De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

Résumé

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.

Résumé

Interneurones inhibiteurs GABAergiques jouent un rôle central dans les circuits neuronaux du cerveau. Interneurones comprennent un petit sous-ensemble de la population neuronale (10-20%), mais montrent une grande hétérogénéité physiologique, morphologique et neurochimique, reflétant leurs diverses fonctions. Par conséquent, l'enquête des interneurones fournit des renseignements importants sur les principes de l'organisation et de la fonction des circuits neuronaux. Ceci, cependant, nécessite une approche physiologique et neuro-anatomique intégré pour la sélection et l'identification des types individuels des interneurones. Cellules entières d'enregistrement de tranches de cerveau aiguës d'animaux transgéniques, exprimant des protéines fluorescentes dans les promoteurs de marqueurs spécifiques d'interneurones patch-clamp, fournit une méthode efficace pour cibler et électrophysiologique caractériser les propriétés intrinsèques et synaptiques des types des interneurones spécifiques. Combiné avec intracellulaire étiquetage de colorant, cette approche peut être étendue avec post-hoc moanalyse rphological et immunocytochimique, permettant une identification systématique des neurones enregistrés. Ces méthodes peuvent être adaptés à un large éventail de questions scientifiques concernant les propriétés fonctionnelles des divers types de neurones corticaux.

Introduction

Circuits neuronaux de l'hippocampe ont longtemps fait l'objet d'un examen minutieux, par rapport à l'anatomie et de la physiologie, en raison de leur rôle essentiel dans l'apprentissage et la mémoire, ainsi que la navigation spatiale chez les humains et les rongeurs. De même, l'organisation laminaire de premier plan, mais simplement de l'hippocampe fait de cette région un sujet de prédilection des études portant sur les propriétés structurales et fonctionnelles des réseaux corticaux.

Circuits de l'hippocampe sont constitués de cellules excitateurs principaux (> 80%) et un plus petit (10-20%), mais la cohorte très diversifié d'interneurones inhibiteurs ^1-3. Interneurones libèrent de l'acide γ-aminobutyrique (GABA) de leurs terminaux des axones qui agit à ionotropes rapide récepteurs GABA _A (GABA _A R) et lents métabotropiques _GABAB récepteurs GABA _(B R) ^4. Ces mécanismes inhibiteurs contrebalancer excitation et de réguler l'excitabilité des cellules principales, et donc lamoment de ir et le modèle de décharge. Cependant, les interneurones GABA libéré agit non seulement sur ​​les cellules principales, mais également sur ​​les interneurones ^5,6 eux-mêmes. Récepteurs post-synaptiques et pré médiation régulation par rétroaction et interactions mutuelles inhibitrices entre les différents types de interneurones. Ces mécanismes inhibiteurs dans les réseaux des interneurones sont soupçonnés d'être au cœur de la production et la mise en forme des modèles d'activité de la population, en particulier les oscillations à des fréquences différentes ^7.

Cellule entière enregistrement patch-clamp est une méthode bien établie pour l'examen des propriétés intrinsèques et les interactions synaptiques des neurones. Toutefois, en raison de la grande diversité des types de interneurones, enquête sur les interneurones inhibiteurs exige l'identification rigoureuse des cellules enregistrées. Comme types de interneurones hippocampiques sont caractérisés par des éléments particuliers morphologiques et l'expression du marqueur neurochimique, anatomique combinée et immunocytochimique eXAMEN peut fournir un moyen de déterminer précisément ^6,8,9 identité des interneurones.

Dans le présent article, nous décrivons une approche expérimentale dans laquelle des cellules entières enregistrements de patch-clamp de neurones simples ou paires synaptique couplés sont combinés avec marquage intracellulaire, suivie par analyse post-hoc morphologique et immunocytochimique, permettant la caractérisation de la lenteur GABA _B médiée par le récepteur des effets inhibiteurs dans les interneurones identifiés. A titre d'exemple, nous nous concentrons sur un type majeur de interneurones, un sous-ensemble de ce qu'on appelle les «cellules de panier" (de la Colombie-Britannique), qui innerve les soma et proximale des dendrites de ses objectifs post-synaptiques et se caractérise par un "dopage rapide» (FS) décharger motif, recouvrant un axone forte densité de la couche de corps de la cellule, et l'expression de la protéine parvalbumine de liaison du calcium (PV) ^10,11. Ces interneurones présentent d'importants courants postsynaptiques inhibiteurs, ainsi que des pré proéminentmodulation synaptique de leur sortie synaptique, en réponse à l'activation GABA _B R ^12. La combinaison des techniques décrites ici peut être appliqué aussi bien pour étudier les mécanismes intrinsèques ou synaptiques dans une variété d'autres types de neurones identifiés.

Protocole

Déclaration éthique: toutes les procédures et animale entretien ont été effectués conformément aux directives institutionnelles, la loi allemande sur la protection des animaux, la directive européenne 86/609 / CEE relative à la protection des animaux, et des directives des autorités locales (Berlin, T-0215/11 )

1 Préparation de tranches aiguë-hippocampiques

1. Prenez un rat transgénique (17 à 24 jours), l'expression de la protéine fluorescente Venus / YFP sous le promoteur de VGAT, qui marque la majorité des interneurones inhibiteurs corticaux ^13. Décapiter le rat. Rapidement disséquer le cerveau (<40 sec) dans semifrozen, carbogenated (95% O _2, CO _2/5%) à base de saccharose liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF saccharose, figure 1A).
2. Évaluer le cerveau de rat disséqué pour Venus / YFP fluorescence avec une lampe 505 nm et 515 filtre d'émission LED, monté sur une paire de lunettes.
3. Retirer la troisième frontale du cortex et CerebEllum; puis de séparer les hémisphères, le tout avec un scalpel. Retirer la face dorsale du cortex pour fournir une surface plane pour coller le cerveau vers le bas, comme décrit précédemment ^14.
4. Couper des tranches transversales (300 um) de la formation hippocampique sur un vibratome, les hémisphères doivent être entourés d'semifrozen, carbogenated saccharose ACSF (figure 1B) ^14. Retirer régions supplémentaires du cortex rostral, le mésencéphale et le tronc cérébral. Transfert de chaque tranche dans une chambre de retenue immergé ACSF contenant du saccharose, qui est carbogenated et chauffé à 35 ° C.
5. Laissez les tranches de récupérer à 35 ° C pendant 30 min à partir du moment de la dernière tranche entrer dans le ACSF réchauffé. Pour ce faire, dans le but de réactiver les processus métaboliques et de faciliter la refermeture de processus neuronaux coupées. Puis transfert à la température ambiante pour le stockage (figure 1C).

2. fabrication et de remplissage de pipettes d'enregistrement

1. PuLes pipettes de patch ll de capillaires en verre, de sorte qu'une résistance à la pipette de 2-4 MQ est réalisé quand il est rempli avec filtré (filtre de seringue, taille des pores: 0,2 um) solution intracellulaire contenant 0,1% de la biocytine (pour le marquage intracellulaire). Conserver la solution intracellulaire refroidi sur de la glace pour empêcher la dégradation de ses constituants.
2. Remplissez les pipettes de patch pour l'identification des courants post-synaptiques avec une solution contenant un Cl faible physiologiquement pertinente ^- concentration (E _{R (Cl)} = -61 mV; voir la liste de la solution).
3. Pour les enregistrements appariés pour identifier les réponses médiées par des récepteurs présynaptiques, remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire de faible capacité Ca2 ⁺ tampon pour éviter les interférences avec l'émetteur de presse pré-synaptique, ainsi que 4 fois plus élevée concentration de Cl ^- (E _{R (Cl)} = -20 mV) pour améliorer le rapport signal-bruit de CISP observées ⁵ permettant une évaluation précise de resp pharmacologiqueonsiveness. Notez que la modification concentration de Cl ^- peut modifier la cinétique IPSC ^15.

3 cellules entières Patch-clamp enregistrement de FS-IN

1. Carbogenate l'ACSF et alimenter par l'intermédiaire du système de perfusion à la chambre d'enregistrement, au moyen d'une pompe péristaltique (ce qui supprime également l'ACSF à partir de la chambre d'enregistrement à travers une conduite d'aspiration, la figure 2A). Mettre tous les appareils de la configuration en cours de préparation pour l'enregistrement.
2. Transférer une tranche de la chambre d'enregistrement et maintenir en place avec un anneau de platine enfilées avec des fibres simples de soie. Positionner la tranche de telle sorte que la couche pyramidale (str.) De CA1 s'étend verticalement à travers le champ de vision, ce qui permet l'accès aux deux pipettes à la fois la str. radiatum et str. oriens simultanément (figures 2C et 4A).
3. Placer la chambre dans la configuration et commencer la perfusion de carbogenated et chauffée (32-34 ° C) Un enregistrementCSF à un taux de 5 à 10 ml / min.
4. Évaluer la qualité de coupe sous l'optique IR-DIC à un grossissement de 40X objectif, et visualiser avec une caméra CCD vu sur un écran. Présumer de la bonne qualité de la tranche si un grand nombre de cellules rondes, modérément contrastées CA1 pyramidales CA1 (PC) peut être vu dans str. pyramidale à des profondeurs de 20-30 um ci-dessous une surface lisse et légèrement cratères (figure 2C). Pauvres tranches de qualité contiennent un grand nombre de très contrastées, les cellules ratatinées ou gonflées, avec une surface de tranche inégale.
5. Identifier FS putatifs interneurones sous un éclairage à épifluorescence que ceux exprimant Vénus / YFP (figure 2B), avec une grande soma multipolaire dans ou près de la str. pyramidale. Sélectionnez les cellules raisonnablement profonde au sein de la tranche (50-100 um, figure 2C) afin de mieux préserver leur intégrité morphologique.
6. Monter l'électrode d'enregistrement dans le support de pipette sur la headstage; alors l'applicationment une faible pression positive (20 à 30 mbar) à travers la ligne de tube. Abaisser la pipette à la surface de la tranche, légèrement décalé vers le centre du neurone sélectionné.
7. Obtenir la configuration d'enregistrement cellule entière comme décrit précédemment ^14,16 et voir également les figures 2D et 2E:
   1. Cibler une cellule: Augmenter la pression à 70-80 mbar et abaisser rapidement la pipette par la tranche juste au-dessus du soma de la cellule sélectionnée (figure 2D, en haut).
   2. Approche de la cellule: Appuyez sur la pipette contre la membrane cellulaire pour produire une «fossette» sur elle (figure 2D, en haut). Effectuez cette étape rapidement, afin d'éviter l'étiquetage biocytine de cellules voisines.
   3. Créer un joint gigaohm: Relâchez la pression et appliquer simultanément une commande de 20 mV tension à la pipette. Un joint giga-ohms (1-50 GQ; figure 2D, le fond et la figure 2E milieu) typicallié se développe rapidement. Une fois scellé, appliquer le potentiel membranaire de repos attendu (typiquement entre -70 et -60 mV) en tant que commande de tension.
   4. Brisez le patch: Une fois scellé, la rupture de la pièce de membrane avec une brève impulsion de pression négative; réalisant ainsi la configuration cellule entière (Figure 2E, en bas).
8. Compenser la capacité de cellule entière et de la résistance série (R _S). R _s est normalement 5-20 MQ et stable jusqu'à 120 min. Abandon cellules si le potentiel (V _M) de la membrane sur la percée est plus dépolarisée à -50 mV; R _S est initialement supérieure à 30 MQ; ou R _S changements de plus de 20% au cours de l'enregistrement.
9. Identifier FS-ins par leur réponse (en mode courant-clamp) à une famille de l'hyper à la dépolarisation des impulsions de courant (-250 à 250 pA, figure 2F, en haut). FS-ins ont relativement dépolarisé V _M (typiquement -50 to -60 mV), courte membrane constante de temps (<20 ms) et répondre à une 500 pA dépolarisants injection de courant avec un train de potentiels d'action (PA) à des fréquences> 100 Hz ¹¹ (figure 2F, en bas), qui sont nettement différents de ceux de CA1 PC (Figure 2F, milieu).

4. extracellulaire stimulation électrique à susciter des réponses GABA _B R médiation

1. Pour observer les réponses synaptiques évoqués, placer une électrode de stimulation extracellulaire (une pipette de patch rempli de 2 M de NaCl; Résistance: 0,1-0,3 MQ) dans la tranche à la frontière de str. radiatum et str. lacunosum-moleculare. Positionner l'électrode 200 à 300 um de la soma latérale pour empêcher une stimulation électrique directe de la cellule et de réduire au minimum les artefacts de stimulation (figure 3A).
2. Une fois que l'électrode de stimulation est positionnée, obtenir l'enregistrement de cellules entières dela cellule choisie et évaluer le phénotype physiologique en mode courant pince comme dans la section 3.9 (figure 3B).
3. Avec le neurone enregistré dans voltage-clamp (V _M -65 mV), délivrer une stimulation électrique des axones présynaptiques à 50 V (~ 500 uA stimulus efficace) toutes les 20 secondes, en utilisant un stimulateur de tension constante isolé. Utilisez unique stimuli (100 ps durée, la figure 3C, en haut) pour observer GABA _B R CISP médiation, et s'imbriquent avec des trains de multiples stimuli (à 200 Hz) afin de produire une plus grande version de l'émetteur.
4. Bain s'applique antagonistes des récepteurs ionotropiques du glutamate (récepteur d'AMPA: DNQX [10 uM]; récepteur NMDA: D-AP5 [50 uM]) pour révéler la CISP monosynaptique isolé (Figure 3C, supérieur au milieu). Isoler davantage l'IPSC GABA _B R-médiation avec l'application d'un bloqueur GABA _A R (gabazine [10 uM]; figure 3C de l milieutournesol).
5. Confirmez la résultante lente courant sortant (figure 3C inférieur, élargi) comme étant GABA _B R-médiée par l'application ultérieure de CGP-55845 [5 uM] (figure 3C inférieur, reposant en gris)

5. jumelés enregistrements de synapses couplés FS-IN et CA1 PC

1. Évaluer le contrôle présynaptique GABA _B R médiation de la transmission synaptique inhibitrice des enregistrements simultanés, réalisées entre synapses couplés paires IN et PC comme décrit ci-dessous.
2. Tout d'abord, établir un enregistrement cellule entière d'une interneurones présynaptique (comme dans la section 3) et confirmer le phénotype de FS (figure 4A).
3. Puis de relier un PC CA1 voisin (20-100 um Distance, figure 4A) et exercez une brève dépolarisation supraliminaire impulsions de courant (1 msec, 1-5 nA amplitude) à la présynaptique IN (tenue en mode courant-clamp) pour obtenir des points d'accès. Si un co synaptiquennection est présent, les points d'accès dans le résultat IN dans CISP dans le CA1 PC, qui s'est tenue en tension de serrage (compenser R _S à environ 80%).
4. Si nécessaire, remplir une nouvelle électrode d'enregistrement et enregistrer à partir d'autres ordinateurs CA1 jusqu'à ce qu'une connexion soit trouvée.
5. Une fois la connexion établie, obtenir des paires de points d'accès dans le présynaptique FS-IN pour évaluer à la fois la réponse synaptique unitaire et le comportement dynamique. Utilisation d'un protocole typique double choc de deux stimuli dépolarisants avec un intervalle de 50 ms (figure 4B).
6. Recueillir des traces de contrôle dans les conditions de base. Ensuite, appliquer les baclofène R agonistes GABA _B sélectifs (10 uM) à l'ACSF perfusion, activant ainsi GABA _B Rs, suivis par l'antagoniste CGP-55845 (5 M), pour bloquer complètement les effets des récepteurs médiation. Recueillir ~ 50 traces pendant l'état d'équilibre de chaque condition de drogue (figure 4B et C).
7. Une fois l'enregistrement terminé, sceller la membrane somatique en formant un outside-out patch: retirer lentement la pipette à partir du corps de la cellule en V-clamp et les R _S augmente, réduire le V _M à -40 mV. Pour ce faire, afin de faciliter la formation du patch outside-out; puis retirer la pipette de la salle de bain.

6 Analyse des propriétés électrophysiologiques

1. REMARQUE: Une multitude de logiciels différents sont disponibles pour l'acquisition de données électrophysiologiques. Ici, WinWCP, un programme Windows dans le forfait gratuit Strathclyde électrophysiologie logiciel est utilisé, ce qui permet d'enregistrer jusqu'à 16 canaux d'entrées analogiques et une sortie de 10 signaux numériques.
2. Filtre passe-bas de toutes les données à 5-10 kHz et à 20 kHz échantillon.
3. Analyser les données physiologiques avec une analyse bains hors ligne.
   REMARQUE: Stimfit, un logiciel open source qui comprend une enveloppe de Python, est utilisé dans ce cas; cependant, d'autres alternatives peuvent facilement être utilisés à la place.
   1. Analyser passive membrane propriétés des neurones enregistrées, acquises en pince ampèremétrique, du potentiel de membrane au repos.
   2. Mesurer la moyenne du potentiel de membrane au repos de la ligne de base des réponses enregistrées à partir du début de l'enregistrement.
   3. Calculer la résistance d'entrée, en utilisant la loi d'Ohm, à partir de la réponse de tension à la plus petite des impulsions de courant d'hyperpolarisation (≤ -50 Pa). Pour améliorer le rapport signal sur bruit, des traces multiples moyens. Remarque: les exemples sont généralement des moyennes de 10-50 balayages individuels.
4. Estimer le temps de membrane apparente constante en ajustant une courbe monoexponentielle à la désintégration des réponses aux petites impulsions de courant hyperpolarisants.
5. Analyser l'action onde potentiel pour déterminer le seuil, amplitude (seuil à crête) et la durée (largeur mesurée à mi-hauteur) provoquée par niveau de seuil de dépolarisation des impulsions de courant.
6. Analyser GABA _B R CISP médiation à partir d'enregistrements tension de serrage. Filtre retrace off-line à500 Hz (filtre gaussien) et d'évaluer l'amplitude de crête et la latence de la réponse à médiation par GABA _B de R (en moyenne d'au moins 10 traces).
7. Détecter l'effet de GABA _B Rs inhibitrice sur la production de IN comme un changement dans l'amplitude de crête des CPSI GABA _A R médiées mesurées entre le pic et le niveau de référence précédent. Calculer l'amplitude moyenne de ≥50 traces de la période de contrôle et l'état d'équilibre de toutes les époques pharmacologiques.

7 Visualisation et Immunocytochemistry de FS-Ins

1. Après les enregistrements, fixer les tranches par immersion dans du paraformaldéhyde 4% avec 0,1 M de tampon phosphate (PB, pH = 7,35) O / N à 4 ° C.
2. Si les tranches nécessaires peuvent être transférées à PB et stockés jusqu'à environ 1 semaine avant le traitement.
3. Tranches Laver abondamment à PB frais et suite à 0,025 M PB NaCl à 0,9% (PBS, pH = 7,35).
4. Pour réduire anticorps liaison non spécifique, bloquer les tranches for 1 heure à température ambiante dans une solution contenant 10% de sérum normal de chèvre (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un détergent pour perméabiliser les membranes) et 0,05% _{de NaN3,} composé dans du PBS.
5. Pour étiqueter l'expression de PV, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-PV dilué dans une solution contenant 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% _{de NaN3} dans du PBS. Incuber les anticorps primaires pendant 2-3 jours à 4 ° C ^12. Rincer soigneusement les tranches dans du PBS.
6. Appliquer des anticorps secondaires anti-souris fluorescents (par exemple, AlexaFluor-546.) Avec la streptavidine-protéine de liaison de biotine conjugué à un fluorochrome (par exemple, AlexaFluor-647); et incuber dans une solution contenant 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% _{de NaN3,} dilué dans du PBS et incubation O / N à 4 ° C.
7. Rincer généreusement les tranches 2-3 fois avec du PBS suivi par 2-3 rinçages dans PB. Montez les tranches sur des lames de verre. Utilisez un 300 um agar entretoise pour empêcher la tranche de s'effondrer. Tranches lamelle avec un fluocent milieu de montage et joint avec vernis à ongles.

8. imagerie et la reconstruction de Visualized FS-Ins

1. Visualisez les tranches à l'aide d'un microscope confocal à balayage, avec le journaliste fluorochome excité avec la ligne laser approprié (diode laser 635 nm pour AlexaFluor-647; hélium-néon 543 nm pour AlexaFluor-546 étiquetage des PV et Argon 488 ou 515 nm pour Venus / YFP).
2. Prendre des images à une résolution en Z approprié (typiquement de 0,5 à 1 um d'étapes, en utilisant un objectif 20X) afin de produire une pile en Z de la cellule entière. Piles multiples sont normalement requis pour l'image de la cellule entière, qui peut être numériquement cousu hors ligne à l'aide FIDJI / logiciel ImageJ (figure 5A).
3. Reconstruire la cellule de la pile d'images cousu au moyen d'une méthode de suivi semi-automatique (simple plug-in Neurites Tracer dans le progiciel FIDJI / ImageJ ^17, Figure C).
4. Enfin, évaluer le PV-immunoréactivité de l'interneuron avec une lentille d'objectif à grande ouverture numérique (60X silicium-immersion, NA = 1,3). Faire des images de la soma, dendrites proximales et axone proximal, ou encore de terminaisons axonales si lavage somatique de PV est trop fort. Les cellules sont considérées comme immunoréactive pour PV si l'immuno-marquage est visible à aligner avec les structures de biocytine marquée (Figure 5B).

Résultats

À condition que la qualité de coupe est sensiblement bon, l'enregistrement à la fois CA1 PC et FS-IN peut être réalisé avec un minimum de difficultés. La ligne de rat transgénique exprimant Vénus / YFP sous le promoteur de VGAT ¹³ ne permet pas d'identifier sans équivoque FS-IN, voire BC. Cependant enregistrements de IN dans et autour de str. pyramidale, où la densité de FS-IN est généralement élevé ^1, entraîne une forte probabilité de sélection FS-IN (fi...

Discussion

Nous décrivons une méthode qui combine des techniques de neuro-anatomiques et électrophysiologiques à la caractérisation fonctionnelle des neurones morphologically- et neurochimique identifiés in vitro; notamment les divers types de IN inhibiteurs corticaux. Les principaux aspects de la procédure sont les suivantes: (1) pré-sélection des potentiels IN; (2) l'enregistrement intracellulaire et le neurone visualisation; et enfin (3) l'analyse morphologique et immunocytochimique de IN enregistrées. Bien qu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgenic vGAT-venus rats	-	-	see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles	BLS Ltd., Hungary	-	-
Dissection tools	i.e. FST	-	For brain removal
Vibratome	Leica	VT1200S	Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers	-	-	Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope	Olympus, Japan	BX50WI	With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera	Till Photonics	VX55
505 nm LED system	Cairn Research	OptiLED system	Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers
WinWCP acquisition software	John Dempster, Strathclyde University	-	Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.
Electrode Puller	Sutter	P-97	Used with box-filament
Borosilicate pipette glass	Hilgenberg, Germany	1405020	2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls	Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer	-	-	Custom made
Digital Manometer	Supertech, Hungary	-
Isolated constant voltage stimulator	Digitimer, Cambridge	DS-2A	-
Biocytin	Invitrogen	B1592	Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX disodium salt	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody	Swant, Switzerland	235	Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A11030	If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000
Microscopy slides	-	-	Any high quality brand
Glass coverslips	-	-	Usually 22 x 22 mm
Agar spacers	-	-	Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji	-	See Schindelin et al., 2012