Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

Riepilogo

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Abstract

Interneuroni inibitori GABAergici svolgono un ruolo centrale nei circuiti neuronali del cervello. Interneuroni comprendono un piccolo sottoinsieme della popolazione neuronale (10-20%), ma mostrano un elevato livello di eterogeneità fisiologica, morfologica, e neurochimici, che riflettono le loro diverse funzioni. Pertanto, l'indagine di interneuroni fornisce importanti informazioni ai principi di organizzazione e funzionamento dei circuiti neuronali. Ciò, tuttavia, richiede un approccio fisiologico e neuroanatomica integrato per la selezione e l'identificazione dei tipi di interneuroni individuali. Whole-cell patch-clamp registrazione da acuta fettine di cervello di animali transgenici, che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto i promotori di marcatori specifici di interneuroni, fornisce un metodo efficace per individuare e caratterizzare elettrofisiologicamente proprietà intrinseche e sinaptiche di tipi di interneuroni specifici. Combinato con etichettatura colorante intracellulare, questo approccio può essere esteso con il post-hoc moanalisi rphological e immunocitochimica, consentendo l'identificazione sistematica dei neuroni registrati. Questi metodi possono essere personalizzati per soddisfare una vasta gamma di questioni scientifiche riguardanti le proprietà funzionali dei diversi tipi di neuroni corticali.

Introduzione

Circuiti neuronali ippocampali sono da tempo oggetto di intenso esame, per quanto riguarda sia l'anatomia e la fisiologia, a causa del loro ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria, così come la navigazione spaziale in entrambi gli esseri umani e roditori. Analogamente, l'organizzazione laminare prominente, ma semplice dell'ippocampo rende questa regione un soggetto privilegiato di studi che riguardano proprietà strutturali e funzionali di reti corticali.

Circuiti dell'ippocampo sono costituiti da cellule eccitatorie principali (> 80%) e una più piccola (10-20%), ma altamente diversificata coorte di interneuroni inibitori ^1-3. Interneuroni liberano acido γ-aminobutirrico (GABA) dai loro terminali assoni che agisce a ionotropici veloce recettori GABA _A (GABA _A Rs) e lenti metabotropici GABA _B recettori GABA _B (Rs) ^4. Questi meccanismi inibitori controbilanciano di eccitazione e regolano l'eccitabilità delle cellule principali, e quindi latempi ir e modello di scarico. Tuttavia, GABA rilasciato da interneuroni agisce non solo sulle cellule principali, ma anche sugli stessi interneuroni ^5,6. Recettori pre e post-sinaptici mediano di regolazione di ritorno e inibitori delle interazioni reciproche tra i vari tipi di interneuroni. Questi meccanismi inibitori nelle reti interneuroni sono ritenuti essere centrale per la generazione e la sagomatura di modelli di attività della popolazione, in particolare le oscillazioni a frequenze diverse ^7.

Whole-cell patch-clamp registrazione è un metodo consolidato per l'esame delle proprietà intrinseche e delle interazioni sinaptiche dei neuroni. Tuttavia, a causa della elevata diversità di tipi di interneuroni, ricerca di interneuroni inibitori richiede rigorosa identificazione delle cellule registrate. Come tipi di interneuroni dell'ippocampo sono caratterizzati da elementi particolari morfologici e l'espressione marcatore neurochimico, anatomico combinata e immunocitochimica eSAME può fornire un mezzo per determinare l'identità precisa ^6,8,9 interneuroni.

Nel presente lavoro si descrive un approccio sperimentale in cui whole-cell patch-clamp da neuroni singoli o coppie sinapticamente-accoppiati sono combinati con etichettatura intracellulare, seguito dal post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica, permettendo la caratterizzazione di lenta GABA _B recettore mediata effetti inibitori di interneuroni identificati. Come esempio, ci concentriamo su uno dei principali tipi di interneuroni, un sottoinsieme dei cosiddetti "cellule canestro" (BC), che innerva il soma e dendriti prossimali dei suoi obiettivi post-sinaptici ed è caratterizzata da un "spike veloce" (FS) scarico modello, un assone densamente che copre lo strato corpo cellulare, e l'espressione della proteina legante il calcio parvalbumina (PV) ^10,11. Questi interneuroni mostrano grandi correnti inibitorie post-sinaptiche, così come pre prominentemodulazione sinaptica della loro produzione sinaptica, in risposta al GABA _B R di attivazione ^12. La combinazione delle tecniche descritte qui può essere applicato altrettanto bene di indagare i meccanismi intrinseci o sinaptici in una varietà di altri tipi di neuroni identificati.

Protocollo

Dichiarazione Etica: tutte le procedure e animale manutenzione sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali, la legge tedesca Animal Welfare, il Consiglio direttiva 86/609 / CEE per quanto riguarda la protezione degli animali europea, e le linee guida delle autorità locali (Berlino, T-0215/11 )

1 Preparazione di fette acuta-ippocampali

1. Prendete un topo transgenico (da 17 a 24 giorni di età), che esprime la proteina fluorescente Venere / YFP sotto il promotore vGAT, che etichetta la maggior parte di interneuroni inibitori corticali ^13. Decapitare il ratto. Rapidamente sezionare il cervello (<40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O _2/5% di CO ₂₎ fluido a base di saccarosio-artificiale cerebrospinale (saccarosio-ACSF, Figura 1A).
2. Valutare il cervello di ratto sezionato per Venus / YFP fluorescenza con 505 nm lampada e 515 filtro per le emissioni LED, montata su un paio di occhiali.
3. Rimuovere il terzo anteriore della corteccia e cerebEllum; quindi separare gli emisferi, il tutto con un bisturi. Rimuovere la superficie dorsale della corteccia per fornire una superficie piana per incollare il cervello giù, come descritto in precedenza ^14.
4. Tagliare a fette trasversali (300 micron) della formazione dell'ippocampo su un vibratome, gli emisferi devono essere circondati da semifrozen, carbogenated saccarosio-ACSF (Figura 1B) ^14. Rimuovere ulteriori regioni di rostrale della corteccia, mesencefalo e tronco encefalico. Trasferire ogni fetta di una camera di contenimento sommerso contenenti saccarosio-ACSF, che è carbogenated e riscaldato a 35 ° C.
5. Lasciate le fette di recuperare a 35 ° C per 30 minuti dal momento dell'ultima fetta di entrare nel ACSF riscaldato. Fate questo in modo da riattivare i processi metabolici e facilitare la richiusura dei processi neuronali tagliati. Poi il trasferimento a temperatura ambiente per lo stoccaggio (Figura 1C).

2 Fabbricazione e riempimento di registrazione Pipettes

1. Pupipette di patch ll da capillari di vetro, in modo che una resistenza pipetta di 2-4 MW si raggiunge quando riempita di filtrato (filtro a siringa, dimensione dei pori: 0,2 micron) soluzione intracellulare contenente 0,1% biocitina (per l'etichettatura intracellulare). Mantenere la soluzione intracellulare raffreddato in ghiaccio per impedire il degrado dei suoi componenti.
2. Riempire pipette di patch per l'identificazione delle correnti post-sinaptiche con una soluzione contenente un basso Cl fisiologicamente rilevanti ^- concentrazione (E _{R (Cl)} = -61 mV; vedi elenco soluzione).
3. Per le registrazioni coppie di identificare le risposte recettore mediata presinaptiche, riempire pipette di patch con la soluzione intracellulare con bassa capacità di Ca ^{2 +} buffer per evitare interferenze con il rilascio del trasmettitore presinapticamente, così come 4 volte superiore Cl ^- concentrazione (E _{R (Cl)} = -20 mV) per migliorare il rapporto segnale-rumore di IPSCs osservati ⁵ consentano una valutazione accurata di resp farmacologicaonsiveness. Si noti che la modifica Cl ^- concentrazione può alterare IPSC cinetica ^15.

3. cellule intere patch-clamp Registrazione da FS-INS

1. Carbogenate ACSF e alimentare attraverso il sistema di perfusione alla camera di registrazione, per mezzo di una pompa peristaltica (che rimuove anche ACSF dalla camera di registrazione attraverso una linea di aspirazione, la Figura 2A). Accendere tutte le apparecchiature del setup in preparazione per la registrazione.
2. Trasferire una fetta di camera di registrazione e tenere in posizione con un anello in platino infilate con singole fibre di seta. Posizionare la fetta in modo che lo strato (str.) Pyramidale di CA1 scorre verticalmente attraverso il campo di vista, consentendo l'accesso con 2 pipette sia alla str. radiatum e str. Oriens contemporaneamente (Figure 2C e 4A).
3. Posizionare la camera nel setup e avviare la perfusione di carbogenated e riscaldata (32-34 ° C) la registrazione di unCSF a una portata di 5-10 ml / min.
4. Valutare la qualità fetta sotto l'ottica IR-DIC a 40X di ingrandimento obiettivo, e visualizzare con una camera CCD visualizzata su un display. Assumere buona qualità fetta se un gran numero di rotonde, moderatamente contrasto cellule CA1 piramidali CA1 (PC) può essere visto in str. pyramidale a profondità di 20-30 micron di sotto di una superficie liscia e leggermente crateri (Figura 2C). Fette di scarsa qualità contengono un gran numero di cellule altamente contrastati, rimpicciolite o gonfie, con una superficie fetta irregolare.
5. Identificare putativi interneuroni FS sotto illuminazione epifluorescenza come quelli che esprimono Venere / YFP (Figura 2B), con ampio somata multipolare dentro o vicino alla str. pyramidale. Selezionare le celle ragionevolmente profondo all'interno della slice (50-100 micron, Figura 2C), al fine di preservare meglio l'integrità morfologica.
6. Montare l'elettrodo di registrazione nel supporto pipetta sulla headstage; poi apply bassa, pressione positiva (20-30 mBar) attraverso la linea tubo. Abbassare la pipetta alla superficie della fetta, leggermente spostata verso il centro del neurone selezionato.
7. Ottenere configurazione di registrazione whole-cell come descritto in precedenza ^14,16 e vedi anche figure 2D e 2E:
   1. Obiettivo di una cella: Aumentare la pressione di 70-80 mBar e rapidamente abbassare la pipetta con la fetta appena sopra la soma della cella selezionata (Figura 2D, in alto).
   2. Avvicinarsi alla cella: Premere la pipetta contro la membrana cellulare per produrre una "fossetta" su di esso (Figura 2D, in alto). Eseguire questo passaggio rapido, al fine di evitare l'etichettatura biocitina delle cellule vicine.
   3. Creare un sigillo giga-ohm: Rilasciare la pressione e contemporaneamente applicare un comando di tensione 20 mV alla pipetta. Una guarnizione giga-ohm (1-50 GΩ; la figura 2D, fondo e figura 2E centro) typicalleato si sviluppa rapidamente. Una volta sigillato, applicare la membrana a riposo previsto potenziale (tipicamente tra -70 e -60 mV) come comando di tensione.
   4. Sfondare la patch: Una volta sigillato, rottura la patch di membrana con un breve impulso di pressione negativa; ottenendo così la configurazione whole-cell (Figura 2E, in basso).
8. Compensare capacità whole-cell e la resistenza serie _(S R). R _s è normalmente 5-20 MW e stabile per un massimo di 120 min. Abbandonare le cellule se potenziale di membrana (V _M) sul break-through è più depolarizzata a -50 mV; R _S è inizialmente superiore a 30 MW; R o _S cambia di più del 20% nel corso della registrazione.
9. Identificare FS-in da loro risposta (in modalità current-clamp) per una famiglia di iper per depolarizzanti impulsi di corrente (-250 a +250 pA, Figura 2F, in alto). FS-in sono relativamente depolarizzata V _M (tipicamente -50 to -60 mV), a breve membrana costante di tempo (<20 msec) e rispondere ad un 500 pA depolarizzante iniezione di corrente con un treno di potenziali d'azione (AP) a frequenze> 100 Hz ¹¹ (Figura 2F, in basso), che sono marcatamente diversi da quelli in CA1 PC (Figura 2F, al centro).

4. extracellulare stimolazione elettrica per evocare risposte GABA _B R-mediata

1. Per osservare le risposte sinapticamente evocate, posizionare un elettrodo di stimolazione extracellulare (una pipetta di patch piena di 2 M NaCl; Resistenza: 0,1-0,3 MW) nella fetta al confine di str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posizionare l'elettrodo 200-300 micron laterale alla soma per evitare la stimolazione elettrica diretta della cellula e ridurre al minimo gli artefatti di stimolazione (Figura 3a).
2. Una volta che l'elettrodo di stimolazione viene posizionato, di ottenere la registrazione whole-cell dila cella scelto e valutare il fenotipo fisiologico in modalità current-clamp, come nella sezione 3.9 (Figura 3B).
3. Con il neurone registrato in voltage-clamp (V _M -65 mV), consegnare la stimolazione elettrica degli assoni presinaptici a 50 V (~ 500 μA stimolo efficace) ogni 20 secondi, con un isolato a tensione costante stimolatore. Utilizzare solo stimoli (100 msec durata, Figura 3C, in alto) per osservare GABA _B R IPSCs mediate, e interleave con treni di stimoli multipli (a 200 Hz) per produrre maggiore rilascio del trasmettitore.
4. Bagno applicare ionotropici antagonisti dei recettori del glutammato (AMPA dei recettori: DNQX [10 mM]; recettore NMDA: D-AP5 [50 mM]) per rivelare isolato monosinaptico IPSC (Figura 3C, medio-alta). Inoltre isolare il IPSC GABA _B R-mediata con l'applicazione di un bloccante GABA _A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C mezzo lower).
5. Confermare la conseguente lenta verso l'esterno di corrente (Figura 3C inferiore, espanso) ad essere GABA _B R-mediata dalla successiva applicazione di CGP-55845 [5 mM] (Figura 3C inferiore, giacente in grigio)

5. accoppiati registrazioni di sinapticamente accoppiate FS-IN e CA1 PC

1. Valutare GABA _B R-mediata controllo presinaptica della trasmissione sinaptica inibitoria con le registrazioni simultanee, eseguiti tra sinapticamente-accoppiati IN e PC coppie come descritto di seguito.
2. In primo luogo, stabilire una registrazione a cellula intera di un interneuroni presinaptico (come al punto 3) e confermare il fenotipo FS (Figura 4A).
3. Poi patchare un CA1 PC vicina (distanza 20-100 micron, Figura 4A) e applicare breve suprathreshold impulsi di corrente depolarizzante (durata 1 msec, 1-5 nA ampiezza) al presinaptica IN (tenutasi in modalità current-clamp) per suscitare AP. Se un co sinapticannection è presente, AP nel risultato IN nel IPSCs nel CA1 PC, tenutasi in voltage-clamp (compensare R _S a circa il 80%).
4. Se necessario, riempire un nuovo elettrodo di registrazione e registrare da altri PC CA1 finché non si trova una connessione.
5. Una volta che la connessione è stabilita, suscitare coppie di AP nel presinaptico FS-IN per valutare sia la risposta sinaptica unitario e comportamento dinamico. Utilizzare un tipico protocollo accoppiato impulsi di 2 stimoli depolarizzanti con un intervallo di 50 msec (Figura 4B).
6. Raccogliere le tracce di controllo in condizioni basali. Quindi, applicare i GABA _B baclofen R agonisti selettivi (10 micron) per la ACSF perfusione, attivando così GABA _B Rs, seguita da antagonista CGP-55845 (5 mM), per bloccare completamente gli effetti del recettore mediata. Raccogliere ~ 50 tracce durante lo stato stazionario di ciascuna condizione di farmaco (Figura 4B e C).
7. Una volta che la registrazione è completata, sigillare la membrana somatica formando un Outside-out patch: Lentamente ritirare la pipetta dal corpo cellulare in V-clamp e come R _S aumenta, ridurre la V _M a -40 mV. Fate questo per facilitare la formazione del cerotto esterno-out; quindi rimuovere la pipetta dal bagno.

6 Analisi delle proprietà elettrofisiologiche

1. NOTA: Una moltitudine di diversi pacchetti software sono disponibili per l'acquisizione dei dati elettrofisiologici. Qui, WinWCP, viene utilizzato un programma di Windows nel pacchetto Strathclyde Elettrofisiologia software libero, che permette di registrare fino a 16 canali di ingresso analogici e l'uscita di 10 segnali digitali.
2. Filtro passa-basso tutti i dati a 5-10 kHz e campione a 20 kHz.
3. Analizzare i dati fisiologici con una suite di analisi off-line.
   NOTA: Stimfit, un pacchetto software open source che include una shell Python, è usato in questo caso; comunque altre alternative possono essere facilmente utilizzati al posto.
   1. Analizzare membrana passiva proprietà di neuroni registrati, acquisite nel morsetto corrente, dal potenziale di membrana.
   2. Misurare la media potenziale di membrana dalla linea di base delle risposte registrate dall'inizio della registrazione.
   3. Calcolare la resistenza di ingresso, utilizzando la legge di Ohm, dalla risposta di tensione ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti (≤ -50 pA). Per migliorare rapporto segnale-rumore, la media più tracce. Nota: i nostri esempi sono tipicamente medie di 10-50 singoli spazza.
4. Stimare il tempo membrana apparente costante montando una curva monoesponenziale al decadimento delle risposte ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti.
5. Analisi del potenziale d'azione della forma d'onda per determinare la soglia, ampiezza (soglia di picco) e la durata (larghezza misurata a metà altezza) suscitata da soglia impulsi di corrente depolarizzante.
6. Analizzare GABA _B R IPSCs mediate dalle registrazioni clamp di tensione. Filtro traccia off-line all'indirizzo500 Hz (filtro gaussiano) e valutare l'ampiezza di picco e la latenza del GABA _B R risposta mediata (in medie di almeno 10 tracce).
7. Rileva l'effetto del GABA _B Rs sull'uscita inibitorio di Ins come un cambiamento di ampiezza di picco delle IPSCs GABA _A R-mediati misurati tra picco e precedente linea di base. Calcolare l'ampiezza media da ≥50 tracce per il periodo di controllo e lo stato stazionario di tutte le epoche farmacologici.

7 Visualizzazione e immunocitochimica di FS-Ins

1. Dopo le registrazioni, fissare le fette per immersione in paraformaldeide al 4% con 0.1 M tampone fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C.
2. Se fette necessari possono essere trasferiti PB e conservati fino a ~ 1 settimana prima trasformazione.
3. Lavare le fette liberamente in PB fresco e successivamente a 0,025 M PB con il 0,9% di NaCl (PBS, pH = 7.35).
4. Per ridurre l'anticorpo non specifico vincolante, bloccare le fette for 1 ora a temperatura ambiente in una soluzione contenente 10% di siero di capra normale (NGS), 0,3% Triton-X100 (un detergente per permeabilize membrane) e lo 0,05% NaN _3, costituito in PBS.
5. Per etichettare per l'espressione PV, utilizzare un anti-PV topo monoclonale diluito in una soluzione contenente 5% NGS, 0.3% Triton-X100, 0,05% NaN _3, in PBS. Incubare anticorpi primari per 2-3 giorni a 4 ° C ^12. Sciacquare accuratamente le fette in PBS.
6. Applicare anticorpi secondari anti-topo fluorescenti (ad es AlexaFluor-546.) Insieme alla biotina streptavidina-binding protein, coniugato a un fluorocromo (ad esempio, AlexaFluor-647); e incubare in una soluzione contenente 3% NGS, 0.1% Triton-X100, 0,05% NaN _3, diluito in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
7. Liberamente sciacquare fette 2-3x con PBS seguiti da 2-3 risciacqui in PB. Montare le fette su vetrini. Utilizzare un agar distanziale 300 micron per evitare che la fetta di collassare. Fette di Cover-scivolo con una fluoresmezzo di montaggio cento e tenuta con unghie vernice.

8 Imaging e ricostruzione di Visualized FS-Ins

1. Visualizza le fette con un microscopio confocale a scansione, con il giornalista fluorochome eccitato con la linea laser appropriata (diodo laser 635 nm per AlexaFluor-647; Elio-Neon 543 nm per AlexaFluor-546 etichettatura per il fotovoltaico e Argon 488 o 515 nm per Venus / YFP).
2. Prendere le immagini a un Z-risoluzione appropriata (tipicamente 0,5-1 micron passi, usando un obiettivo 20X) per produrre una Z-stack di tutta la cellula. Più pile sono normalmente necessari per l'immagine tutta la cella, che può essere digitalmente cucita off-line utilizzando FIJI / software ImageJ (Figura 5A).
3. Ricostruire la cella dalla pila immagine cucita utilizzando un metodo di analisi semi-automatica (semplice plugin neuriti Tracer in FIJI / ImageJ pacchetto software ^17, Figura C).
4. Infine, valutare il PV-immunoreattività della interneuron con una lente obiettivo ad alta apertura numerica (60X silicio-immersion, NA = 1.3). Rendere le immagini del soma, dendriti prossimali e assoni prossimale, o in alternativa di terminali assoni se washout somatica del fotovoltaico è troppo forte. Le cellule sono considerati immunoreattive per PV se immuno-etichettatura è visto ad allineare con le strutture biocitina marcati (Figura 5B).

Risultati

A condizione che la qualità fetta è sensibilmente buona, la registrazione da entrambi CA1 PC e FS-in possono essere raggiunti con difficoltà minima. La linea di topo transgenico che esprime Venere / YFP sotto il promotore vGAT ¹³ non identifica inequivocabilmente FS-in, o anzi jacket. Tuttavia registrazioni da INs in ed intorno a str. piramidale, dove la densità di FS-in è in genere alta ^1, si traduce in una elevata probabilità di selezionare FS-in (Figura 2B). FS-in...

Discussione

Descriviamo un metodo che combina tecniche elettrofisiologiche e neuroanatomiche caratterizzare funzionalmente i neuroni morphologically- e neurochimico-identificati in vitro; in particolare i diversi tipi di INs inibitorie corticali. Gli aspetti principali della procedura sono: (1) pre-selezione dei potenziali INs; (2) la registrazione intracellulare e la visualizzazione dei neuroni; e infine (3) analisi morfologica e immunocitochimica di INs registrati. Sebbene questo studio ha affrontato PV-in in particolare, il prot...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats			see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary
Dissection tools	i.e. FST		For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers			Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University		Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer			Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer Ltd.	DS-2A
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides			Any high quality brand
Glass coverslips			Usually 22 x 22 mm
Agar spacers			Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji		See Schindelin et al., 2012