El aislamiento y uso de las Secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la Prueba de Vasoactividad en el intestino delgado

Resumen

El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad.

Resumen

Sistemas digestivo de los mamíferos están constantemente expuestos a compuestos (deseables e indeseables) que pueden tener un efecto sobre el flujo de sangre hacia y desde ese sistema. Los cambios en el flujo de sangre al intestino delgado puede resultar en efectos en las funciones de absorción del órgano. Especial interés en las toxinas liberadas de los piensos a través de procesos fermentativos y digestivos en rumiantes ha desarrollado como un área donde las eficiencias productivas se podrían mejorar. El vídeo asociado con este artículo se describe un bioensayo in vitro desarrollado para seleccionar compuestos para vasoactividad en aislados secciones transversales de la arteria mesentérica bovina y la vena utilizando un multimyograph. Una vez que los vasos sanguíneos se montan y se equilibraron en el myograph, el propio bioensayo se puede utilizar: como una herramienta de detección para evaluar la respuesta contráctil o vasoactividad de compuestos de interés; determinar la presencia de tipos de receptores por la orientación farmacológicamente receptores con agonista específicos; determinar el papel de un receptor con la presencia de uno o más antagonistas; o determinar las posibles interacciones de los compuestos de interés con los antagonistas. A través de todo esto, se recogen datos en tiempo real, el tejido recogido de un solo animal puede ser expuesto a un gran número de diferentes tratamientos experimentales (una ventaja in vitro), y representa la vasculatura a cada lado de la cama capilar para proporcionar una precisa imagen de lo que podría estar sucediendo en la aferente y eferente suministro de sangre apoyar el intestino delgado.

Introducción

Las alteraciones en el flujo de sangre a un lecho de tejido pueden tener un gran impacto en la función del órgano. Una función principal del intestino delgado es la absorción de nutrientes. Se requiere el flujo de sangre arterial a la superficie de absorción del intestino para absorción aumenta y el flujo sanguíneo de nutrientes para ayudar en la absorción de nutrientes como la digesta se mueve a lo largo de la superficie ^1. Una disminución en el flujo sanguíneo puede causar una reducción en la absorción de nutrientes debido a una disminución en el gradiente transepitelial ^2. Además de los nutrientes, el intestino delgado también puede estar expuesto a metabolitos secundarios, drogas o toxinas que ejercen un efecto sobre el flujo de sangre localizada en el mesenterio. En el caso de que el animal rumiante, los compuestos pueden ser liberados de un pienso (por ejemplo, nutrientes tales como aminoácidos, o toxinas tales como alcaloides del cornezuelo del centeno) a través de procesos fermentativos del intestino anterior. Si estos compuestos sobreviven el metabolismo microbiano de la fermentación ruminal, que ahora están disponibles para la absorcióno la interacción a medida que viajan a través del tracto gastrointestinal del animal.

Hay un número de diferentes métodos disponibles para medir el flujo sanguíneo in vivo (por ejemplo, el ultrasonido Doppler, medidores de flujo de sangre mora, microesferas radiomarcadas, y técnicas de indicador de dilución) que permiten la evaluación de diversos escenarios o tratamientos experimentales. Sin embargo, para obtener información con respecto a las propiedades mecánicas o farmacológicas de músculo liso vascular, los métodos fueron limitadas a los grandes buques hasta Mulvany y Halpern ³ publicaron un artículo que describe una técnica que utiliza alambre montado preparaciones anillo vascular en un myograph. Desde el desarrollo de esta técnica, las modificaciones se siguen realizando a los sistemas Myograph asociados que permiten una variedad de aplicaciones diferentes para la evaluación de las estructuras tubulares. El sistema también se ha adaptado para utilizar varillas fijas para el montaje de los buques más grandes ^4, donde la perfusióntécnicas no son deseados.

Debido a diferencias en los vasos de diferentes orígenes anatómicos y distinciones en los mismos buques de diferentes especies de animales, datos de buque y tipo de animal no puede ser fácilmente extrapolado a través de diferentes embarcaciones o el mismo recipiente en diferentes tipos de animales ^5. En consecuencia, los bioensayos separados deben ser desarrollados y validados en cualquier momento se cambian estos aspectos. Recientemente, varios bioensayos se han desarrollado con estas tecnologías para el uso en el ganado lateral vena safena derecha y la arteria y la vena ruminal ^6,7.

Este bioensayo se desarrolló para investigar específicamente los efectos que tienen los alcaloides del ergot en la vasculatura de soporte del intestino delgado. Se informó de que el 50-60% de alcaloides alimentados aparece en el contenido del abomaso, pero sólo el 5% se recuperó en las heces ^8. Strickland et al. ⁹ declaró en una revisión de los alcaloides del cornezuelo de centeno, que PV datos disponiblesest que el intestino delgado puede ser el sitio más importante para la absorción Ergopeptine. Eckert et al. ¹⁰ aspectos biofarmacéuticos crítica de alcaloides del cornezuelo de centeno y afirmaron que una vez que cruzan la barrera epitelial, alcaloides del cornezuelo de centeno se transporten, bien por el sistema linfático a la vena subclavia o por medio de la vena mesentérica y en la sangre portal. Rhodes et al. ¹¹ reportó una disminución del flujo sanguíneo hacia el duodeno y el colon en novillos que consumen una (alta de alcaloides del cornezuelo de centeno) dieta alta endofito infectadas. Usando el bioensayo de la arteria y la vena ruminal derecho, Foote et al. ¹² demostraron que los alcaloides del ergot son vasoactivos en la vasculatura ruminal. Foote et al. ¹³ posteriormente demostraron in vivo que la exposición a los alcaloides del cornezuelo de centeno ruminal resultados en un rumen disminución del flujo sanguíneo epitelial. Esta disminución en el flujo sanguíneo a la superficie de absorción del rumen de forma concomitante causó una reducción en nutrientes (ácidos grasos volátiles) de flujo. Dada la quantity de alcaloides del cornezuelo de centeno que pasan en el intestino delgado del intestino anterior; se planteó la hipótesis de que se produzca un efecto similar en la pequeña vasculatura intestinal y la absorción de nutrientes. Esto requirió el desarrollo de la bioensayo arteria mesentérica y vena ileal proximal bovina.

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Protocolo

Los procedimientos utilizados en este estudio no requieren la aprobación de la Universidad de Kentucky Cuidado de Animales y el empleo Comisión porque no se utilizaron animales vivos. Antes de la recolección de cualquier muestra utilizada en este documento, todos los animales fueron aturdidos con perno cautivo y se desangraron. Esto se llevó a cabo en una instalación de matadero inspección federal en la Universidad de Kentucky. Un representante oficial de la Seguridad e Inspección de los Alimentos del USDA observó todas las actividades que se ocupan de los animales vivos y la manipulación de la canal.

1 Preparación de Instrumentación

1. Para minimizar la cantidad de tiempo entre las colecciones de muestras de tejido para el inicio de un experimento, fije el equipo y preparar tampones antes de recoger el tejido experimental (o si el personal adicionales están disponibles, estas tareas pueden ocurrir simultáneamente).
   NOTA: Esto no sólo proporciona la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos, pero algunosexperimentos pueden correr durante largos períodos de tiempo (o si hay un deseo de completar múltiples experimentos en un día), por lo tanto, suele ser conveniente empezar tan pronto como sea posible.
2. Encienda el ordenador asociado, equipos adquisiciones de datos, baño de agua (para el tampón (s)) y myograph unidad (s). Coloque el equipo de calibración en la unidad (s) myograph y encienda el calor myograph (predefinido a 37,5 ° C) y permitir que las unidades y equipos de calibración para calentar para preestablecer las temperaturas.
   1. Abra un archivo de configuración de software gráfico creado anteriormente en el equipo y empezar una carrera (pero no la adquisición de datos).
3. Caliente el equipo durante 10 minutos.
   1. Iniciar la adquisición de datos.
   2. Cero todos los canales.
   3. Compruebe, y llevar a cabo la calibración (si es necesario) en cada canal (4 canales por multimyograph) para estandarizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva asociada a ese canal a una fuerza de 2 g suministrada por un peso certificado.
   4. Una vez completados calibración y una conversión de unidades, almacenar todos los datos posteriores como gramos. Cambie en consecuencia sobre la base de los deseos de cada laboratorio independiente; el equipo y el software permiten el uso de otras unidades, tales como miliNewtons y voltios.
4. Asegúrese de que las líneas de gas están libres de obstrucciones y abra el suministro de gas (95% O _2/5% CO ₂₎ a Myograph (s) unidades. Gas continuamente todos los tampones (en las cámaras Myograph) durante todo el procedimiento.
5. Rellene todas las cámaras Myograph con etanol al 70% y en remojo durante 10 minutos, retirar el etanol, y repita para un segundo 10 minutos en remojo.
   1. Tras eliminación del etanol, enjuáguese la boca tres veces con agua desionizada, seguido de tres lavados con tampón preparada (vea la Sección 2 para la preparación de buffer), dejando la tercera adición de tampón en las cámaras.
      NOTA: En este punto, el equipo puede permanecer inactivo en este estado hasta que se preparan búfer y el tejido y el personal está listo para proceder con los experiment.

2. Preparación de tampones

1. Preparar una solución tampón de 1 L de Krebs-Henseleit para su uso en el transporte y procesamiento de muestras de tejido para alcanzar concentraciones finales de 11,1 mM de D-glucosa; 1.2 mM _MgSO4; 1.2 mM KH ₂ PO _4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl _2; 24,9 mM _NaHCO3.
   1. Mezclar 9,6 g de sales de Krebs en aproximadamente 900 ml de agua desionizada sobre una placa de agitación.
   2. Mezclar en 0,373 g de cloruro de calcio deshidratado seguido de 2,1 g de bicarbonato de sodio por litro de tampón deseado.
   3. Gas solución tampón durante 20 minutos con 95% de _O2 / 5% de CO _2.
   4. Después de gasificación, ajustar el pH a 7,05 (filtración de tampón aumenta el pH; pH objetivo final debe ser 7.4) y ajustar el volumen de 1 L.
   5. Filtrar esterilizar tampón en una botella y almacén intermedio de medios 1 L autoclave limpio a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
2. Preparar separada Krebs-Hsolución tampón enseleit para su uso en experimentos Myograph como se describe en el paso 2.1 para el transporte tampón de Krebs-Henseleit con compuestos adicionales que se refieren a los experimentos de la contractilidad.
   NOTA: Por lo general 2 L será suficiente para los experimentos descritos en este artículo, pero puede necesitar este volumen para aumentar o disminuir según la duración del experimento, el número de cámaras Myograph y reemplazos de amortiguamiento número (en relación con las adiciones de tratamiento).
   1. Antes de la etapa de gasificación (paso 2.1.3), añadir 9,1 mg (por L de tampón está preparado) de desipramina-HCl para amortiguar.
   2. Preparar una solución de propranolol-HCl 1,0 M y añadir 1 ml (por L de tampón está preparado) de esta solución a la solución de tampón de Krebs-Henseleit. Hacer este tampón el día de uso y mantener a temperaturas Myograph operativo (una temperatura que produce una temperatura de 37,5 ° C en el myograph).
      NOTA: La desipramina se añade para inhibir los mecanismos selectivos de la recaptación de aminas biógenasy permitir la limpieza de adiciones experimentales de la memoria intermedia de baño de los vasos sanguíneos que se produzca más rápidamente. La adición de propranolol evita que la unión no específica de compuestos de tratamiento para β-adrenérgicos receptores.

3. Recogida y preparación de la vasculatura

1. Tan pronto como sea posible, retire el tracto gastrointestinal de la canal. Una vez que el animal ya no exhibe ningún reflejo involuntario, quitar la cabeza y ocultar y levante la carcasa verticalmente. La eliminación de las vísceras gastrointestinal (esófago hasta el ano) de la canal debe ser completado por el personal de matadero autorizado (<20 min de tiempo de aturdimiento).
   NOTA: ¿Qué tan pronto, es generalmente limitada por la ubicación / instalación donde ésta se obtiene el tracto intestinal desde y procedimientos operativos estándar o procedimientos por mandato federal, seguidos por los personal de la instalación.
   1. En la mayoría de instalaciones, llevar a cabo manipulaciones del tracto gastrointestinalen un lugar separado de la transformación de la canal que está destinado a entrar en el suministro de alimentos. Utilice las inmediaciones conveniente que el tracto gastrointestinal se puede tomar y hacia fuera para su examen.
2. Una vez que el tracto gastrointestinal se extendió a cabo, identificar el intestino delgado, el pliegue ileocecal que conecta el intestino delgado al intestino ciego, y la brida que se extiende ileal proximal al pliegue ileocecal (Figura 1A).
   1. Usando un bisturí o cuchillo, muy ligeramente hacer una incisión en la membrana mesentérica en el centro de la brida ileal. El uso de dos dedos índices, sin rodeos diseccionar la grasa y el tejido conectivo exponer la vasculatura mesentérica (Figura 1B).
3. De esta brida o protuberancia en el mesenterio intestinal, diseccionar múltiples ramas (~ 2 cm de longitud) de los haces de la arteria y la vena mesentérica expuestos que apoyan esta porción del íleon (Figura 1C).
   1. Si ucantar unas pinzas para agarrar el tejido, tenga cuidado de no captar directa o tirar de los vasos sanguíneos en absoluto, mientras que la eliminación de ellos como cualquier tipo de estiramiento puede dañar y afectar negativamente el rendimiento de tejido ^14. Eliminación de los vasos sanguíneos se realiza mejor, cortando a través de cada extremo de la sección que ser eliminado y luego cortar junto o en paralelo a la sección de ahora aislado. Para facilitar, eliminar parte del tejido circundante, junto con los vasos para proporcionar un poco de tejido para captar con un par de fórceps.
   2. Con un par de pinzas, sumerja muestra de tejido en un tubo que contiene hielo frío tampón de Krebs-Henseleit y almacenar en hielo hasta el procesamiento puede ocurrir en el laboratorio.
4. Coloque la muestra de tejido sobre una superficie de corte o en una placa de Petri y sumerja parcialmente en hielo frío de Krebs-Henseleit.
   1. Utilizando # 5 joyeros fórceps, tijeras iris Noyes, y de aumento de la lámpara o la disección de alcance (2,5 a magnificación 5.0X es suficiente), diseccionar cuidadosamente lejos la connecti grasa y rodeacinco tejidos y separar la arteria y la vena. La identificación de la abertura del recipiente en un extremo de la sección y comprender cuidadosamente la fascia que rodea el recipiente con los fórceps.
   2. Hacer un corte con las tijeras paralela al recipiente deslizando la punta de la tijera debajo de la fascia elevada. Después de la incisión inicial, la grasa y los tejidos conectivos se pueden separar más lejos de la embarcación mediante la reducción de cada lado con las tijeras. Asegúrese de que los vasos son tan limpias como sea posible y reducir al mínimo la cantidad de tiempo que los buques pasan en el banquillo.
   3. Volver vasos sanguíneos para tubos de fresco tampón de Krebs-Henseleit y se almacenan a 4 ° C (muestras pueden permanecer almacenado durante un máximo de 24 horas después de la recolección y todavía producir datos válidos de la contractilidad).
   4. Utilizando una hoja de afeitar, buque rebanada que se utilizará en myograph en número deseado de secciones de 2 mm (que es útil usar una máquina de cortar el tejido para obtener secciones transversales consistentes).
   5. Examine cada sección bajo un sco de disecciónpe (ampliación 12.5X) para asegurar que cada sección tiene ninguna anormalidad, ramas, válvulas, o daños superficiales inadvertidamente hecho durante la disección y la limpieza. Reemplazar la sección de recipiente de si hay alguna anormalidad, rama, válvula, o daño superficial.
5. Secciones Tienda aceptables rodajas de buques (sumergidos en tampón Krebs-Henseleit) en hielo oa 4 ° C hasta que esté listo para el montaje en cámaras Myograph (generalmente <30 min).
6. Montar suavemente el recipiente en la myograph mediante la inserción de los soportes a través del lumen y aumentar la tensión (utilizando el microposicionador en el myograph) teniendo cuidado de no estirar los vasos por encima de un 2 a 3 g lectura.
7. Una vez que todas las cámaras están cubiertos, aspire el búfer de todas las cámaras y vuelva a llenar con 5,0 ml de tampón y se iniciará un temporizador de 15 minutos para comenzar el período de equilibrio y el experimento.

4. Experimento

1. Equilibrar todas las secciones de los vasos durante 1,5 horas para lograr una res establesting tensión de 1,0 g.
   1. Vuelva a colocar el tampón de incubación Krebs-Henseleit cada 15 min.
   2. Durante el equilibrado, constantemente ajustar la tensión en las secciones de los vasos sanguíneos hasta 2 g y se deja relajar hasta aproximadamente 0,80 g. Trate de no permitir que los vasos se relajen demasiado (que pueden salirse de las monturas). Trate de lograr una tensión de línea de base estable, donde el buque tiene 1 g de tensión sin necesidad de ajuste.
2. Durante el equilibrado, preparar una solución acuosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como una referencia.
3. Tras la finalización de un equilibrio satisfactorio, añadir 500 l de la solución de KCl 1,32 M para dar lugar a una solución 0,12 M en la solución de 5,5 ml de bañar el recipiente.
   1. Después de la adición de la M KCl 1,32, no ajustar la tensión manualmente como la respuesta máxima de esta adición se utiliza para evaluar la viabilidad del tejido y se puede utilizar para normalizar los datos de tratamiento (por ejemplo, las respuestas a una concentración de ungonist).
   2. Vuelva a colocar la memoria intermedia en intervalos de 15 minutos hasta que la tensión ha vuelto al valor basal de 1,0 g.
4. Una vez que se alcanza la línea de base, cambiar el tampón y comenzar simultáneamente un temporizador de 1 min. Haga esto para todas las cámaras al mismo tiempo para evitar un escalonamiento de las horas de inicio.
   1. Vortex el estándar que se añade y preparar un comentario para cámara 1 durante la cuenta regresiva 1 min.
   2. Añadir las normas en 25 ml de alícuotas a cada cámara como los dictados del experimento (esto mantiene el tratamiento por debajo del 0,5% del volumen total).
   3. Cuando se ha añadido la última norma, iniciar un temporizador 9 min.
   4. Al final de la incubación estándar de 9 min, eliminar el tampón que contiene el tratamiento de las cámaras y añadir 5,0 ml de tampón fresco, e iniciar el temporizador de 2,5 min.
   5. Repita el paso 4.4.4.
   6. Al final del segundo enjuague 2,5 minutos, aspirar las cámaras y añadir tampón nuevo, y comenzar un temporizador de 1 minuto la cuenta atrás del inicio de la segundad adición estándar.
5. Continuar este ciclo para todos adiciones estándar del día.
6. Durante la adición norma final y la posterior incubación 9 min preparar el compuesto de referencia M KCl 1,32 para una final de la adición de dosis de referencia de ejecución de 500 l.
7. Tras el intervalo de 1 min después de la adición tratamiento final, añadir el KCl y iniciar un temporizador 9 min.
   NOTA: La adición de KCl es para confirmar la viabilidad del tejido a la conclusión del experimento y es útil si la administración de un tratamiento que resulta en respuesta insignificante.
8. Al concluir el 9 min de incubación compuesto de referencia final, aspire o eliminar el tampón de todas las cámaras. No añadir tampón fresco. Concluir el experimento.
9. Guarde el archivo gráfico, eliminar secciones de los vasos sanguíneos y disponer de forma adecuada, y seguir el protocolo de limpieza (proporcionado por el fabricante y pueden ser específicas de laboratorio) para el equipo myograph.

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Resultados

Los vasos sanguíneos que se usa para generar los resultados incluidos se obtuvieron de 6 novillos Holstein (425 ± 8 kg) dentro de un intervalo de 3 semanas. Un ejemplo de un típico mesentérica respuesta contráctil a KCl vena y adiciones crecientes de tratamiento en la concentración se presenta en la Figura 2. La magnitud de la respuesta variará algunos con el tamaño de la embarcación (correlacionada con el tamaño del animal donante), pero puede también ser influido (negativamente) por un mane...

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Discusión

El desafío inicial en el desarrollo de este bioensayo fue el establecimiento de un punto de recogida repetible para la vasculatura mesentérica. Consistencia sitio de la muestra es crítica, ya que algunas de las funciones del cambio del intestino delgado durante la progresión desde el yeyuno a través del íleon y en consecuencia el mesenterio varían en un patrón similar. Las ramas ileales de la arteria mesentérica y la vena son los más fácilmente identificados a través de puntos de referencia anatómicos. Al u...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156