluso chalecos. Sin embargo grabaciones del INS en los alrededores de str. pyramidale, donde la densidad de FS-ins es típicamente alta ^1, da como resultado una alta probabilidad de seleccionar FS-ins (Figura 2B)...

Discusión

Se describe un método que combina técnicas electrofisiológicas y neuroanatómicas para caracterizar funcionalmente neuronas morphologically- y neuroquímicamente identificados in vitro; en particular, los diversos tipos de INS inhibitorias corticales. Los aspectos clave del procedimiento son: (1) pre-selección de INS potenciales; (2) el registro intracelular y la visualización de las neuronas; y, finalmente, (3) el análisis morfológico y inmunocitoquímica de IEE registrados. Aunque este estudio se ha ocupado de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats	-	-	see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary	-	-
Dissection tools	i.e. FST	-	For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers	-	-	Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University	-	Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer	-	-	Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary	-
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer, Cambridge	DS-2A	-
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides	-	-	Any high quality brand
Glass coverslips	-	-	Usually 22 x 22 mm
Agar spacers	-	-	Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji	-	See Schindelin et al., 2012