Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

Резюме

Кортикальные сети контролируется небольшой, но разнообразный набор тормозных интернейронов. Функциональное исследование интернейронов поэтому требуется целенаправленное запись и строгий идентификацию. Описанный здесь является комбинированный подход с участием цельноклеточная записи из одной или синаптически-связанных пар нейронов с внутриклеточным маркировка, ретроспективный морфологический и иммуноцитохимического анализа.

Аннотация

ГАМКергические тормозных интернейронов играть центральную роль в нейронных цепях мозга. Интернейроны содержать небольшое подмножество нейронов населения (10-20%), но показать высокий уровень физиологической, морфологической и нейрохимические неоднородности, отражающие их разнообразные функции. Поэтому исследование интернейронов содержит важную информацию о принципах организации и функционирования нейронных цепей. Это, однако, требует комплексного физиологического и нейроанатомической подход к выбору и идентификации отдельных типов интернейронов. Весь-клеток патч-зажим записи с острыми срезах мозга трансгенных животных, экспрессирующих флуоресцентные белки по промоторов интернейронов-специфических маркеров, обеспечивает эффективный способ целевому и электрофизиологически характеризуют внутренние и синаптические свойства определенных типов интернейронов. В сочетании с маркировки внутриклеточного красителя, этот подход может быть расширен с пост-специальной месrphological и иммуноцитохимический анализ, что позволяет систематическое определение записанных нейронов. Эти методы могут быть адаптированы в соответствии широкий спектр научных вопросов, касающихся функциональных свойств различных типов нейронов коры.

Введение

Гиппокампа нейронов схемы уже давно предметом пристального внимания, как по отношению к анатомии и физиологии, в связи с их важной роли в процессах обучения и памяти, а также пространственной навигации у человека и грызунов. Равным образом, заметным, но просто ламинарного организация гиппокампа делает этот регион любимым предметом исследований, посвященных структурные и функциональные свойства коры сетей.

Гиппокампа схемы состоят из возбуждающих главных клеток (> 80%) и в меньшей (10-20%), но весьма разнообразной когорте тормозных интернейронов ^1-3. Интернейроны выпустить γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) от их аксонов, которая действует на быстро ионотропных рецепторов ГАМК _А (ГАМК RS) и медленные метаботропные ГАМК _B рецепторами (ГАМК _B RS) ^4. Эти ингибирующие механизмы противовеса возбуждение и регулируют возбудимость главных клеток, и, таким образомИК сроки и структура разряда. Тем не менее, ГАМК освобожден от интернейронов действует не только на главных клетках, но и на самих ^5,6 интернейронов. До и постсинаптические рецепторы обеспечивают регулирование обратной связи и ингибирующие взаимных взаимодействий между различными типами интернейрон. Эти ингибирующие механизмы интернейронных сетей, как полагают, центральное место в генерации и формирования паттернов активности населения, в частности колебаний на разных частотах ^7.

Цельноклеточная записи патч-зажим является хорошо признанным методом для исследования внутренних свойств и синаптических взаимодействий нейронов. Тем не менее, в связи с большим разнообразием типов интернейронов, исследование тормозных интернейронов требует строгого идентификации записанных клеток. Как гиппокампа типы интернейронов характеризуются различными морфологическими особенностями и нейрохимические экспрессии маркеров, в сочетании анатомических и иммуноцитохимического еxamination может служить средством для определения точного ^6,8,9 интернейрон, удостоверяющий личность.

В настоящей работе мы описываем экспериментальный подход, в котором цельноклеточные записи патч-зажим от отдельных нейронов или синаптически-связанных пар в сочетании с внутриклеточной маркировки, а затем после специальной морфологического и иммуногистохимического анализа, что позволяет для характеристики медленного ГАМК _B рецепторов опосредовано ингибирующие эффекты в определенных интернейронов. В качестве примера, мы ориентируемся на одного крупного типа интернейронов, подмножества так называемых «корзину клеток" (до нашей эры), который иннервирует сомы и проксимальных дендритов своих постсинаптических целей и характеризуется «быстрой пики" (FS) выполнять узор, аксон плотно закрывающую слой тела клеток и экспрессию белка парвальбумина кальция связывания (PV) ^10,11. Эти интернейронов отображения больших постсинаптические ингибирующие токов, а также заметную предварительносинаптической модуляция их синаптической выходе, в ответ на ГАМК _B R активации ^12. Сочетание методов, описанных здесь, могут быть применены в равной степени, чтобы исследовать внутренние механизмы или синаптические в различных других определенных типов нейронов.

протокол

О себе Этика: Все процедуры и животных обслуживание были выполнены в соответствии с ведомственным руководящим принципам, Закон немецкий Animal Welfare, директиву Европейского Совета 86/609 / EEC о защите животных, и руководящие принципы от местных властей (Берлин, T-0215/11 )

1 Подготовка Острый-срезов гиппокампа

1. Возьмите трансгенного крысу (с 17 по 24 день старый), выражая флуоресцентный Венера / YFP белок под vGAT промоутера, который маркирует большинство корковых тормозных интернейронов ^13. Обезглавить крысу. Быстро анализировать мозг (<40 сек) в semifrozen, carbogenated (95% O _2/5% CO ₂₎ на основе сахарозы искусственного спинномозговой жидкости (сахароза-ACSF, рис 1А).
2. Оценивать расчлененный мозг крысы для Венера / YFP флуоресценции с 505 нм LED лампы и 515 фильтр выбросов, установленного на пару очков.
3. Снимите фронтальную треть коры и CerebEllum; Затем отделить полушария, все с помощью скальпеля. Снимите спинной поверхности коры, чтобы обеспечить плоскую поверхность приклеить мозг вниз, как описано выше ^14.
4. Вырезать поперечных срезов (300 мкм) гиппокампа на vibratome, полушария должны быть окружены semifrozen, carbogenated сахароза-ACSF (Рисунок 1В) ^14. Удалить дополнительные регионы ростральной коры, среднего мозга и ствола мозга. Трансфер каждый ломтик в подводном удерживающей камере, содержащей сахарозу-ACSF, который carbogenated и нагревают до 35 °.
5. Оставьте ломтики восстановить при 35 ° С в течение 30 мин с момента последнего среза, поступающего в подогретое ACSF. Сделайте это для того, чтобы реактивировать обменные процессы и облегчить восковые колпачки из срезанных нейронных процессов. Затем передать комнатной температуре в течение хранения (рисунок 1С).

2 Изготовление и Заполнение Запись пипетки

1. PuLL патч-пипетки из стеклянных капилляров, так что сопротивление пипетки 2-4 МОм достигается при наполнении фильтровали (шприцевой фильтр, размер пор: 0,2 мкм) внутриклеточный раствор, содержащий 0,1% biocytin (для внутриклеточного маркировки). Держите внутриклеточный решение охлажденное на льду для предотвращения деградации его составляющих.
2. Заполните патч-пипетки для идентификации постсинаптических токов с раствором, содержащим физиологически соответствующую низкую концентрации Cl ^- (Е _{Р (Сl-)} = -61 мВ, см список раствор).
3. Для парные записи, чтобы определить пресинаптические рецепторы опосредованные ответы, заполните патч пипетки с внутриклеточной раствора с низкой Ca ^{2 +} буферной емкости, чтобы предотвратить вмешательство в высвобождения трансмиттера пресинаптически, а также 4 раза выше Cl ^- концентрация (E _{R (Cl-)} = -20 мВ), чтобы улучшить отношение сигнал-шум наблюдаемых ИПСК ⁵ позволяющих точно оценить фармакологической соответственноonsiveness. Заметим, что изменение Cl ^- концентрация может изменить IPSC кинетики ^15.

3 Всего сотовый патч-зажим Запись с FS-INS

1. Carbogenate в ACSF и корма через систему перфузии в камеру записи, с помощью перистальтического насоса (который также удаляет ACSF из камеры записи через линию всасывания, Фиг.2А). Включите все оборудование на установке для подготовки к записи.
2. Трансфер кусочек для записи камеры и удерживать на месте с платиновым кольцом, натянутой с отдельных волокон шелка. Расположите кусочек так, чтобы слой (ул.) Pyramidale АК1 работает вертикально через поле зрения, позволяя доступ с 2 пипеток как к ул. radiatum и ул. Ориенс одновременно (Цифры 2C и 4А).
3. Поместите камеру установки и начать перфузии carbogenated и нагревают (32-34 оС) записи AКСФ при скорости потока 5-10 мл / мин.
4. Оценка качества среза под ИК-ДИК оптики при 40-кратном увеличении объективного, и визуализировать с ПЗС-камерой увидеть на дисплее. Предположим, хорошее качество среза, если большое количество круглых, умеренно контрастных СА1 пирамидальных клеток (СА1 PC) можно увидеть в ул. pyramidale на глубине 20-30 мкм ниже гладкой и слегка кратерами поверхность (Рисунок 2C). Бедные ломтики качества содержат большое количество высококонтрастных, усохшие или опухшие клеток, с неровной поверхностью среза.
5. Определить предполагаемые FS интернейронов под эпифлуоресцентной освещения как те, которые выражают Венера / YFP (Рисунок 2B), с большим многополярного somata в или вблизи ул. pyramidale. Выделите ячейки разумно глубоко в срезе (50-100 мкм, рис 2С) для того, чтобы лучше сохранить их морфологический целостность.
6. Установите электрод записи в держатель пипетки на headstage; Затем приложениелы низкой, избыточное давление (20-30 мбар) через трубки линии. Опустить пипетки на поверхность среза, с небольшим смещением от центра выбранного нейрона.
7. Получить конфигурацию записи цельноклеточную, как описано выше ^14,16 и смотри также рис 2D и 2Е:
   1. Цель ячейку: Повысить давление до 70-80 мбар и быстро опустить пипетку через срез, чтобы чуть выше сомы от выбранной ячейки (Рисунок 2D, сверху).
   2. Подойдите к ячейке: Нажмите пипетку против клеточной мембраны, чтобы произвести "ямочка" на нем (Рисунок 2D, сверху). Выполните этот шаг быстро, с тем чтобы предотвратить biocytin маркировки соседних ячеек.
   3. Создать уплотнение гига-ом: Ослабить давление и одновременно применить команду 20 мВ напряжения для пипетки. Уплотнение гига-ом (1-50 ГОм; Рисунок 2D, снизу и фиг.2Е среднего) Typicсоюзником стремительно развивается. После запечатаны, применяются ожидаемого мембранный потенциал покоя (обычно между -70 и -60 мВ) в качестве команды напряжения.
   4. Перерыв через патч: После запечатаны, разрыв мембраны патч с коротким импульсом отрицательного давления; обеспечивая тем самым конфигурацию целой клетки (рис 2E, внизу).
8. Компенсировать цельноклеточную емкость и сопротивление серии (R _S). R _с, как правило, 5-20 МОм и стабильной до 120 мин. Отказаться от клетки, если мембранный потенциал (V _M) на прорыве более деполяризованная чем -50 мВ; R _S изначально больше, чем 30 МОм; или _Р С меняется более чем на 20% в течение записи.
9. Определить FS-INS по их реакции (в режиме ток-зажим) в семье гипер чтобы деполяризующими импульсы тока (-250 до +250 Па, рис 2F, вверху). FS-INS уже относительно деполяризованы V _M (обычно -50 то -60 мВ), короткие мембрана постоянная времени (<20 мс) и ответить на 500 Па деполяризующими подачу тока с поездом потенциалов действия (APS) на частотах> 100 Гц ¹¹ (Рисунок 2F, снизу), которые заметно отличаются от тех, в СА1 ПК (Рисунок 2F, средний).

4 Внеклеточная Электростимуляция вызвать ГАМК _B R-опосредованных ответов

1. Для наблюдения синаптически вызвали ответы, позиционировать внеклеточный стимуляции электрод (патч пипетка наполненная 2 М NaCl сопротивление: 0,1-0,3 МОм) в срезе на границе ул. radiatum и ул. lacunosum-moleculare. Расположите электрод 200-300 мкм сбоку от сомы, чтобы предотвратить прямой электрической стимуляции клетки и минимизировать стимуляции артефактов (Рисунок 3А).
2. После стимуляции электрод расположен, получить запись вся-клетоквыбранная ячейка и оценить физиологическое фенотип в режиме ток-зажим, как в разделе 3.9 (Рисунок 3В).
3. С нейрона, записанной в фиксации потенциала (V _M -65 мВ), поставить электрическую стимуляцию пресинаптических аксонов в 50 В (~ 500 мкА эффективным стимулом) каждые 20 сек, используя изолированную стимулятор постоянного напряжения. Используйте одну стимулы (100 мкс длительность, 3С, сверху), чтобы наблюдать ГАМК _B R опосредованных ИПСК, и чередовать с поездов нескольких раздражителей (при 200 Гц), чтобы произвести большее высвобождение передатчика.
4. Ванна применять ионотропных антагонистов рецептора глутамата (АМРА рецепторов: DNQX [10 мкМ]; рецептора NMDA: д-AP5 [50 мкМ]), чтобы выявить изолированный моносинаптического IPSC (3С, средний верхний). Далее изолировать ГАМК _B R-опосредованной IPSC с применением ГАМК R блокатора (gabazine [10 мкМ]; 3С среднего лАуэр).
5. Подтверждение полученного медленно наружу ток (Рисунок 3C ниже, расширен) как ГАМК _B R-посредничестве последующего нанесения CGP-55845 [5 мкМ] (3С ниже, залегает в серый)

5. Парные Записи синаптически Связанные FS-IN и CA1 ПК

1. Оценка ГАМК _B R-опосредованной пресинаптическое контроль тормозной синаптической передачи с одновременной регистрации, выполняемых между синаптически разобрана и ПК пар, как описано ниже.
2. Во-первых, создать запись цельноклеточную из пресинаптического интернейрон (как в разделе 3) и подтвердить FS фенотип (Рисунок 4а).
3. Тогда залатать соседнюю СА1 ПК (20-100 расстояния мкм, 4А) и применять краткий сверхпороговой деполяризующего импульсы тока (1 мсек продолжительность, 1-5 амплитудные Na) в пресинаптической IN (состоится в режиме ток-зажим), чтобы вызывать точки доступа. Если синаптической сотрудничествать соединение присутствует, точек доступа в результат в в ИПСК в СА1 ПК, состоявшейся в фиксации потенциала (компенсировать R _S примерно до 80%).
4. При необходимости заполнить новый электрод записи и запись из дальнейших ПК СА1, пока соединение не будет найден.
5. После того, как соединение установлено, вызывают пары точек доступа в пресинаптической FS-IN для оценки как унитарную синаптическую реакцию и динамическое поведение. Используйте стандартный протокол парных импульсов 2 деполяризующих стимулов с 50 мс интервала (Рисунок 4B).
6. Соберите управления следы в исходных условиях. Затем применять селективные ГАМК _B R агониста баклофен (10 мкм) с перфузии ACSF, таким образом, активации ГАМК _B Rs, после чего антагониста CGP-55845 (5 мкм), чтобы полностью блокировать опосредованную рецептором эффекты. Сбор ~ 50 следов в установившемся состоянии каждого условия наркотиков (фиг.4В и C).
7. После завершения записи, печать соматическую мембрану путем формирования outsidE-патч из: Медленно вывести пипетку из тела клетки в V-зажимом и как _S возрастает R, уменьшить V _М до -40 мВ. Сделайте это, чтобы способствовать формированию внешнего отъезда патча; затем снимите пипетки из ванны.

6 Анализ электрофизиологических свойств

1. ПРИМЕЧАНИЕ: множество различных пакетов программного обеспечения доступны для приобретения электрофизиологических данных. Здесь WinWCP, программа для Windows в состав бесплатного пакета Стратклайд электрофизиологии Software используется, который позволяет записывать до 16 каналов аналогового ввода и вывода 10 цифровых сигналов.
2. Фильтр низких частот все данные 5-10 кГц и образец при 20 кГц.
3. Анализ физиологических данных с ванной анализа офф-лайн.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Stimfit, пакет программного обеспечения с открытым исходным кодом, которая включает в себя оболочку Python, используемый в данном случае; Однако другие альтернативы может быть легко использован вместо.
   1. Анализ пассивный мембранный рСВОЙСТВА записанных нейронов, приобретенные в токовых клещей, от мембранный потенциал покоя.
   2. Измерение среднего мембранный потенциал покоя от базовой линии записанных ответов от начала записи.
   3. Рассчитать входное сопротивление, используя закон Ома, из ответа напряжения до мельчайших импульсов гиперполяризующих тока (≤ -50 Па). Для улучшения отношения сигнал-шум, средних нескольких следов. Примечание: наши примеры, как правило, в среднем 10-50 отдельных циклах.
4. Оцените кажущуюся время мембраны постоянного путем установки моноэкспоненциальное кривую к распаду ответов на самых маленьких импульсов гиперполяризующих тока.
5. Анализ потенциала действия сигнала для определения порога, амплитуду (порог до пика) и длительность (ширина измеренная на половине высоты), вызванную порогового уровня деполяризующей импульсы тока.
6. Анализ _ГАМКв R опосредованных ИПСК из зажима напряжения записей. Фильтр прослеживает офф-лайн в500 Гц (фильтр Гаусса) и оценить пиковую амплитуду и латентность ГАМК _B R опосредованной реакции (в среднем не менее 10 следов).
7. Обнаружение эффекта ГАМК _B рупий на ингибиторной выходе ИНС, изменения пиковой амплитуды ГАМК R-опосредованных ИПСК измеренных между пиком и предыдущей базовой линии. Рассчитать среднее амплитуду от ≥50 следов за период регулирования и стационарного всех фармакологических эпох.

7 Визуализация и Иммуноцитохимия ФС-Ins

1. После записи, исправить ломтики погружением в 4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере (PB, рН = 7,35) O / N при 4 ° С.
2. При необходимости ломтики могут быть переданы в ПБ и хранили в течение до ~ 1 недели перед обработкой.
3. Ломтики Вымойте либерально в свежем ПБ и впоследствии в 0,025 М PB с 0,9% NaCl (PBS, рН = 7,35).
4. Для снижения неспецифической связывания антитела, блокировать ломтики FOR 1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки (NGS), 0,3% Triton-X100 (моющее средство, чтобы проницаемыми мембранами) и 0,05% NaN _3, выполненный в PBS.
5. Чтобы пометить для выражения PV, использовать анти-PV Мышиные моноклональные антитела, разбавленного в растворе, содержащем 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN _3, в PBS. Инкубируйте первичных антител в течение 2-3 дней при 4 ° С ^12. Промыть срезы тщательно в PBS.
6. Применение флуоресцентные анти-мышиные вторичные антитела (например, AlexaFluor-546.) Вместе с биотин-связывающий белок стрептавидин, конъюгированный с флуорохромом (например, AlexaFluor-647); и инкубируют в растворе, содержащем 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN _3, разбавленного в PBS и инкубируют O / N при 4 ° С.
7. Обильно промойте кусочки 2-3 раза с PBS с последующим 2-3 полосканий в ПБ. Установите ломтики на стеклах. Используйте агар прокладку 300 мкм для предотвращения кусочек от коллапса. Обложка нескользящей ломтики с fluoresцент монтажа средних и печать с лаком-лаком.

8 изображений и Реконструкция визуализированных FS-Ins

1. Представьте ломтики с помощью сканирующей конфокальной микроскопии, с fluorochome репортера возбужденного с соответствующим лазерной линии (лазерного диода 635 нм для AlexaFluor-647; гелий-неоновый 543 нм для AlexaFluor-546 маркировки для PV и аргона 488 или 515 нм для Венеры / YFP).
2. Съемку на соответствующем Z-разрешением (как правило, 0,5-1 мкм с шагом, с использованием объектива 20х) с получением Z-стек всей клетки. Несколько стеки обычно требуется, чтобы изображение всю ячейку, которая может быть цифровой сшитые офф-лайн с использованием Фиджи / ImageJ программное обеспечение (фиг.5А).
3. Реконструировать ячейку из сшитого стека изображений с использованием метода полу-автоматического слежения (Простой плагин нейритов Tracer на Фиджи / ImageJ программного пакета ^17, Рисунок C).
4. Наконец, оценки PV-иммунореактивности в Interneuron с высокой числовой апертурой объектива (60X кремний-погружения, NA = 1,3). Сделайте образы сомы, проксимальных дендритов и проксимального аксон, или альтернативно из аксонов, если соматическое смыв PV является слишком сильным. Клетки считаются иммунореактивны для PV, если иммуно-маркировки видно, чтобы выровнять с biocytin меченных структур (Рисунок 5б).

Результаты

При условии, что качество ломтик заметно хорошее, записи из обоих CA1 ПК и FS-модули могут быть достигнуты с минимальными трудностями. Трансгенных крыс линии выражая Венера / YFP под vGAT промоутер ¹³ не однозначно идентифицировать FS-Ins, или действительно БЦ. Однако записи с КН в и вокруг

Обсуждение

Мы опишем метод, который сочетает электрофизиологические и нейроанатомической методы функционально охарактеризовать morphologically- и нейрохимически-выявленных нейронов в пробирке; в частности, различные виды корковых тормозных модулей. Ключевые аспекты процедуры являются: (1) предварите?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats			see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary
Dissection tools	i.e. FST		For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers			Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University		Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer			Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer Ltd.	DS-2A
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides			Any high quality brand
Glass coverslips			Usually 22 x 22 mm
Agar spacers			Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji		See Schindelin et al., 2012