L'isolement et l'aide de sections d'encéphalopathie mésentérique artère et la veine comme les essais biologiques pour tester vasoactivité dans l'intestin grêle

Résumé

L'intestin grêle est fréquemment exposé à des toxines qui peuvent influer sur la circulation sanguine et un impact négatif sur l'absorption des nutriments. L'utilisation d'un multimyograph et l'artère mésentérique et la veine isolats, composés ou des toxines d'intérêt peut être projeté pour vasoactivité.

Résumé

Les systèmes gastro-intestinaux de mammifères sont constamment exposés aux composés (désirables et indésirables) qui peuvent avoir un effet sur le flux sanguin vers et à partir de ce système. Les changements dans le flux sanguin vers l'intestin grêle peuvent avoir des effets sur les fonctions de l'organe d'absorption. Intérêt particulier pour les toxines libérées de produits alimentaires par des processus de fermentation et la digestion a développé chez les ruminants comme un domaine où des économies productives pourraient être améliorées. La vidéo associée à cet article décrit un essai biologique in vitro mis au point pour sélectionner des composés pour vasoactivité dans des sections isolées de bovins artère mésentérique et la veine à l'aide d'un multimyograph. Une fois que les vaisseaux sanguins sont montés et équilibrés dans le myographe, l'essai biologique elle-même peut être utilisé: un outil de criblage pour évaluer la réponse contractile de la vasomotricité ou de composés d'intérêt; déterminer la présence de types de récepteurs de ciblage sur le plan pharmacologique avec des récepteurs spécifiques agonistes; déterminer le rôle d'un récepteur avec la présence d'un ou plusieurs antagonistes; ou déterminer les interactions potentielles de composés d'intérêt avec des antagonistes. Grâce à tout cela, les données sont collectées en temps réel, le tissu prélevé chez un seul animal peut être exposé à un grand nombre de différents traitements expérimentaux (un avantage in vitro), et représente le système vasculaire de chaque côté du lit capillaire pour fournir une précision image de ce qui pourrait se passer dans la afférents et efférents approvisionnement en sang soutenant l'intestin grêle.

Introduction

Modifications du débit sanguin à un lit de tissu peuvent avoir un impact important sur la fonction des organes. Une fonction primaire de l'intestin grêle est l'absorption des nutriments. Le débit sanguin artériel à la surface d'absorption de l'intestin est nécessaire pour l'augmentation de l'absorption et la circulation sanguine nutriments pour aider à l'absorption des nutriments comme digesta se déplace le long de la surface ^1. Une diminution du flux sanguin peut provoquer une réduction de l'absorption des nutriments en raison d'une diminution du gradient de transépithélial ^2. En plus de nutriments, l'intestin grêle peut également être exposé à des métabolites secondaires, des médicaments ou des toxines qui exercent un effet sur le flux sanguin localisé dans le mésentère. Dans le cas de l'animal ruminant, les composés peuvent être libérés à partir d'un aliment (par exemple, les nutriments, tels que des acides aminés, ou des toxines telles que les alcaloïdes de l'ergot) par l'intermédiaire des processus de fermentation de l'intestin antérieur. Si ces composés survivre le métabolisme microbien de la fermentation ruminale, ils sont maintenant disponibles pour l'absorptionou interaction en se déplaçant à travers le tractus gastro-intestinal de l'animal.

Il ya un certain nombre de différentes méthodes disponibles pour mesurer le débit sanguin in vivo (par exemple, l'échographie Doppler, qui habite débitmètres sanguins, les microsphères radiomarquées et techniques indicateur-dilution) qui permettent l'évaluation des différents scénarios expérimentaux ou traitements. Cependant, pour obtenir des informations sur les propriétés mécaniques ou pharmacologiques du muscle lisse vasculaire, les méthodes sont restées limitées aux grands navires jusqu'à Mulvany et Halpern ³ a publié un article décrivant une technique utilisant un fil monté préparations d'anneaux vasculaires dans un myographe. Depuis la mise au point de cette technique, des modifications continuent d'être apportées aux systèmes de myographe associés qui permettent une variété d'applications différentes pour l'évaluation des structures tubulaires. Le système a également été adapté pour utiliser des barres fixes pour le montage de plus grands navires ⁴ où perfusiontechniques ne sont pas souhaitées.

En raison de différences dans les vaisseaux d'origines et de distinctions anatomiques différents dans les mêmes bateaux de différentes espèces animales, des données de navire et type d'animal ne peut pas facilement être extrapolés à travers différents navires ou le même navire dans différents types de ⁵ animaux. Par conséquent, les essais biologiques distincts doivent être élaborés et validés à tout moment ces aspects sont modifiés. Récemment, plusieurs tests biologiques ont été développés avec ces technologies pour une utilisation chez les bovins veine latérale de la saphène et de l'artère et la veine ruminale droite ^6,7.

Ce dosage biologique a été développé pour étudier spécifiquement les effets que les alcaloïdes de l'ergot de support présentent sur le système vasculaire de l'intestin grêle. Il a été rapporté que 50-60% d'alcaloïdes nourris apparaissent dans le contenu de la caillette, mais seulement 5% sont récupérés dans les fèces ^8. Strickland et al. ⁹ a déclaré dans une revue de alcaloïdes de l'ergot, qui sugg de données disponiblesis que l'intestin grêle peut être le site le plus important pour l'absorption de ergopeptine. Eckert et al. ¹⁰ aspects biopharmaceutiques Avis alcaloïdes de l'ergot et a déclaré qu'une fois qu'ils traversent la barrière épithéliale, les alcaloïdes de l'ergot de seigle sont transportés soit par le système lymphatique de la veine sous-clavière ou via la veine mésentérique et dans le sang portail. Rhodes et al. ¹¹ fait état ​​d'une diminution du débit sanguin vers le duodénum et du côlon chez les bouvillons consommant une (haute alcaloïde de l'ergot de seigle) alimentation riche en endophytes infectés. Utilisation de l'artère et la veine essai biologique ruminale droite, Foote et al. ¹² ont démontré que les alcaloïdes de l'ergot de seigle sont vaso-actif dans le système vasculaire du rumen. Foote et al. Ensuite ¹³ ont démontré que l'exposition in vivo du rumen à alcaloïdes de l'ergot se traduit par un flux sanguin diminué épithéliale de rumen. Cette diminution du débit sanguin vers la surface d'absorption du rumen a provoqué une réduction concomitante en nutriments (acides gras volatils) flux. Compte tenu de la quantité de alcaloïdes de l'ergot de passage à l'intestin grêle de l'intestin antérieur; il a été émis l'hypothèse que le même effet sur le système vasculaire intestinal petit et l'absorption des nutriments pourrait se produire. Cela a nécessité le développement de l'artère mésentérique et la veine essai biologique de l'iléon proximal bovine.

Protocole

Les procédures utilisées dans cette étude n'avaient pas besoin de l'approbation de l'Université du Kentucky protection des animaux et l'utilisation Comité car aucun des animaux vivants ont été utilisés. Avant la collecte de tout échantillon utilisé ici, tous les animaux ont été assommés avec une tige perforante et vidés de leur sang. Ceci a été effectué dans un centre de abattoir inspecté par le gouvernement fédéral à l'Université du Kentucky. Un représentant officiel de la sécurité et de l'inspection des services alimentaires USDA observé toutes les activités qui traitent de l'animal vivant et la manipulation de la carcasse.

1 Préparation de l'Instrumentation

1. Pour minimiser la quantité de temps entre les collectes d'échantillons de tissus au début de l'expérience, mettre en place des équipements et préparer des tampons avant de recueillir le tissu expérimental (ou si le personnel supplémentaires sont disponibles, ces tâches peuvent se produire simultanément).
   NOTE: Ce ne fournit pas seulement la plus grande quantité de temps que le tissu reste viable pour mener des expériences, mais certainsexpériences peuvent fonctionner pendant de longues périodes de temps (ou il ya un désir de remplir de multiples expériences dans une journée), donc il est généralement souhaitable de commencer le plus tôt possible.
2. Allumez l'ordinateur associé, le matériel d'acquisition de données, bain d'eau (pour le tampon (s)) et myographe unité (s). Placez l'équipement d'étalonnage de l'appareil (s) de myographe et tournez à feu myographe (préréglée à 37,5 ° C) et permettre aux unités et d'étalonnage se réchauffer à la température préréglée.
   1. Ouvrez un fichier de paramètres du logiciel graphique créé précédemment sur l'ordinateur et commencer une course (mais pas l'acquisition de données).
3. Réchauffez-vous l'équipement pour 10 min.
   1. Lancer l'acquisition de données.
   2. Zéro tous les canaux.
   3. Vérifier et procéder à l'étalonnage (si nécessaire) de chaque canal (4 canaux par multimyograph) pour normaliser le signal électrique fourni par le transducteur de force respectif associé à ce canal d'une 2-g force fournie par un poids certifié.
   4. Après calibration et une conversion d'unités sont terminées, stocker toutes les données ultérieures que grammes. Modifier en conséquence en fonction des désirs de chaque laboratoire indépendant; le matériel et le logiciel permettent l'utilisation d'autres appareils, tels que milliNewtons et volts.
4. Assurez-vous que les conduites de gaz sont clairement des blocages et tourner sur l'approvisionnement en gaz (95% d'O _2/5% de CO ₂₎ à myographe (s) unités. Tous les tampons de gaz sans interruption (dans les chambres de myographe) pendant toute la procédure.
5. Remplir toutes les chambres de myographe avec 70% d'éthanol et laisser tremper pendant 10 minutes, éliminer l'éthanol, et répétez l'opération pour un deuxième 10 minutes de trempage.
   1. Après élimination de l'éthanol, rincer trois fois à l'eau déminéralisée, suivis par trois rinçages avec le tampon préparé (voir la section 2 pour la préparation de tampon), laissant la troisième addition de tampon dans les chambres.
      NOTE: A ce stade, l'équipement peut rester inactif dans cet état jusqu'à ce que le tampon et les tissus sont préparés et le personnel est prêt à procéder à des expérit.

2 Préparation des tampons

1. Préparer une solution de tampon de 1 L de Krebs-Henseleit à utiliser dans le transport et le traitement d'échantillons de tissus pour obtenir des concentrations finales de 11,1 mM de D-glucose; 1,2 mM _MgSO4; 1,2 mM KH ₂ PO _4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM de CaCl _2; 24,9 mM NaHCO _3.
   1. Mélanger 9,6 g de sels Krebs dans environ 900 ml d'eau déminéralisée sur une plaque d'agitation.
   2. Mélanger 0,373 g de dihydraté de chlorure de calcium, suivi par 2,1 g de bicarbonate de sodium par litre de tampon souhaitée.
   3. solution tampon de gaz pendant 20 min avec 95% O _2/5% CO _2.
   4. Après gazage, ajuster le pH à 7,05 (filtration de tampon pH augmente; pH final cible devrait être 7.4) et ajuster le volume à 1 L.
   5. Stériliser par filtration tampon dans un tampon propre autoclave de médias 1 L de la bouteille et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparer séparé Krebs-Hsolution tampon enseleit pour une utilisation dans des expériences de myographe comme décrit dans l'étape 2.1 pour le transport tampon Krebs-Henseleit avec des composés supplémentaires qui se rapportent aux expériences de contractilité.
   REMARQUE: En règle générale 2 L suffira pour les expériences décrites dans cet article, mais ce volume peut être augmenté ou réduit en fonction de la durée de l'expérience, le nombre de chambres de myographe, et le remplacement des tampons de nombre (par rapport aux ajouts de traitement).
   1. Préalablement à l'étape d'introduction de gaz (étape 2.1.3), ajouter 9,1 mg (par L de tampon en cours de préparation) de la désipramine-HCl à un tampon.
   2. Préparer une solution de propranolol HCl 1,0 uM et ajouter 1 ml (par L de tampon en cours de préparation) de cette solution à la solution de tampon de Krebs-Henseleit. Faire de cette mémoire tampon sur le jour de l'utilisation et conserver à une température de myographe exploitation (une température qui donne une température de 37,5 ° C dans le myographe).
      NOTE: La désipramine est ajouté à inhiber les mécanismes de la recapture de amine biogèneet permettre la compensation des ajouts expérimentales de la mémoire tampon baignant les vaisseaux sanguins à se produire plus rapidement. L'addition de propranolol empêche la liaison non spécifique de composés de traitement de β-adrénergiques.

3. prélèvement et la préparation de la vascularisation

1. Dès que possible, retirez le tractus gastro-intestinal de la carcasse. Une fois que l'animal ne présente plus aucun réflexe involontaire, enlever la tête et se cacher, puis soulever la carcasse verticalement. Suppression des viscères gastro-intestinal (œsophage à l'anus) de la carcasse doit être rempli par le personnel des abattoirs agréés (<20 min de temps de l'étourdissement).
   REMARQUE: Combien de temps, est généralement limitée par l'emplacement / installation où le tractus intestinal sont recueillis et de procédures normalisées d'exploitation ou des procédures prescrites par le gouvernement fédéral, suivi par le personnel de l'établissement.
   1. Dans la plupart des installations, effectuer des manipulations de l'appareil gastro-intestinalà un emplacement distinct de la transformation de la carcasse qui est destiné à entrer dans la chaîne alimentaire. Utilisez une proximité commode où le tractus gastro-intestinal peut être pris et étalé pour examen.
2. Une fois que le tractus gastro-intestinal est étalé, identifier l'intestin grêle, le pli iléo-caecale de liaison à l'intestin grêle caecum et le rebord s'étendant iléale proximale à la fois iléo-caecale (Figure 1A).
   1. L'utilisation d'un scalpel ou d'un couteau, faire une incision très légèrement dans la membrane du mésentère au centre de la bride de l'iléon. Avec deux doigts d'index, carrément disséquer le tissu adipeux et conjonctif exposer le système vasculaire mésentérique (figure 1B).
3. De cette bride ou d'un renflement dans le mésentère intestinal, disséquer plusieurs branches (~ 2 cm de longueur) de l'artère et la veine mésentériques faisceaux exposés qui prennent en charge cette partie de l'iléon (figure 1C).
   1. Si uchanter une pince pour saisir les tissus, prendre soin de ne pas saisir directement ou tirer sur les vaisseaux sanguins à tout en les enlevant comme une sorte d'étirement peut endommager et effectuer les performances du tissu ^14. l'enlèvement du vaisseau sanguin est préférable de faire, en coupant à travers chaque extrémité de la section à supprimer, puis coupe le long ou parallèlement à la section maintenant isolé. Pour plus de facilité, on peut enlever le tissu environnant ainsi que les navires de fournir un peu de tissu à saisir avec une paire de pinces.
   2. Avec une pince, plonger l'échantillon de tissu dans un tube contenant du tampon de Krebs-Henseleit froid glace et de stocker de la glace jusqu'à transformation peut se produire dans le laboratoire.
4. Placez échantillon de tissu sur une surface de coupe ou dans une boîte de Pétri et submerger partiellement glacée Krebs-Henseleit.
   1. Utilisation # 5 bijoutiers forceps, Noyes iris ciseaux et lampe loupe ou dissection portée (2.5 à 5.0x grossissement est suffisant), soigneusement disséquer le rappro graisse et ses environsve tissus et séparer l'artère et la veine. Identification de l'ouverture de l'enceinte à une extrémité de la section et de saisir soigneusement le fascia entourant le récipient avec des pinces.
   2. Faire une découpe avec des ciseaux parallèles à la cuve en faisant glisser la pointe du ciseau sous la planche de bord en relief. Après l'incision initiale, la graisse et les tissus conjonctifs peuvent encore être détachés du récipient en réduisant part et d'autre avec des ciseaux. Veiller à ce que les navires soient aussi propres que possible tout en minimisant la quantité de temps les navires passent sur le banc.
   3. Retour vaisseaux sanguins à des tubes de tampon et magasin de Krebs-Henseleit frais à 4 ° C (échantillons peuvent rester stockés jusqu'à 24 heures après la collecte et produire encore des données de contractilité valides).
   4. En utilisant une lame de rasoir, récipient de tranche à utiliser dans myographe en nombre voulu de sections de 2 mm (il est utile d'utiliser un limiteur de tissu pour obtenir des sections transversales uniformes).
   5. Examinez chaque section sous un sco de dissectionpe (12,5X grossissement) de veiller à ce que chaque section a aucune anomalie, des branches, des distributeurs ou des dommages superficiels fait par inadvertance lors de la dissection et de nettoyage. Remplacer la section du navire s'il ya une anomalie, branche, vanne, ou des dommages superficiels.
5. des sections de magasins acceptables tranches de navires (immergées dans un tampon de Krebs-Henseleit) sur de la glace ou à 4 ° C jusqu'au moment de monter dans des chambres de myographe (généralement <30 min).
6. Monter doucement le navire sur la myographe en insérant les supports à travers la lumière et augmenter la tension (en utilisant micropositionneur sur le myographe) en faisant attention de ne pas étirer les navires ci-dessus 2 à 3 g de lecture.
7. Une fois que toutes les chambres sont couvertes, vide le tampon de toutes les chambres et le remplir avec 5,0 ml de tampon et démarrer une minuterie 15 min pour commencer la période d'équilibrage et de l'expérience.

4 Expérience

1. Equilibrer toutes les sections du navire pendant 1,5 heure pour parvenir à une résolution stablesting tension de 1,0 g.
   1. Remplacer le tampon d'incubation de Krebs-Henseleit toutes les 15 min.
   2. Au cours de l'équilibrage, ajuster en permanence la tension sur les sections des vaisseaux sanguins jusqu'à 2 g et permettre ensuite de se détendre jusqu'à environ 0,80 g. Essayez de ne pas permettre aux navires de se détendre trop (ils peuvent glisser les supports). Essayez d'obtenir une tension de référence stable, où le navire est titulaire tension de 1 g sans nécessiter de réglage.
2. Au cours de l'équilibrage, de préparer une solution aqueuse 1,32 M de KCl à être utilisé en tant que référence.
3. Après la réalisation d'un équilibre satisfaisant, ajouter 500 ul de la solution 1,32 M de KCl pour donner lieu à une solution 0,12 M dans 5,5 ml de la solution baignant la cuve.
   1. Après l'addition de la 1,32 M de KCl, ne pas ajuster manuellement la tension dans la réponse maximale à partir de cette addition est utilisé pour évaluer la viabilité des tissus et peut être utilisé pour normaliser les données de traitement (par exemple les réponses à une concentration d'ungonist).
   2. Remplacez la solution à intervalles de 15 min jusqu'à ce que la tension est revenue à la valeur de référence de 1,0 g.
4. Une fois la ligne de base est atteint, changer le tampon et commencer simultanément un chronomètre de 1 min. Faites de même pour toutes les chambres en même temps pour éviter un étalement des heures de début.
   1. Vortex la norme à ajouter et préparer un commentaire pour la chambre 1 au cours de la 1 min compte à rebours.
   2. Ajouter les normes en aliquotes de 25 pi de chaque chambre que les impératifs de l'expérience (ce qui maintient le traitement inférieure à 0,5% du volume total).
   3. Lorsque le dernier type a été ajoutée, lancez une minuterie 9 min.
   4. A la fin de la 9 min d'incubation standard, retirer le tampon contenant traitement des chambres et ajouter 5,0 ml de tampon frais, et démarrer la minuterie de 2,5 min.
   5. Répétez l'étape 4.4.4.
   6. A la fin de la seconde 2,5 min rinçage, vide les chambres et ajouter un tampon frais, et commencer une minuterie 1 min le compte à rebours du début de la seconded addition d'étalon.
5. Continuer ce cycle pour l'ensemble des ajouts dosés de la journée.
6. Pendant l'addition de la norme définitive et après 9 minutes d'incubation préparer le composé de référence de 1,32 M de KCl à la fin de l'addition de la dose de référence de l'exécution de 500 pi.
7. Après l'intervalle de 1 min après l'addition finale de traitement, ajouter le KCl et commencer une minuterie 9 min.
   NOTE: L'addition de KCl est de confirmer la viabilité des tissus à la fin de l'expérience et est utile si l'administration d'un traitement qui conduit à une réponse négligeable.
8. A l'issue de la finale 9 min composé de référence incubation, aspirer ou éliminer le tampon de toutes les chambres. Ne pas ajouter de tampon frais. Conclure l'expérience.
9. Enregistrer le fichier graphique, supprimer des sections de vaisseaux sanguins et l'éliminer correctement, et suivre le protocole de nettoyage (fournie par le fabricant et peuvent être spécifiques laboratoire) pour les équipements de myographe.

Résultats

Les vaisseaux sanguins utilisés pour produire les résultats présentés ont été recueillies à partir de 6 bouvillons Holstein (425 ± 8 kg) dans un intervalle de 3 semaines. Un exemple d'une réponse veine contractile mésentérique typique de KCl et des additions de traitement de plus en plus la concentration est présenté sur la figure 2. L'ampleur de la réaction varie quelque avec la taille de la cuve (en corrélation avec la taille de l'animal donneur), mais peut également être ...

Discussion

Le premier défi dans le développement de cet essai biologique a été la création d'un site de collecte reproductible à la vascularisation mésentérique. L'uniformité du site d'échantillon est critique, car une partie des fonctions de la faible variation de l'intestin au cours de la progression à travers le jéjunum de l'iléon et du mésentère varient donc dans le même modèle. Les branches de l'iléon de artère mésentérique et la veine sont les plus faciles à identifier grâce à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156