Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Özet

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Özet

GABAerjik inhibitör beyin nöronal devrelerin içinde merkezi bir rol oynarlar. Internöron nöronal bir topluluğun canlılığını (% 10-20) küçük bir alt kümesi ihtiva eder, ancak bunların çeşitli fonksiyonları yansıtan, fizyolojik morfolojik ve nörokimyasal heterojenlik yüksek bir seviyesini gösterir. Bu nedenle, internöronlar incelenmesi önemli organizasyon ilkeleri anlayışlar ve nöronal devrelerin fonksiyonu sağlar. Ancak bu durum, tek tek interneuron türlerinin seçimi ve tanımlanması için bir fizyolojik ve Nöroanatomik bir yaklaşım gerektirmektedir. Interneuron özel markörlerin promotörler altında floresan protein ifade eden transgenik hayvanların akut beyin kesitleri, kayıt, tam hücre patch-clamp, hedef ve elektrofizyolojik spesifik interneuron türleri iç ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için etkili bir yöntem sağlar. Hücre içi boya etiketleme ile birlikte, bu yaklaşım post-hoc mo ile uzatılabilirrphological ve immünositokimyasal analizi, kaydedilen nöronların sistematik bir şekilde tanımlanması sağlanır. Bu yöntemler kortikal nöronların çeşitli türdeki fonksiyonel özellikleri ile ilgili bilimsel sorular geniş bir yelpazede uygun hale getirilebilir.

Giriş

Hipokampal nöronal devreler nedeniyle uzun süredir insanlar ve kemirgenler hem onların öğrenme ve hafızada önemli bir rol yanı sıra mekansal navigasyon için anatomi ve fizyoloji, hem de saygı ile, yoğun inceleme konusu olmuştur. Aynı şekilde, hipokampusun önemli, ama basit laminar organizasyon bu bölge kortikal ağların yapısal ve fonksiyonel özelliklerini ele çalışmaların bir tercih konusu yapar.

Hipokampal devreleri uyarıcı asıl hücrelerin (>% 80) ve daha küçük (% 10-20), ancak inhibitör ^1-3 derece çeşitli kohort oluşmaktadır. Internöron hızlı iyonotropik GABA _A reseptörlerinin hareket akson terminallerinden γ-amino butirik asit (GABA) (GABA _A Rs) ve yavaş metabotropik GABA _B reseptörleri (GABA _B TL) bırakın ^4. Bu inhibisyon mekanizması uyarma dengelemek ve ana hücrelerinin uyarılabilirliğini düzenleyen ve böyleceir zamanlama ve deşarj desen. Bununla birlikte, GABA internöronlar salınan ana hücreler üzerinde değil, aynı zamanda kendilerini ^5,6 internöronlar üzerinde de etki eder. Ön ve postsinaptik reseptörleri interneuron çeşitli türleri arasında geribildirim düzenleme ve inhibitör karşılıklı etkileşimlere aracılık. Interneuron ağlarda Bu önleyici mekanizmalar farklı frekanslarda ^7'de özellikle sallantı- nesil ve nüfus aktivite desen şekillendirme, merkezi olduğuna inanılmaktadır.

Tüm hücre patch-kelepçe kayıt içsel özellikleri ve nöronların sinaptik etkileşimlerinin incelenmesi için köklü bir yöntemdir. Ancak, interneuron türleri yüksek çeşitlilik nedeniyle, inhibitör incelenmesi kaydedilen hücrelerinin titiz belirlenmesini gerektirir. Hipokampal interneuron türleri farklı morfolojik özellikler ve nörokimyasal işaretleyici ifade, kombine anatomik ve immünositokimyasal e nitelendirildiğindenxamination hassas interneuron kimlik ^6,8,9 belirlemek için bir araç sağlayabilir.

Bu yazıda biz yavaş GABA _B karakterizasyonu için izin, tek nöronların veya sinaptik-birleştiğinde çiftlerinden tüm hücre patch-kelepçe kayıtları post-hoc morfolojik ve immünositokimyasal analizi ile takip, hücre içi etiketleme ile kombine edildiği deneysel bir yaklaşım tanımlamak reseptör tespit internöronlarda inhibitör etkilere aracılık. Örnek olarak, biz onun postsinaptik hedeflerin soma ve proksimal dendritler innerve ve bir "fast çivilenmesi" (FS) ile karakterize edilir interneuron bir ana tip, sözde "basket hücrelerinde" (BC) bir alt kümesi, odaklanmak kalsiyum-bağlayıcı protein parvalbumin (PV), ^10,11 desen yoğun hücre gövdesi kaplama tabakası bir akson ve ifade boşaltın. Bu internöron büyük postsinaptik inhibitör akımları, yanı sıra önde gelen pre gösterilecek_GABAB R aktifleşmesinin ¹² tepki olarak sinaptik çıkış sinaptik modülasyonu. Burada açıklanan tekniklerin kombinasyonu tanımlanmış diğer nöron türlerinden çeşitli intrinsik veya sinaptik mekanizmalarını incelemek için de eşit ölçüde uygulanabilir.

Protokol

Etik Açıklama: Tüm prosedürler ve hayvan bakım Kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı, Alman Hayvan Refahı Yasası, Avrupa Konseyi hayvanların korunmasına ilişkin Direktifi 86/609 / EEC ve yerel otoriteler (Berlin, T-0215/11 den kılavuzlar )

Akut-hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.

1. Kortikal inhibitör ¹³ çoğunluğunu etiketler vGAT promoteri altında, floresan Venüs / YFP proteini ifade edilmesi, (17-24 günlük) bir transgenik fare al. Sıçan başını kesmek. Hızla carbogenated, semifrozen (% 95 O ₂ /% 5 CO ₂₎ sakaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (sakaroz-ACSF, Şekil 1A) içine beyin (<40 sn) teşrih.
2. , Lamba ve 515 emisyon filtresi LED gözlük bir çift üzerine monte nm bir 505 ile Venüs / YFP floresan için disseke sıçan beyni değerlendirin.
3. Korteks ve Cereb cephe üçte çıkarınEllum; sonra tüm bir neşter ile, hemisferlerdir ayırmak. Daha önce tarif edildiği gibi ^14, beyin aşağı yapıştırmak için düz bir yüzey temin etmek üzere korteks dorsal yüzeyini ^çıkarın.
4. Bir vibratom üzerinde hipokampal oluşumun enine dilim (300 mikron) Kesme, hemisfer semifrozen ile çevrili olmalı, sakaroz-ACSF (Şekil 1B) ¹⁴ carbogenated. Rostral korteks, midbrain ve beyin sapı ek bölgeleri çıkarın. Carbogenated ve 35 ° C'ye ısıtılır sükroz ACSF ihtiva eden bir yarı-tutma odasına her dilim aktarın.
5. Isındı ACSF giren son dilimin zaman 30 dakika boyunca 35 ° C'de kurtarmak için dilimleri bırakın. Metabolik süreçleri etkinleştirmek ve kesilmiş nöronal süreçlerin kapanmanın kolaylaştırmak için bunu yapın. Daha sonra depolama (Şekil 1C), oda sıcaklığında transfer.

2. İmalat ve Kayıt Pipetler dolumu

1. Pu(hücre içi etiketleme için)% 0.1 biocytin ihtiva eden hücre içi çözelti filtreden geçirilmiş ile doldurulduğu zaman 2-4 M? bir pipet direnci elde edilir, böylece cam kılcal LL yama pipetler, (0.2 mikron bir şırınga filtreden, gözenek boyutu). Bileşenlerinin bozunmasını önlemek için buz üzerinde soğutulmuş, hücre içi çözelti tutun.
2. Konsantrasyon (; çözelti listesine bakınız E _{R (Cl)} = -61 mV), ^- fizyolojik olarak ilgili olan, düşük Cl ihtiva eden bir çözelti ile postsinaptik akımlar tespit edilmesi için yama pipetler doldurun.
3. Konsantrasyonunu (E _{R (Cl)} = ^- eşleştirilmiş kayıtları presinaptik reseptörü kaynaklı tepkileri belirlemek için, düşük bir Ca ^{2 +} tampon presynaptically transmiter salımına engel olmamak için kapasitesi, hem de 4-kat daha yüksek bir Cı gibi, hücre içi çözelti ile yama pipet dolgu -20 mV) sinyal-gürültü farmakolojik respin doğru değerlendirilmesini sağlayan gözlenen iPSCs ⁵ artırmak içinonsiveness. Konsantrasyon IPSC kinetik ¹⁵ değiştirebilecek ^- Cl değişen unutmayın.

FS-ins 3. Tüm Hücre Patch-kelepçe Kayıt

1. ACSF Carbogenate ve (aynı zamanda emme hattı, Şekil 2A aracılığıyla kayıt odasından ACSF kaldırır) bir peristaltik pompa vasıtasıyla, kayıt odasına perfüzyon sistemine beslenir. Kayıt için hazırlık kurulum tüm ekipmanı açın.
2. Kayıt odasına bir dilim aktarın ve ipek tek lifleri ile sinirli bir platin halkası ile yerinde tutun. CA1 stratum (str.) Pyramidale hem str 2 pipet ile erişim sağlayan, görüş alanında dikey olarak çalışacak şekilde dilim yerleştirin. radiatum ve str. oriens anda (Şekil 2C ve 4A).
3. (32-34 ° C) kayıt A kurulum içine odasına yerleştirin ve carbogenated perfüzyon başlar ve ısındı5-10 ml / dakika bir akış hızında CSF verildi.
4. 40X objektif büyütme IR-DIC optik altında dilim kalitesini değerlendirmek ve bir ekranda izlendi CCD kamera ile görselleştirmek. Yuvarlak, orta kontrastlı CA1 piramidal hücreleri (CA1 PC), çok sayıda str görüldüğü takdirde iyi bir dilim kaliteli varsayalım. pürüzsüz ve hafifçe kraterli yüzeyi (Şekil 2C) altına 20-30 mikron derinlikte pyramidale. Kalitesiz dilimleri pürüzlü bir dilim yüzeye sahip, yüksek kontrastlı, çökmüş ya da şişmiş hücrelerin çok sayıda içerir.
5. Veya str yakın büyük kutuplu somata ile Venüs / YFP (Şekil 2B), ifade gibi epifloresans aydınlatma altında farazi FS internöronlardan tanımlayın. pyramidale. Makul derin amacıyla dilim (50-100 mikron, Şekil 2C) içindeki hücreleri seçin daha iyi morfolojik bütünlüğünü korumak için.
6. Headstage pipet tutucu kayıt elektrodu monte; Daha sonra uygulamaly tüp hattı üzerinden düşük, pozitif basınç (20-30 mBar). Dilim yüzeyine indirin pipet hafifçe seçilen nöronun merkezine kaydırın.
7. Daha önce ^14,16 anlatıldığı ve aynı zamanda 2D ve 2E Rakamlar bkz olarak tam hücreli kayıt yapılandırmasını edinin:
   1. Bir hücreyi hedef: 70-80 mBar'a basıncını arttırın ve hızla sadece seçili hücreye (Şekil 2B, üstte) soma yukarıda dilim aracılığıyla pipet indirin.
   2. Hücreyi Yaklaşım: (üst, Şekil 2B) bunun üzerine bir "gamze" üretmek için hücre zarı karşı pipet basın. Komşu hücrelerin biocytin etiketleme önlemek için, hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin.
   3. Giga-ohm mühür oluşturun: pipet 20 mV gerilim komutu uygulamak eşzamanlı basıncı bırakın ve. Bir giga-ohm mühür (1-50 GΩ Şekil 2B, alt ve Şekil 2E orta) typicmüttefiki hızla gelişir. Bir kez gerilim komut olarak potansiyel beklenen dinlenme membran (tipik olarak -70 ve -60 mV) uygulanacaktır, mühürlü.
   4. Yama kırmaya: mühürlü sonra, negatif basınç kısa bir darbe ile membran rüptürü yama; böylece bütün hücre konfigürasyonu (Şekil 2E ve alt) etkisi.
8. Bütün hücre kapasitans ve seri direnç (R _S) dengeleyin. R _s 120 dakikaya kadar normalde 5-20 M? Ve kararlı. Break-through membran potansiyeli (V _M) -50 mV daha depolarize ise hücreleri terk; R _S 30 M? Daha başlangıçta büyüktür; Kaydın boyunca% 20'den fazla ya da R ve _S değişir.
9. (+250 PA, Şekil 2F, top -250) akım darbeleri Depolarizan için hiper bir aile (akım kelepçe modunda) onların yanıt FS-İnş tanımlayın. FS-INs nispeten V _M (genellikle -50 t depolarize varo -60 mV), kısa membran zaman sabiti (<20 msn) ve frekanslarda aksiyon potansiyelleri bir tren (AP) ile akım enjeksiyon Depolarizan 500 pA yanıt> 100 Hz ¹¹ (Şekil 2F, alt), belirgin olan CA1 PC'ler (Şekil 2F, orta) olanlar farklı.

4. Hücre dışı Elektriksel Stimülasyon GABA _B R-aracılı yanıtları uyandırmak için

1. Str sınırında dilim:; synaptically uyarılmış yanıtları gözlemlemek için, bir hücre dışı uyarım elektrot (0.1-0.3 M? Direnç 2 M NaCl ile dolu bir yama pipet) yerleştirin. radiatum ve str. lacunosum-moleculare. stimülasyon eserler (Şekil 3A) hücrenin doğrudan elektrik stimülasyonu önlemek ve en aza indirmek için soma elektrodu 200-300 mikron yanal yerleştirin.
2. Stimülasyon elektrodu bir biçimde pozisyonlandığı zaman, tüm hücre kayıt eldeseçilen hücre ve 3.9 bölüm (Şekil 3B) olarak akım kelepçe modunda fizyolojik fenotipi değerlendirmek.
3. Voltaj-kelepçe (V _M -65 mV) kaydedilen nöron ile bir presinaptik akson elektriksel uyarımı sağlamak 50 V (~ 500 uA etkili uyarıcı), izole edilmiş bir sabit voltaj uyarıcısı kullanılarak her 20 saniye,. Tek uyaranlara kullanın (100 mikro-saniye süresi, Şekil 3C, üst) GABA _B R aracılı iPSCs gözlemlemek, ve daha verici serbest üretmek için (200 Hz) birden uyaranların trenler ile birbirinden.
4. İzole monosinaptik IPSC (orta üst Şekil 3C) ortaya çıkarmak için:;: Banyo İyonotropik glutamat reseptör antagonistleri (d-AP5 [50 iM] NMDA reseptör DNQX [10 iM] AMPA reseptörü) uygulanır. Bundan başka, bir GABA _{A, R'nin} bloker tatbik edilmesi ile, _GABAB R aracılı iPSC izole (gabazine [10 uM]; Şekil 3C, L ortaower).
5. GABA _B sonraki uygulama CGP-55845 [5 mcM] (Şekil 3C alt, gri bindirmiştir) tarafından R-aracılı olarak bileşkesini yavaş dışa akım (genişletilmiş Şekil 3C düşük) onaylayın

FS-IN ve CA1 PC'ler birleştiğinde synaptically 5. Eşli Kayıtlar

1. Aşağıda açıklandığı gibi sinaptik-birleştiğinde IN ve PC çiftleri arasında yapılan eş zamanlı kayıtları ile inhibitör sinaptik iletim GABA _B R aracılı presinaptik kontrolünü değerlendirmek.
2. Öncelikle, (bölüm 3 gibi) bir presinaptik interneuron bütün bir hücre kayıt kurmak ve FS fenotip (Şekil 4A) onaylayın.
3. Sonra komşu CA1 PC (20-100 mikron mesafe, Şekil 4A) yama ve APleri ortaya çıkarmak için (akım kelepçe modunda tutulan) presinaptik IN akım darbeleri (1 msn süre, 1-5 nA genlik) Depolarizan kısa suprathreshold geçerlidir. Sinaptik bir işbirliği halindennection, voltaj-kelepçe düzenlenen CA1 PC, içinde olarak iPSCs neden olmaktadırlar AP (yaklaşık% 80 ila R _S telafi) kullanılır.
4. Gerekirse bir bağlantı bulunana kadar, daha CA1 PC'ler yeni kayıt elektrot ve kayıt doldurun.
5. Bir bağlantı kurulduktan sonra, üniter sinaptik tepki ve dinamik davranışı hem değerlendirmek için presinaptik FS-IN içinde AP çiftleri ortaya. 50 milisaniye aralıklarla (Şekil 4B) ile 2 olan depolarize edici uyarılara tipik bir eşleştirilmiş darbe protokolünü kullanır.
6. Bazal koşullarda kontrol izlerini toplayın. Daha sonra, bu şekilde tam olarak reseptör aracılı etkileri engellemek için, antagonistin CGP-55845 (5 uM), ardından _GABAB Rs, aktivasyon, perfüze ACSF için seçici _GABAB R agonisti baklofen (10 uM) uygulanır. Her ilaç durumda (Şekil 4B ve C) Kararlı durum sırasında ~ 50 izleri toplayın.
7. Kayıt işlemi tamamlandıktan sonra, bir dışında Paris oluşturarak somatik membran sızdırmazE-üzerinden yama: Yavaş V-kıskacına hücre gövdesinden pipet çekilme ve R _S arttıkça, mV -40 V _​​M azaltır. Dış kısım-dış yama oluşumunu kolaylaştırmak için bu fazlası; Daha sonra banyosundan pipet çıkarın.

Elektrofizyolojik Özellikleri 6. Analizi

1. NOT: farklı yazılım paketleri bir çokluk elektrofizyolojik veri edinimi için kullanılabilir. Burada, WinWCP, ücretsiz Strathclyde Elektrofizyoloji Yazılım paketinde bir Windows programı kadar 16 analog giriş kanalları kayıt ve 10 dijital sinyallerin çıkışını sağlayan, kullanılır.
2. Alçak geçiren filtre 20 kHz tüm 5-10 kHz veri ve örnek.
3. Bir off-line analiz suite ile fizyolojik verileri analiz.
   NOT: Stimfit, bu durumda kullanılan bir Python kabuğu içeren açık kaynak kodlu bir yazılım paketi; Ancak diğer alternatifler kolayca yerine kullanılabilir.
   1. Pasif membran p AnalizKaydedilen nöronların roperties, membran dinlenme potansiyeli Bulunduğum kelepçe satın aldı.
   2. Kaydın başlangıcında kaydedilen yanıtların başlangıca göre ortalama dinlenme membran potansiyelinin ölçülmesi.
   3. Küçük hiperpolarizan atımlannm (≤ -50 pA) için gerilim yanıtı, Ohm kanunu kullanarak, giriş direnci hesaplayın. Gürültü oranı, ortalama birden izleri sinyali artırmak için. Not: Bizim örnekler 10-50 bireysel Piyango ortalamasıdır.
4. Küçük hiperpolarizan akım darbelerine yanıtların çürüme bir monoexponential eğri oturtularak sürekli görünür membran zaman tahmin.
5. Eşik genliği (tepe eşik) ve süreyi (yarı yükseklikte ölçülen genişlik) mevcut edilen kutuplaşma giderici darbelerin ortaya çıkardığı eşik seviyesinin belirlenmesi için aksiyon potansiyeli dalga analiz edin.
6. GABA _B R gerilim kelepçe kayıtları aracılı iPSCs analiz edin. Filtre off-çizgi izler500 Hz (Gauss filtresi) ve (en az 10 izleri ortalamalarının) _GABAB R aracılık yanıtının tepe genliği ve gecikmeyi belirlemek.
7. Tepe ve önceki taban arasında ölçülen GABA _A R-aracılı iPSCs pik genliği bir değişiklik olarak ins inhibitör çıkışında GABA _B Rs etkisini algılar. Kontrol süresi ve tüm farmakolojik dönemini kararlı devlet için ≥50 izlerinden ortalama genlik hesaplayın.

7. Görselleştirme ve İmmünositokimya FS-Ins

1. Kayıtlarından sonra, 4 ° C 'de 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH = 7.35) O / N oranı ile% 4 paraformaldehid içinde daldırma ile dilimleri sabitleyin.
2. Gerekli dilimleri işlemeden önce 1 ~ haftaya kadar PB transfer ve saklanabilir edin.
3. Liberal taze PB ve daha sonra% 0.9 NaCl ile 0.025 M PB yıkayın dilimleri (PBS, pH = 7.35).
4. Fo dilimleri bloke spesifik olmayan antikor azaltmak için% 10 normal keçi serumu (NGS),% 0.3 Triton-X100, PBS içinde hazırlanmış _NaN3 ve% 0.05 (membranları nüfuz edilebilir kılınması için bir deterjan) ihtiva eden bir çözelti içinde, oda sıcaklığında 1 saat r.
5. PBS, _NaN3% 5 NGS,% 0.3 Triton-X100,% 0.05 ihtiva eden bir çözelti içinde seyreltilmiş bir anti-BD monoklonal fare antikoru kullanarak, BD ekspresyon için etiketlemek için. 4 ° C'de ¹² gün boyunca 2-3 primer antikorlar inkübe edin. Iyice PBS dilimleri durulayın.
6. Floresan anti-fare sekonder antikor uygulayın (örneğin AlexaFluor-546). Biyotin bağlayıcı protein streptavidin ile birlikte bir florokrom konjüge edilmiş (örneğin, AlexaFluor-647); ve PBS içerisinde seyreltilmiş _NaN3,% 3 NGS,% 0.1 Triton-X100,% 0.05 ihtiva eden bir çözelti içinde inkübe edildi ve 4 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin.
7. Liberal 2-3 PB durular ile PBS ile takip 2-3x dilimleri durulayın. Cam slaytlar dilimleri monte edin. Çökmesini dilim önlemek için 300 mikron ağar ayırıcı kullanın. Bir Fluores ile kapak kayma dilimleritırnak-cilası ile yüzde montaj orta ve mühür.

8. Görüntüleme ve Visualized İmar FS-Ins

1. Uygun lazer çizgisinin (diyot lazer AlexaFluor-647 için 635 nm ile heyecanlı fluorochome muhabiri ile bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri görselleştirmek; Venus AlexaFluor-546 PV için etiketleme ve Argon 488 veya 515 nm Helyum-Neon 543 nm / YFP).
2. Bütün hücrenin Z-yığını elde etmek için (20X objektif kullanarak, tipik haliyle 0.5-1 um adımlar) uygun bir Z çözünürlükte al. Birden yığınları normal görüntüye dijital FIJI / İmageJ yazılım (Şekil 5A) kullanarak off-line dikişli olabilir tam hücre, gereklidir.
3. Bir yarı-otomatik izleme yöntemi kullanılarak dikişli görüntü yığını hücreyi yeniden yapılandırma (FİJİ / İmageJ yazılım paketi ¹⁷ Basit nörit İzleyici eklentisi, Şekil C).
4. Son olarak, i PV-bağışıklık tepkiselliğini tahlilyüksek sayısal açıklık objektif lens ile nterneuron (60X silikon-daldırma, NA = 1.3). PV somatik arınma çok güçlü ise soma görüntüleri, proksimal dendritler ve proksimal akson veya alternatif akson terminallerinin olun. Immün-etiketleme biocytin-etiketli yapılar (Şekil 5B) ile uyum görülürse Hücreler PV için imünoreaktif sayılır.

Sonuçlar

Sağlanan bu dilim kalite hem CA1 PC'ler ve FS-INs az zorlukla elde edilebilir kayıt, kayda değer iyidir. VGAT promoter ¹³ altında Venüs / YFP ifade transgenik fare hattı tümden FS-INS, ya da gerçekten BCs tespit etmez. Ancak ve str etrafında INS gelen kayıtları. pyramidale, FS-ins yoğunluğu ¹ genellikle yüksek olduğu, FS-ins (Şekil 2B) seçerek bir yüksek olasılık sonuçları. FS-INs CA1 PC'ler ve RS-INS, her ikisi de farklı karakterist...

Tartışmalar

Biz işlevsel in vitro morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan nöronlar karakterize etmek elektrofizyolojik ve Nöroanatomik tekniklerini birleştiren bir yöntem tarif; Özellikle kortikal inhibitör ins çeşitli türleri. Prosedürün önemli yönleri vardır: Potansiyel ins (1) ön seçim; (2) hücre içi kayıt ve nöron görselleştirme; ve nihayet (3) Kaydedilen INS morfolojik ve immünositokimyasal analizi. Bu çalışmada özellikle PV bileşenler ele olmasına rağmen, tarif edilen protokol minimal değ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats	-	-	see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary	-	-
Dissection tools	i.e. FST	-	For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers	-	-	Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University	-	Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer	-	-	Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary	-
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer, Cambridge	DS-2A	-
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides	-	-	Any high quality brand
Glass coverslips	-	-	Usually 22 x 22 mm
Agar spacers	-	-	Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji	-	See Schindelin et al., 2012