Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

要約

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。

要約

GABA作動性抑制性介在は、脳の神経回路内の中心的な役割を果たしている。介在ニューロンは、ニューロン集団（10〜20％）の小規模なサブセットを含みますが、その多様な機能を反映して、生理的、形態学的および神経化学的不均質性の高いレベルを示している。したがって、介在ニューロンの調査は、組織の原則と神経回路の機能に重要な洞察を提供しています。しかし、これは、個別の介在ニューロンの種類の選択と識別のための統合された生理学的および神経解剖学的アプローチが必要です。トランスジェニック動物の急性脳切片からの全細胞パッチクランプ記録、ニューロン特異的マーカーのプロモーターの下で蛍光タンパク質を発現し、標的とし、電気生理学的に、特定のニューロン型の内因性及びシナプスの特性を特徴付けるための効率的な方法を提供する。細胞内の色素の標識と組み合わせることで、このアプローチは、事後カ月で拡張することができますrphologicalおよび免疫細胞化学分析、記録されたニューロンの体系的な識別を可能にします。これらの方法は、皮質ニューロンの多様な種類の機能的特性に関する科学的問題の広い範囲に合うように調整することができる。

概要

海馬神経回路は、長い、それらの学習と記憶に重要な役割だけでなく、ヒトとげっ歯類の両方における空間ナビゲーションに、解剖学と生理学の両方に関して、厳しい調査の対象とされてきた。同様に、海馬の著名な、単純な層状の組織は、この領域の皮質ネットワークの構造的および機能的特性に取り組む研究の好ま対象になります。

海馬の回路は主要な興奮性細胞（> 80％）およびより小さな（10〜20％）が、抑制性介在^1-3の非常に多様な集団から構成されている。介在ニューロンは、その高速なイオンチャネル型のGABA _A受容体（GABA _Aルピー）で作用軸索の端末と低速メタボ_の GABA _B受容体（GABA _Bルピー）からγ-アミノ酪酸（GABA）を放出^4。これらの阻害のメカニズムは、励起を相殺し、主要な細胞の興奮性を調節するため、赤外線タイミング及び放電のパターン。しかし、介在ニューロンから放出されたGABAは、本人の細胞上ではなく、介在ニューロン自身^5,6のみならず機能します。前とシナプス後受容体が介在ニューロンの多様な種類の中フィードバック調節および抑制の相互作用を媒介する。介在ニューロンネットワークにおけるこれらの阻害メカニズムは、異なる周波数⁷における特定の振動で、集団活動パターンの生成および整形の中心であると考えられる。

全細胞パッチクランプ記録は、固有の性質とニューロンのシナプスの相互作用の検査のために十分に確立された方法である。しかし、介在ニューロンの種類の高度な多様性のために、抑制性介在の調査は、記録された細胞の厳密な識別を必要とします。海馬介在ニューロンタイプが明確な形態​​的特徴および神経化学的マーカー発現によって特徴付けられるように、解剖学的および免疫細胞化学のE組み合わせxaminationは、正確な介在ニューロンのアイデンティティ^6,8,9を決定するため^の手段を提供することができる。

本論文では、ゆっくりとGABA _Bの特徴付けを可能にする、単一のニューロンまたはシナプス結合のペアからホールセルパッチクランプ記録は事後形態学的および免疫細胞化学分析に続いて、細胞内の標識を組み合わせた実験的なアプローチについて説明します受容体は特定さ介在ニューロンにおける阻害効果を媒介する。一例として、私たちはそのシナプス後の標的の細胞体および近位樹状突起の神経支配と「速いスパイク」（FS）ことを特徴としている介在ニューロンの一つの主要なタイプ、いわゆる「籠細胞」（BC）のサブセット、に焦点を当てる放電パターン、密細胞体層を覆う軸索、およびカルシウム結合タンパク質のパルブアルブミン^{（PV）10,11}の発現。これらのニューロンは、大規模なシナプス後抑制電流だけでなく、著名な事前の表示GABA _B R活性化¹²に応答して、それらのシナプス出力のシナプス変調。ここで説明される技術の組み合わせは、他の同定されたニューロンタイプのさまざまな内因性またはシナプスのメカニズムを調査するためにも同様に適用することができる。

プロトコル

倫理に関する声明：すべての手順や動物のメンテナンスが動物の保護に関する制度的なガイドライン、ドイツの動物保護法、欧州理事会指令609分の86 / EECに基づいて実施し、地元当局からガイドライン（ベルリン、T-0215​​/11 ）

急性海馬スライスの調製

1. 皮質抑制性介在¹³の大部分をラベルVGATプロモーター下に蛍光ヴィーナス/ YFPタンパク質を発現するトランスジェニックラット（17から24日齢）を取る。ラットを首を切る。急速semifrozen、carbogenated（95％O _{2/5％CO 2）}のスクロースベースの人工脳脊髄液（スクロースACSF、 図1A）に脳（<40秒）を解剖。
2. ゴーグルに搭載された、505nmのLEDランプ515発光フィルターで金星/ YFP蛍光のために解剖したラットの脳を評価する。
3. 皮質の前頭三分の一を取り外し、勉強家エルム;すべてメスで、半球を分離する。以前に^14を説明したように、脳を下に接着する平坦な表面を提供するために、皮質の背側表面を削除します^。
4. ビブラトーム上の海馬体の横方向のスライス（300μm）をカットし、半球がsemifrozenで囲む必要があり、ショ糖ACSF（ 図^1B）14 carbogenated。吻側大脳皮質、中脳および脳幹の追加の領域を削除します。 carbogenated 35ºCに温め、スクロースACSFを含む浸水保持チャンバーに各スライスを転送します。
5. 温めACSFに入る最後のスライス時から30分間、35ºCで回復するのスライスにしておきます。代謝プロセスを再活性化し、カット神経突起の再シールを容易にするためにこれを行います。そこで、ストレージ（ 図1C）を、室温に転送。

2の作製と記録ピペットの充填

1. PuのガラスキャピラリーからのLLパッチピペットを濾過（シリンジフィルター、孔径0.2μmの）を充填した際に2-4MΩのピペット抵抗が達成されるように、（細胞内標識化のための）0.1％ビオシチンを含む細胞内液を。その成分の劣化を防止するために氷上で冷却細胞内液を保管してください。
2. 濃度（;ソリューションのリストを参照してくださいE _{R（のCl - ）=} -61 mVの） ^-生理学的に関連の低いのClを含有する溶液とシナプス後電流を識別するためのパッチピペットを埋める。
3. 濃度（E _{R（のCl - ）=} ^-ペアの録音は、シナプス前受容体媒介応答を識別するために、低カルシウム^{2 +}バッファシナプス前伝達物質の放出との干渉を防止するための能力だけでなく、4倍高いClでなどを有する細胞内液とパッチピペットを埋める-20 mV）は、信号対雑音薬理RESPの正確な評価を可能に観測されたのIPSC ⁵のを改善するためにonsiveness。濃度IPSC動態^15を変化させることができる^-のClの変更があることに注意してください。

FS-INSから3。全細胞パッチクランプ記録

1. ACSFをCarbogenateと（また、吸引ライン、 図2Aを介して、記録室からACSFを除去する）蠕動ポンプを用いて、記録チャンバーに灌流システムフィードスルー。レコーディングに備えてセットアップ上のすべての機器の電源をオンにします。
2. 録音室にスライスを移し、絹の単繊維を張ったプラチナリングで所定の位置に保持する。ポジションスライスCA1の地層（文字列）錐体の両方STRに2ピペットでアクセスを許可する、視野を垂直に実行されるようにします。放線とstr。同時にオリエンス （ 図2Cおよび4A）。
3. セットアップ中に室を配置し、carbogenatedの灌流を開始し、温めた（32〜34℃）記録A5〜10ミリリットル/分の流速でCSF。
4. 40倍対物倍率におけるIR-DIC光学の下でスライス品質を評価し、ディスプレイ上で見CCDカメラで可視化する。ラウンド、適度に対比さCA1錐体細胞（CA1のPC）が多数STRで見ることができても、適切なスライスの品質を前提としています。軽く滑らかでクレーター表面下20〜30ミクロン（ 図2C）の深さで錐体 。質の悪いスライスは、不均一なスライス面で、非常に対照的で、縮小または膨張した多数の細胞が含まれています。
5. str内または近くには、大多細胞体を持つヴィーナス/ YFP（ 図2B）を発現するものとして落射照明下での推定のFS介在ニューロンを識別します。錐体 。より自分の形態学的整合性を維持するために、合理的に深いスライス内の細胞（50〜100ミクロン、 図2C）を選択します。
6. ヘッドステージ上のピペットホルダーに記録電極をマウント。その後アプリLYチューブラインを介して、低、正圧（20〜30ミリバール）。スライスの表面にピペットを下げ、わずかに選択されたニューロンの中心にオフセット。
7. 以前に^14,16説明したようにホールセル記録の設定を取得し、参照することも2Dおよび2Eフィギュア ：
   1. 標的細胞：70〜80ミリバールに圧力を増やし、急速にちょうど選択したセル（ 図2D、上）の細胞体上のスライスを通してピペットを下げる。
   2. セルアプローチ（ 図2D、上）、その上に「ディンプル」を生成するために、細胞膜に対してピペットを押します。隣接セルのビオサイチンラベリングを防ぐために、迅速にこの手順を実行します。
   3. ギガオームシールを作成します。圧力を解放すると同時に、ピペットに20 mVの電圧指令を適用します。ギガオームシール（1-50GΩ; 図2D、底面および図2E中央）typic同盟国は急速に開発しています。いったん密封され、電圧指令として（通常は-70と-60 mVの間）に予想される静止膜電位を印加する。
   4. パッチを突破：密閉されると、負圧の短いパルスで膜パッチを破裂。それによって、全細胞構成（ 図2E、ボトム）を達成。
8. 細胞全体のキャパシタンスと直列抵抗（R _S）を補償する。 R _sは 、通常、最大120分間5-20MΩと安定している。ブレイクスルー上の膜電位（V _M）が -50 mVのより脱分極であれば細胞を放棄。 R _Sが 30MΩより、最初は大きい。またはR _Sは、記録の経過にわたって20％以上変化する。
9. 電流パルス（-250 250 Paで、 図2F、上）脱分極にハイパーファミリーに（電流クランプモードの場合）、その応答によってFS-INSを特定します。 FS-INSは、比較的V _M（通常は-50トンを脱分極しているO -60 mVの）、短い膜時定数（<20ミリ秒）と500 PAが周波数で活動電位（AP）を列に電流注入を脱分極に応答する>顕著である100Hzの^11（ 図2F、下）、 CA1のPC（ 図2F、中央）とは異なる。

GABA _B R媒介性応答を誘発する4。細胞外電気刺激

1. strの境界にスライスにおける：;シナプス誘発反応を観察するためには、細胞外の刺激電極（0.1〜0.3MΩ抵抗2のNaClを充填したパッチピペット）を配置します。放線とstr。 lacunosum-moleculareは刺激アーティファクト（ 図3A）、細胞を直接電気刺激を防ぎ、最小限にするために細胞体に電極200〜300ミクロンの横方向の位置を調整します。
2. 刺激電極が配置されると、のホールセル記録を得る選択したセルとセクション3.9（ 図3B）のように電流固定モードでの生理的な表現型を評価する。
3. 電圧クランプ（V _M -65 mVの）に記録ニューロンでは、孤立した定電圧刺激装置を使用して、50 V（〜500μA効果的な刺激）毎週20秒シナプス前軸索の電気刺激を提供します。 GABA _B R仲介性IPSCを観察して、より大きな伝達物質の放出を生成するために複数の刺激（200 Hzで）の列車をインターリーブする単一の刺激（100μ秒の期間、 図3C、トップ）を使用します。
4. 孤立した単シナプスIPSC（ 図3C、ミドルアッパーを）明らかにする：;：バスはイオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬（D-AP5 [50μM] NMDA受容体DNQX [10μM] AMPA受容体）を適用。さらに、GABA _A Rブロッカーの適用とGABA _B R媒介IPSCを隔離（gabazine [10μM]; 図3CミドルLワー）。
5. GABA _B（灰色でunderlain 図3C低い）CGP-55845 [5μm]とのその後の適用によりR媒介されているものとして、得られたスロー外向き電流（下図3C、拡張した）を確認

FS-INとCA1のPC結合シナプスの5ペア録音

1. 以下に説明するようにシナプス結合のINとPCのペアの間で行われる同時録画、と抑制性シナプス伝達のGABA _B R媒介シナプス前制御を評価する。
2. まず、（セクション3のように）シナプス前ニューロンの細胞全体の記録を確立し、FS表現型（ 図4A）を確認。
3. その後、近隣のCA1、PC（20〜100ミクロンの距離、 図4A）をパッチを適用し、APを引き出すために（電流クランプモードで開催された）シナプス前INに電流パルスを脱分極簡単な閾値上（1ミリ秒の継続時間、1-5 nAの振幅）を適用。シナプスの共同の場合nnection（約80％の_R、Sを補償）電圧クランプで開催され、CA1 PC内のIPSCのIN結果のAPが存在する。
4. 必要に応じて、接続が見つかるまで、さらにCA1パソコンから新しい記録電極と記録を埋める。
5. 接続が確立されると、単一のシナプス応答と動的挙動の両方を評価するために、シナプス前FS-INでのAPの対を誘発する。 50ミリ秒間隔（ 図4B）で2脱分極刺激の典型的なペアのパルスプロトコルを使用してください。
6. ベースライン条件の制御トレースを収集します。そして、このように完全に受容体媒介効果をブロックするために、アンタゴニストCGP-55845（5μM）に続いて_の GABA _B Rsは、活性化、灌流ACSFに対して選択的なGABA _B Rアゴニストのバクロフェン（10μM）を適用。各薬物の状態（ 図4BおよびC）の定常状態時に〜50トレースを収集します。
7. 記録が完了すると、outsidを形成することにより体細胞膜をシール電子アウトパッチ：ゆっくりVクランプに細胞体からピペットを撤回とR _Sの増加に伴い、mVの-40 V _​​Mを減らす。アウトサイドアウトパッチの形成を促進するために、これを行います。その後浴からピペットを取り外します。

電気生理学的特性の解析6。

1. 注：別のソフトウェアパッケージの群衆は電気生理学的データの取得のために用意されています。ここで、WinWCPは、無料のストラスクライド電気生理学ソフトウェア·パッケージ内のWindowsプログラムは、最大16のアナログ入力チャンネルの記録と10のデジタル信号の出力を可能にする、使用されている。
2. ローパスフィルタ20 kHzで、すべての5〜10 kHzでのデータとサンプル。
3. オフライン分析スイートとの生理学的データを分析します。
   注：Stimfit、Pythonのシェルを含むオープンソースソフトウェア·パッケージは、このインスタンスで使用されている。しかし、他の選択肢を容易代わりに使用することができる。
   1. 受動膜pを分析記録されたニューロンのroperties、静止膜電位から、電流クランプで取得された。
   2. 記録の最初から記録された応答のベースラインからの平均静止膜電位を測定します。
   3. 最小の過分極電流パルス（≤-50 pA）で、電圧応答から、オームの法則を使用して、入力抵抗を計算します。信号対雑音比、平均複数のトレースに信号を改善する。注：私たちの例では、一般的に10〜50の個別の掃引の平均である。
4. 最小の過分極電流パルスに対する応答の減衰に次指数曲線を当てはめることによって見かけ上の膜時定数を推定します。
5. しきい値を決定するために、活動電位波形、電流パルス脱分極の閾値レベルによって誘発された振幅（ピーク閾値）と期間（ハーフ高さで測定された幅）を分析します。
6. 電圧クランプ記録からGABA _B R仲介性IPSCを分析します。フィルタートレースオフラインで500ヘルツ（ガウシアンフィルタ）と、（少なくとも10のトレースの平均）でGABA _B R媒介性応答のピーク振幅と遅延を評価する。
7. ピークと前のベースラインとの間で測定GABA _A R媒介性IPSCのピーク振幅の変化としてINSの抑制出力にGABA _B Rs _の影響を検出します。制御周期のため≥50トレースから平均振幅とすべての薬理学エポックの定常状態を計算します。

FSインの7。可視化と免疫細胞化学

1. 記録後、4℃で0.1 Mリン酸バッファー（PB、pHは= 7.35）O / Nで4％パラホルムアルデヒドに浸漬してスライスを固定します。
2. 必要なスライスは、PBに移し、加工前〜1週間まで保存することができる場合。
3. 自由に新鮮なPB中、続いて0.9％NaClで0.025 M PB中ウォッシュスライス（PBS、pH値= 7.35）。
4. 非特異的抗体結合を低減するために、foのスライスをブロック10％正常ヤギ血清（NGS）を含有する溶液中で、室温でrは1時間、0.3％トリトン-X100（膜を透過するための界面活性剤）および0.05％のNaN _3、PBS中で作製。
5. PBS中で、NaN _3を 5％NGS、0.3％のTriton-X100、0.05％を含有する溶液中で希釈した抗-PVモノクローナルマウス抗体を使用して、PV発現のために標識する。 ^4℃12で2〜3日間、一次抗体をインキュベートする。 PBS中で徹底的にスライスをすすぐ。
6. 蛍光抗マウス二次抗体を適用します（ 例：アレクサ-546。）ビオチン結合タンパク質ストレプトアビジンと一緒に、蛍光色素にコンジュゲート（ 例えば 、アレクサ-647）;そしてPBS中に希釈し、3％NGS、0.1％トリトン-X100、0.05％のNaN _3を含有する溶液中でインキュベートし、4℃でO / Nインキュベートする。
7. たっぷりPB中2-3リンスに続いてPBSでスライス2〜3倍をすすぐ。スライドガラス上のスライスをマウントします。崩壊のスライスを防止するために、300μmの寒天スペーサーを使用してください。性蛍光物質で覆いスリップスライスネイルワニスセント封入とシール。

8。イメージングと可視化の再構築FSイン

1. /金星のためのPVのためのアレクサ-546標識およびアルゴン488または515nmのためのヘリウムネオン543 nmの、適切なレーザライン（アレクサ-647用のダイオードレーザー635nmので励起fluorochomeレポーターで、走査型共焦点顕微鏡を使用してスライスを視覚化YFP）。
2. 全細胞のZスタックを生成する（20X対物レンズを用いて、通常は0.5〜1ミクロンのステップ）は、適切なZ-解像度で画像を撮影する。複数のスタックは、通常の画像にデジタルでフィジー/ ImageJソフトウェア（ 図5A）を使用して、オフラインでステッチすることができ、全細胞を、必要とされる。
3. （フィジー/ ImageJソフトウェアパッケージ^17、 図Cにおける単純な神経トレーサープラグイン）半自動トレース法を用いたステッチ画像スタックからの細胞を再構築。
4. 最後に、私のPV-免疫反応性を評価する高開口数の対物レンズ（60Xシリコン浸漬、NA = 1.3）でnterneuron。 PVの体細胞洗い出しが強すぎると細胞体の像、近位樹状突起と軸索の近位、あるいは軸索の端末を作成します。免疫標識はビオシチン標識された構造（ 図5B）と整列するように確認された場合、細胞を、PVのための免疫反応性とみなされる。

結果

但し、スライス品質はCA1 PCやFS-INSは、最小限の困難を伴って達成することができ、両方からの録音、かなり良いです。 VGATプロモーター¹³の下ヴィーナス/ YFPを発現するトランスジェニックラットのラインが明確にFS-INS、または実際のBCを識別しない。しかし、INSからの記録str内とその周辺。錐体 、FS-INSの密度は、FS-INS（ 図2B）を選択する可能性の高い結果

ディスカッション

私たちは、機能的にin vitroでmorphologically-と神経化学的に特定したニューロンを特徴づけるために、電気生理学的および神経解剖学的手法を組み合わせた方法を記載している。特に皮質抑制性INSの多様な種類の。手順の重要なポイントは以下のとおりです潜在的なインの（1）事前選択; （2）細胞内記録とニューロンの可視化;そして最後に、（3）記録されたINSの形態学的および免疫細胞化学分?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats	-	-	see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary	-	-
Dissection tools	i.e. FST	-	For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers	-	-	Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University	-	Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer	-	-	Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary	-
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer, Cambridge	DS-2A	-
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides	-	-	Any high quality brand
Glass coverslips	-	-	Usually 22 x 22 mm
Agar spacers	-	-	Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji	-	See Schindelin et al., 2012