Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

Resumo

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Resumo

GABAérgicos interneurónios inibitórios desempenham um papel central em circuitos neuronais do cérebro. Interneurônios compreendem um pequeno subconjunto da população neuronal (10-20%), mas mostram um alto nível de heterogeneidade fisiológica, morfológica e neuroquímica, refletindo suas diversas funções. Portanto, a investigação de interneurônios fornece importantes insights sobre os princípios de organização e função dos circuitos neuronais. Isso, no entanto, requer uma abordagem fisiológica e neuroanatomical integrada para a seleção e identificação dos tipos interneuron individuais. Whole-cell patch-clamp gravação de fatias cerebrais agudos de animais transgénicos, que expressam proteínas fluorescentes sob os promotores de marcadores específicos de Interneuron, fornece um método eficiente para alvejar e electrofisiologicamente caracterizar as propriedades intrínsecas e sinápticos dos tipos Interneuron específicos. Combinado com marcação com corante intracelular, esta abordagem pode ser estendida com post-hoc moanálise rphological e imunocitoquímica, permitindo a identificação sistemática dos neurônios registrados. Estes métodos podem ser adaptados para atender uma ampla gama de questões científicas a respeito propriedades funcionais de diversos tipos de neurônios corticais.

Introdução

Circuitos neuronais do hipocampo têm sido objecto de intenso escrutínio, no que diz respeito a ambos anatomia e fisiologia, devido ao seu papel essencial na aprendizagem e na memória, bem como navegação espacial em humanos e roedores. De igual modo, o proeminente, mas simples organização laminar do hipocampo torna esta região um objecto preferido de estudos sobre as propriedades estruturais e funcionais das redes corticais.

Circuitos do hipocampo são constituídos por células excitatórias principais (> 80%) e um menor (10-20%), mas coorte altamente diversificada de interneurónios inibitórios ^1-3. Interneurônios libertar ácido γ-aminobutírico (GABA) a partir dos seus terminais de axónios, que actua em receptores ionotrópicos rápido GABA _{A (GABAA} Rs) e receptores de GABA _B metabotrópicos lentas (Rs GABA _B) ^4. Estes mecanismos inibidores contrabalançar excitação e regular a excitabilidade de células principais, e, assim, otempo ir e padrão de descarga. No entanto, o GABA libertado interneurónios actua não só em células principais, mas também nos próprios ^5,6 interneurónios. Receptores pré e pós-sinápticos mediar regulação por feedback e interações mútuas inibitórios entre os vários tipos de interneuron. Estes mecanismos inibitórios em redes interneuron se acredita serem fundamentais para a geração e formação de padrões de atividade da população, em especial as oscilações em diferentes freqüências ^7.

De célula inteira gravação patch-clamp é um método bem estabelecido para o exame das propriedades intrínsecas e interações sinápticas de neurônios. No entanto, devido à grande diversidade de tipos de Interneuron, investigação de interneurónios inibitórios requer rigorosa identificação das células gravadas. Como tipos interneuron hipocampo são características distintas morfológicas e neuroquímicas expressão do marcador, anatômico combinado e imunocitoquímica eXAME pode fornecer um meio para determinar preciso ^6,8,9 identidade interneuron.

No presente trabalho, descrevemos uma abordagem experimental em que de célula inteira gravações de patch-clamp de neurônios individuais ou pares synaptically acoplados são combinados com rotulagem intracelular, seguido pelo post-hoc análise morfológica e imunocitoquímica, permitindo a caracterização de lento GABA _B mediada pelo receptor efeitos inibitórios em interneurónios identificados. Como exemplo, vamos nos concentrar em um tipo principal de interneuron, um subconjunto das chamadas "células cesta" (BC), que inerva o Soma e proximal dendritos de suas metas pós-sinápticos e é caracterizada por um "spiking rápido" (FS) descarregar padrão, um axónio densamente cobrindo a camada de corpo celular e a expressão da proteína de ligação a parvalbumina de cálcio (PV) ^10,11. Esses interneurônios exibir grandes correntes inibitórios pós-sinápticos, bem como pré destaquemodulação sináptica da sua saída sináptica, em resposta ao GABA _B R activação ^12. A combinação das técnicas aqui descritas podem ser aplicadas igualmente bem para investigar mecanismos intrínsecos ou sinápticas em uma variedade de outros tipos de neurónios identificados.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos e manutenção de animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais, a lei alemã Bem-Estar Animal, o Conselho Europeu a Directiva 86/609 / CEE do Conselho relativa à protecção dos animais, e as orientações das autoridades locais (Berlim, T-0215/11 )

1 Preparação de fatias Agudo-hipocampo

1. Tome um rato transgênico (17 a 24 dias de idade), expressando a proteína fluorescente Venus / YFP sob o promotor vGAT, que rotula a maioria dos interneurônios inibitórios corticais ^13. Decapitar os ratos. Dissecar o cérebro rapidamente (<40 segundos) em semifrozen, carbogenated (95% _{de O2} / 5% de CO ₂₎ à base de sacarose líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF-sacarose, Figura 1A).
2. Avaliar o cérebro de rato dissecado por Vénus / YFP fluorescência com uma lâmpada de 505 nm e um filtro de emissão de LED 515, montado sobre um par de óculos.
3. Remover o terceiro frontal do córtex e Cerebellum; em seguida, separar os hemisférios, todos com um bisturi. Retirar a superfície dorsal do córtex para proporcionar uma superfície plana para colar o cérebro para baixo, como previamente descrito ^14.
4. Cortar fatias transversais (300 um) da formação do hipocampo de um vibratome, os hemisférios deve ser cercado com semifrozen, carbogenated sacarose-ACSF (Figura 1B) ^14. Remover regiões adicionais de rostral do córtex, mesencéfalo e tronco cerebral. Transferir cada fatia de uma câmara de retenção submersos contendo sacarose-ACSF, que é carbogenated e aquecida a 35 ° C.
5. Deixe as fatias de recuperar a 35 ° C por 30 min a partir do momento da última fatia de entrar no ACSF aquecido. Faça isso a fim de reativar os processos metabólicos e facilitar a relacração de processos neuronais cortadas. Em seguida, a transferência para a temperatura ambiente durante o armazenamento (Figura 1C).

2 Fabricação e Enchimento de gravação pipetas

1. Pupipetas remendo ll de capilares de vidro, de modo que uma resistência de 2-4 mohms pipeta é conseguido quando cheio com filtrada (filtro de seringa, tamanho de poro: 0,2 um) uma solução intracelular contendo 0,1% de biocitina (para marcação intracelular). Manter a solução intracelular arrefecidas em gelo para evitar a degradação dos seus constituintes.
2. Encha pipetas remendo para identificação de correntes pós-sinápticos com uma solução contendo um baixo Cl fisiologicamente relevante ^- concentração (E _{R (Cl)} = -61 mV; ver lista solução).
3. Para gravações emparelhados para identificar as respostas mediadas pelo receptor pré-sináptico, preencha pipetas de patch com a solução intracelular com baixo Ca ^{2 +} capacidade tampão para evitar a interferência com a liberação do transmissor pré-sináptica, bem como quatro vezes maior Cl ^- concentração (E _{R (Cl)} = -20 mV) para melhorar a relação sinal-ruído de IPSCs observados ^5, permitindo a avaliação precisa de resp farmacológicoonsiveness. Note que a alteração Cl ^- concentração pode alterar a cinética da IPSC ^15.

3. Whole Cell Gravação patch-clamp de FS-ins

1. Carbogenate ACSF e alimentar através do sistema de perfusão à câmara de gravação, por meio de uma bomba peristáltica (que também remove o ACSF da câmara de registo através de uma linha de sucção, a Figura 2A). Ligue todos os equipamentos da instalação, em preparação para a gravação.
2. Transferir uma fatia para a câmara de gravação e fixe com um anel de platina amarrado com fibras individuais de seda. Posicionar a fatia de modo a que o estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente através do campo de visão, que permite o acesso com duas pipetas de tanto o str. radiatum e str. oriens simultaneamente (Figuras 2C e 4A).
3. Coloque a câmara para a instalação e começar a perfusão de carbogenated e aquecida (32-34 ° C) a gravação de umCSF a um caudal de 5-10 ml / min.
4. Avalie a qualidade fatia sob a ótica IR-DIC em 40X objetivo, e visualize com uma câmera CCD visualizado em um display. Assuma boa qualidade fatia se um grande número de células contrastadas, moderadamente piramidais CA1 redondas (CA1 PC) pode ser visto em str. pyramidale em profundidades de 20-30 mM abaixo uma superfície lisa e levemente crateras (Figura 2C). Fatias de má qualidade contêm um grande número de alto contraste, as células encolhidas ou inchados, com uma superfície de corte irregular.
5. Identificar FS putativos interneurônios sob iluminação de epifluorescência como aqueles que expressam Venus / YFP (Figura 2B), com grande somata multipolar dentro ou perto do str. pyramidale. Selecione as células razoavelmente profunda dentro da fatia (50-100 um, Figura 2C), a fim de melhor preservar a sua integridade morfológica.
6. Monte o eletrodo de registro no suporte da pipeta sobre a headstage; então apply uma baixa pressão, positivo (20-30 mbar) através da linha de tubos. Diminuir a pipeta para a superfície da fatia, ligeiramente deslocada para o centro do neurónio seleccionado.
7. Obter configuração de gravação de células inteiras, como descrito anteriormente ^14,16 e ver também Figuras 2D e 2E:
   1. Alvo de um celular: Aumenta a pressão para 70-80 mbar e reduzir rapidamente a pipeta através da fatia um pouco acima da soma da célula selecionada (Figura 2D, em cima).
   2. Aproxime-se da célula: Pressione a pipeta contra a membrana da célula para produzir uma "covinha" sobre ele (Figura 2D, em cima). Executar este passo rapidamente, a fim de evitar a rotulagem biocitina de células vizinhas.
   3. Criar um selo giga-ohm: Solte a pressão e, simultaneamente, aplicar um comando de tensão 20 mV para a pipeta. Um selo giga-ohm (1-50 GÊ; Figura 2D, fundo e figura 2E meio) Neossoloaliado desenvolve rapidamente. Uma vez selado, aplicar o potencial de repouso da membrana esperado (tipicamente entre -70 e -60 mV) como um comando de tensão.
   4. Romper o patch: Uma vez fechado, romper o remendo de membrana com um curto pulso de pressão negativa; conseguindo assim a configuração de célula inteira (Figura 2E, parte inferior).
8. Compensar capacitância de célula inteira e resistência em série (R _S). R _s é normalmente 5-20 mohms e estável por até 120 min. Abandonar as células se o potencial de membrana (V _M) em break-through é mais despolarizada que -50 mV; R _S é inicialmente maior do que 30 mohms; ou R _S alterações por mais de 20% ao longo da gravação.
9. Identificar FS-ins por sua resposta (no modo atual-clamp) para uma família de hiper a despolarização pulsos de corrente (-250 a +250 pA, figura 2F, em cima). FS-ins têm relativamente despolarizado V _M (tipicamente -50 to -60 mV), o curto tempo de membrana constante (<20 ms) e responder a uma 500 pA despolarizante de injecção de corrente, com um trem de potenciais de acção (AP) a frequências> 100 Hz ¹¹ (Figura 2F, fundo), que são marcadamente diferentes daqueles em PCs CA1 (Figura 2F, no meio).

4. Extracelular Estimulação Elétrica para evocar respostas GABA _B R-mediadas

1. Para observar as respostas synaptically evocados, posicionar um eletrodo extracelular estimulação (uma pipeta de patch cheio de 2 M NaCl; Resistance: 0,1-0,3 mohms) na fatia na fronteira de str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posicione o eletrodo de 200-300 mM lateral à soma para evitar a estimulação elétrica direta do celular e minimizar artefatos de estimulação (Figura 3A).
2. Uma vez que o eléctrodo de estimulação está posicionado, obter gravação de células inteiras dea célula e escolhido avaliar o fenótipo fisiológico no modo de corrente grampo como na secção 3.9 (Figura 3B).
3. Com o neurônio registrado em tensão-clamp (V _M -65 mV), entregar a estimulação elétrica de axônios pré-sinápticos a 50 V (~ 500 uA estímulo eficaz) a cada 20 segundos, utilizando um isolado de tensão constante estimulador. Use único estímulos (100 ms de duração, Figura 3C, em cima) para observar GABA _B R IPSCs mediadas, e intercalar com os trens de múltiplos estímulos (a 200 Hz) para produzir uma maior liberação do transmissor.
4. Banheira aplicar antagonistas dos receptores ionotrópicos do glutamato (receptores de AMPA: DNQX [10 mM]; receptor de NMDA: d-AP5 [50 uM]) para revelar o isolado monossináptico IPSC (Figura 3C, média superior). Além disso isolar o IPSC GABA _B R-mediada com a aplicação de um bloqueador de GABA _A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C meio lower).
5. Confirme a resultante slow-corrente para o exterior (Figura 3C inferior, expandido) como sendo GABA _B R-mediada pela posterior aplicação de CGP-55.845 [5 mM] (Figura 3C inferior, sustentada em cinza)

5. emparelhados Gravações de synaptically acopladas FS-IN e PCs CA1

1. Avaliar o controle pré-sináptica GABA _B R-mediada da transmissão sináptica inibitória com gravações simultâneas, realizadas entre synaptically-acoplados em pares e PC, conforme descrito abaixo.
2. Em primeiro lugar, estabelecer uma gravação de células inteiras de um interneuron pré-sináptico (como na seção 3) e confirmar o fenótipo FS (Figura 4A).
3. Então remendar um vizinho CA1 PC (20-100 distância um, Figura 4A) e aplicar breve suprathreshold despolarização pulsos de corrente (1 ms de duração, 1-5 nA amplitude) para a pré-sináptico IN (realizada em modo atual-clamp) para provocar APs. Se um co sinápticannection está presente, APs no resultado da IN em IPSCs no CA1 PC, realizado em tensão-clamp (compensar R _S a cerca de 80%).
4. Se necessário, preencher um novo eletrodo de registro e registro de novos PCs CA1 até que uma conexão é encontrada.
5. Uma vez que uma conexão é estabelecida, obter pares de APs na pré-sináptico FS-IN para avaliar tanto a resposta sináptica unitário e comportamento dinâmico. Usar um protocolo típico de dois estímulos despolarizantes emparelhado-pulso com um intervalo de 50 ms (Figura 4B).
6. Coletar vestígios de controle em condições basais. Em seguida, aplicam-se as de GABA _B baclofeno R agonistas selectivos (10 uM) para o ACSF de perfusão, activando assim Rs GABA _B, seguido por o antagonista CGP-55845 (5 uM), para bloquear completamente os efeitos mediados pelo receptor. Recolhe ~ 50 traços durante o estado estacionário para cada condição da droga (Figura 4B e C).
7. Uma vez que a gravação for concluída, selar a membrana somática, formando uma outside-out patch: Lentamente retirar a pipeta do corpo celular em V-clamp e como os R _S aumenta, reduzir a V _M a -40 mV. Fazê-lo para facilitar a formação do penso fora para fora; em seguida, retire a pipeta da banheira.

6 Análise de propriedades eletrofisiológicas

1. NOTA: Uma multidão de diferentes pacotes de software estão disponíveis para a aquisição de dados eletrofisiológicos. Aqui, WinWCP, um programa do Windows no pacote de Strathclyde Eletrofisiologia Software livre é usado, que permite a gravação de até 16 canais de entrada analógica e saída de 10 sinais digitais.
2. Filtro passa-baixa todos os dados 5-10 kHz e amostra a 20 kHz.
3. Analisar dados fisiológicos com uma suíte de análise off-line.
   NOTA: Stimfit, um pacote de software de fonte aberta, que inclui um shell Python, é usado neste caso; no entanto outras alternativas podem ser facilmente usados ​​em seu lugar.
   1. Analisar passiva membrana pROPRIEDADES de neurônios registrados, adquiridas em pinça de corrente, de potencial de repouso da membrana.
   2. Medir o potencial de membrana em repouso média da linha de base de respostas registados a partir do início da gravação.
   3. Calcule a resistência de entrada, usando a lei de Ohm, a partir da resposta de tensão para os mais pequenos pulsos de corrente hiperpolarizantes (≤ -50 PA). Para melhorar a relação sinal-ruído, vários traços médios. Nota: os exemplos são tipicamente médias de 10-50 varreduras individuais.
4. Estime o tempo membrana aparente constante ajustando uma curva monoexponencial para a decadência das respostas aos mais pequenos pulsos de corrente hiperpolarizantes.
5. Analisar potencial de ação de forma de onda para determinar o limiar, amplitude (limite de pico) e duração (largura medida a meia altura) provocada por nível de limiar de despolarização pulsos de corrente.
6. Analise GABA _B R IPSCs mediadas de gravações de fixação de tensão. Filtrar traça off-line em500 Hz (filtro de Gauss) e avaliar a amplitude do pico e latência da resposta mediada por GABA _B R (em médias de pelo menos 10 traços).
7. Detectar o efeito de Rs _GABAB na saída inibidora de Ins como uma alteração na amplitude de pico dos IPSCs GABA _A R-mediadas medidos entre pico e de linha de base anterior. Calcule a amplitude média de ≥50 vestígios para o período de controle eo estado de equilíbrio de todas as épocas farmacológicos.

7 Visualização e Imunocitoquímica de FS-Ins

1. Após as gravações, fixar as fatias por imersão em paraformaldeído a 4% com tampão fosfato 0,1 M (PB, pH = 7,35) S / N a 4 ° C.
2. Se fatias necessários podem ser transferidos para PB e armazenados durante ~ 1 semana antes da transformação.
3. Fatias Lavar abundantemente em PB fresco e, posteriormente, em 0.025 M PB com NaCl 0,9% (PBS, pH = 7,35).
4. Para reduzir o anticorpo não-específico de ligação, bloquear as fatias for 1 hora à temperatura ambiente numa solução contendo 10% de soro de cabra normal (NGS), 0,3% de Triton-X100 (um detergente para permeabilizar as membranas) e 0,05% de NaN _3, fez-se em PBS.
5. Para etiquetar para expressão PV, utilizar um anticorpo anti-PV monoclonal de ratinho diluído em uma solução contendo 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% NaN _3, em PBS. Incubar anticorpos primários durante 2-3 dias a 4 ° C ^12. Lavar cuidadosamente as fatias em PBS.
6. Aplicar anticorpos fluorescentes anti-ratinho secundário (por exemplo, AlexaFluor-546.) Juntamente com a biotina estreptavidina-proteína de ligação, conjugado com um fluorocromo (por exemplo, AlexaFluor-647); e incuba-se uma solução contendo 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN _3, diluído em PBS e incubar O / N a 4 ° C.
7. Liberalmente lavar fatias 2-3x com PBS, seguido por 2-3 lavagens em PB. Monte as fatias em lâminas de vidro. Usar um 300 um espaçador ágar para evitar o corte entre em colapso. Fatias Cover-derrapante com um FLUOREScento de montagem médio e vedação com unhas verniz.

8 Imagem e Reconstrução de Visualized FS-Ins

1. Visualize as fatias utilizando um microscópio confocal de varredura, com o repórter fluorochome animado com a linha de laser apropriado (laser de diodo 635 nm para AlexaFluor-647; Hélio-Neon 543 nm para AlexaFluor-546 rotulagem para PV e Argon 488 ou 515 nm para Venus / YFP).
2. Tome imagens numa resolução Z apropriado (tipicamente 0,5-1 uM passos, usando uma objectiva de 20X) para produzir uma-pilha Z de toda a célula. Múltiplas pilhas são normalmente necessários para a imagem de toda a célula, que pode ser digitalmente costurados fora da linha utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A).
3. Reconstruir a célula da pilha imagem montada utilizando um método de rastreamento semi-automática (plug-in simples Neurite Tracer no pacote de software FIJI / ImageJ ^17, Figura C).
4. Por fim, avaliar a PV-imunorreatividade do interneuron com uma lente objetiva de alta abertura numérica (60X silício-imersão, NA = 1.3). Fazer imagens da soma, dendritos proximais e axônio proximal, ou, alternativamente, de terminais do axônio se washout somática do PV é muito forte. As células são consideradas imunorreactivo para PV-se marcação imuno é visto para se alinhar com as estruturas marcadas com biocitina (Figura 5B).

Resultados

Desde que a qualidade é apreciável fatia boa, registrando tanto PCs CA1 e FS-ins podem ser alcançados com um mínimo de dificuldade. A linhagem de ratos transgênicos expressando Venus / YFP sob o promotor vGAT ¹³ não inequivocamente identificar FS-ins, ou de fato BCs. No entanto gravações de INs e em torno de str. piramidal, em que a densidade de FS-ins é tipicamente ^uma alta, resulta em um maior probabilidade de seleccionar FS-Ins (Figura 2B). FS-ins podem ser dis...

Discussão

Nós descrevemos um método que combina técnicas eletrofisiológicas e neuroanatômicas para caracterizar funcionalmente neurônios morphologically- e identificados neuroquimicamente in vitro; em especial, os diversos tipos de Ins inibitórios corticais. Os principais aspectos do processo são: (1) pré-seleção de potenciais INs; (2) gravação intracelular e visualização neurônio; e, finalmente, (3) análise morfológica e imunocitoquímica de Ins gravados. Embora este estudo dirigiu-ins PV, em particular, o prot...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats	-	-	see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary	-	-
Dissection tools	i.e. FST	-	For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers	-	-	Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University	-	Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer	-	-	Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary	-
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer, Cambridge	DS-2A	-
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides	-	-	Any high quality brand
Glass coverslips	-	-	Usually 22 x 22 mm
Agar spacers	-	-	Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji	-	See Schindelin et al., 2012