バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

要約

小腸は、しばしば、血流に影響を与える負栄養吸収に影響を与える可能性が毒素に暴露される。 multimyographおよび腸間膜動脈および静脈の分離株を使用して、目的の化合物または毒素は、血管作用についてスクリーニングすることができる。

要約

哺乳類の胃腸システムが常にそのシステムへの及びからの血流に影響を与えることができる化合物（望ましい、望ましくない）にさらされている。小腸への血流の変化は、臓器の吸収機能への影響をもたらすことができる。発酵や消化過程を経て飼料から遊離する毒素に特に興味が生産的な効率を向上させることができる領域として反芻動物で開発しました。この記事に関連したビデオは、ウシ腸間膜動脈の単離断面の中で血管作用およびmultimyographを使用して静脈化合物をスクリーニングするために開発されたインビトロバイオアッセイを説明しています。血管が取り付けられ、ミオグラフで平衡化されると、バイオアッセイ自体を使用することができる。収縮反応または関心のある化合物の血管作用を評価するためのスクリーニングツールとして;薬理学的に特異的アゴニストでの受容体を標的とすることにより、受容体の種類の存在を決定するS;一つ以上のアンタゴニストの存在と受容体の役割を決定する。またはアンタゴニストで目的の化合物の潜在的な相互作用を決定する。このすべてを介して、データをリアルタイムで収集され、単一の動物から採取した組織は、異なる実験処理多数の（in vitroでの利点）に曝露し、かつ正確に提供するために毛細血管床の両側に脈管構造を表すことができ小腸をサポートする求心性と遠心性の血液供給で何が起こって何ができるかの絵。

概要

組織床への血流の変化は、臓器の機能に大きな影響を持つことができる。小腸の主な機能は、栄養吸収である。腸の吸収面への動脈血流が面¹に沿って移動する消化物として栄養吸収を助けるために、栄養吸収、血液の流れが増加するために必要とされる。血流の減少は、経上皮勾配²の減少に栄養吸収の低下を引き起こす可能性がある。栄養素に加えて、小腸はまた、腸間膜における局所血流量に対して効果を発揮する二次代謝産物、薬物、または毒素に曝露することができる。反芻動物の場合、化合物は、前腸の発酵過程を経て飼料（例えば、アミノ酸、またはそのような麦角アルカロイドなどの毒素として、例えば 、栄養素）から遊離させることができる。これらの化合物は第一胃発酵の微生物代謝を生き残るならば、彼らは今、吸収のために利用可能であるまたは相互作用それらは動物の胃腸管を通過する。

in vivoでの血流を測定するために利用可能多くの異なる方法がある（ 例えば 、ドップラー超音波、血液流量計、放射性標識ミクロスフェア、およびインジケータ希釈技術留置）は、さまざまな実験的なシナリオまたは治療の評価を可能にする。 Mulvanyおよびアルペルン^3は、ワイヤを用いる技術を記載する物品はミオグラフにおける血管リング標本をマウント公開までは、血管平滑筋の機械的または薬理学的特性に関する情報を得るためには、この方法は、大きな血管に制限されなかった。この技術の開発以来、改変は、管状構造を評価するためのさまざまなアプリケーションを可能に関連付けられたミオグラフシステムに対して行われ続ける。システムはまた、ここで灌流大きな血管^4を取り付けるための固定されたロッドを利用するように適合されている技術が望まれていません。

容器や動物型とは異なる動物の種、データから同じ血管内の異なる解剖起源との区別から血管内の非類似性のなので簡単に別の容器又は異なる動物タイプ⁵で同じ容器全体に外挿することはできない。このため、個別のバイオアッセイを開発し、これらの側面を変更した、いつでも検証する必要があります。最近、いくつかのバイオアッセイは、牛の横伏在静脈と右第一胃動脈と静脈^6,7で使用するためのこれらの技術で開発されてきた。

このバイオアッセイは、麦角アルカロイドが小腸を支える血管系に与える具体的影響を調査するために開発されました。これは、供給アルカロイドの50〜60％が第四胃の内容に表示されることが報告されたが、わずか5％が糞⁸で回収される。ストリックランドら ^9は 、麦角アルカロイドのレビューで、その利用可能なデータsuggを表明ESTは、小腸はergopeptine吸収のための最も重要な部位であり得ること。エッカートら麦角アルカロイドの¹⁰件のバイオ医薬品の態様およびそれらが上皮関門を通過後は、麦角アルカロイドが鎖骨下静脈または腸間膜静脈と門脈血液中にリンパ系のいずれかによって輸送されると述べた。ローズら ^11は、高エンドファイト感染（高麦角アルカロイド）の食事を消費する去勢牛十二指腸、大腸への血流の減少を報告した。右第一胃動脈と静脈バイオアッセイを用いて、フットら ^12は、麦角アルカロイドは、第一胃血管系内の血管作動性であることを実証した。フットら ^13は、続いて、in vivoで実証し減少し、第一胃上皮の血流の麦角アルカロイド結果と第一胃の暴露。第一胃の吸収面への血流の減少は、同時に栄養（揮発性脂肪酸）フラックスの減少を引き起こした。屈原を考える前腸から小腸への継承麦角アルカロイドのantity;それは小腸血管系および栄養吸収に対する同様の効果が発生するという仮説が立てられた。これはウシの近位回腸腸間膜動脈と静脈バイオアッセイの開発を必要とした。

プロトコル

全く生きた動物を使用しなかったため、この研究で使用した手順は、ケンタッキー州動物実験委員会の大学からの承認を必要としませんでした。本明細書中で使用される任意の試料の採取前に、すべての動物は、キャプティブボルトを唖然と放血させた。これは、ケンタッキー大学の連邦政府の検査食肉処理施設で行った。米国農務省食品安全検査局の公式代表がカーカスの生きた動物や取り扱いに対処するすべての活動を観察した。

計装の調製

1. 実験の開始に組織サンプルの収集の間の時間、セットアップ機材を最小限にし、（追加の人員が利用可能である場合、または、これらのタスクが同時に発生する可能性があります）は、実験の組織を収集する前にバッファを準備するには。
   注：これは組織が実験を行うために生存し続ける時間の最大量を提供していますが、一部だけでなく、したがって、それが早くも実現可能なように使い始めることが通常望ましいが、実験が長時間にわたって実行することができます（または、一日に複数の実験を完了することが望まれている）。
2. パワーアップに関連するコンピュータ、データ取得装置、水浴（バッファ（複数可）用）およびミオグラフユニット（複数可）。ミオグラフユニット（複数可）上で校正装置を配置し、温度をプリセットに温めユニットと校正装置を（37.5℃にプリセット）ミオグラフ熱をオンにして可能にします。
   1. コンピュータ上で以前に作成したグラフのソフトウェアの設定ファイルを開き、実行を開始する（ただし、データを取得していない）。
3. 10分のための機器をウォームアップ。
   1. データの取得を開始します。
   2. ゼロすべてのチャンネル。
   3. 確認し、認定された重量によって供給された2-G力に、そのチャンネルに関連するそれぞれの力変換器から供給される電気信号を標準化するために、各チャネル（multimyographあたり4チャネル）上で（必要な場合）、キャリブレーションを実施しています。
   4. キャリブレーションと単位変換後のグラムとして、後続のすべてのデータを格納する、完成されている。各個別の研究室の要望に基づいて、それに応じて変更します。機器およびソフトウェアは、ミリニュートンやボルトのような他のユニットの使用を可能にする。
4. ガスラインは、閉塞の明確であることを確認し、（複数の）単位をミオグラフへのガス供給（95％O _{2/5％CO 2）}をオンにします。継続的に全体の手順の間（ミオグラフチャンバー内の）すべてのバッファをガス。
5. 70％エタノールですべてミオグラフチャンバーを記入し、10分間浸し、エタノールを除去し、ソーク第10分間繰り返します。
   1. エタノールを除去した後、チャンバ内のバッファの第三の加算を残して、準備されたバッファ（バッファを調製するための第2節を参照）で3回リンスに続いて脱イオン水で3回リンス。
      注：バッファおよび組織が準備されるまで、この時点で機器がこの状態のアイドル状態を維持することができ、スタッフはexperimenを続行する準備ができているトン。

バッファの調製

1. 11.1 mMのD-グルコースの最終濃度を達成するために、組織サンプルの輸送および処理に使用するための1 Lクレブス - ヘンゼライト緩衝液を準備し; 1.2 mMの_4を硫酸マグネシウム; 1.2mMのKH ₂ PO _4; 4.7のKCl; 118.1のNaCl; 3.4のCaCl _2; 24.9のNaHCO _3。
   1. 撹拌プレート上に約900ミリリットルの脱イオン水にクレブス塩9.6グラムを混ぜる。
   2. 必要なバッファー1L当たり2.1グラムの重炭酸ナトリウムに続いて0.373グラムの塩化カルシウム水和物で混ぜる。
   3. 95％O _{2/5％CO 2}で20分間ガス緩衝液。
   4. L.及び1に音量を調節;ガス処理後、7.05のpHを調整（最終目標pHは7.4であるべきバッファの濾過は、pHを増加させる）
   5. フィルターは使用するまで4℃でクリーンなオートクレーブ処理1 L培地ボトルとストアバッファにバッファを滅菌する。
2. 独立したクレブス-Hを準備ミオグラフ実験で使用するためのenseleit緩衝溶液収縮実験に関連する追加の化合物との交通クレブス - ヘンゼライトバッファにステップ2.1で説明したように。
   注：一般的に、2Lは、この資料に記載された実験のために十分であろうが、このボリュームは、実験の長さに基づいて増減する必要があるかもしれない、ミオグラフ室の数、および（治療の追加に関して）番号バッファの交換。
   1. ガス発生段階（ステップ2.1.3）の前に、バッファリングするデシプラミン塩酸の9.1 mgの（バッファ1L当たり準備中）を追加します。
   2. プロプラノロール塩酸1.0μMの溶液を調製し、クレブス - ヘンゼライト緩衝溶液にこの溶液（バッファー1L当たり準備中）1ミリリットルを追加します。利用当日にこのバッファを作成し、ミオグラフ動作温度（ミオグラフに37.5℃の温度が得温度）で維持する。
      NOTE：デシプラミンは、生体アミンの再取り込み機構を阻害するために添加されそしてより急速に起こることが、血管の入浴バッファからの実験の追加のクリアを可能にする。プロプラノロールの追加は、βアドレナリン受容体をすることが、治療化合物の非特異的結合を防ぐことができます。

血管系の3。収集と準備

1. できるだけ早く、死体からの消化管を取り外します。動物はもはや不随意反射を呈すると、頭を削除せず、非表示にしてから縦にカーカスを上げる。死体からの胃腸内臓（肛門まで食道）の除去は、（素晴らしい時から<20分）承認された食肉処理場の担当者が完了する必要があります。
   注：どのくらいで、一般的に腸管から採取し、標準作業手順や施設の担当者に続いて連邦政府が義務付け手続きされている場所/施設によって制限されます。
   1. ほとんどの施設では、消化管の操作を行って食料供給を入力するように運命づけられているカーカスの処理とは別の場所にある。消化管を採取し、検査のために展開することができ、近くの便利な場所に使用します。
2. 消化管が広げられると、小腸、盲腸に小腸を接続回盲倍、回盲倍（ 図1A）の近位に延びる回腸フランジを識別する。
   1. メスまたはナイフを使用して、非常に軽く回腸フランジの中心部にある腸間膜膜に切開する。 2つのインデックスの指を使って、ぶっきらぼうに腸間膜血管系（ 図1B）を露光脂肪および結合組織を離れて解剖。
3. 腸間膜内のこのフランジまたは膨らみから、回腸（ 図1C）のこの部分をサポートして露出した腸間膜動脈と静脈の束の複数のブランチ（長さ約2センチ）を解剖する。
   1. uの場合は組織を把持する鉗子を歌う、直接把握したり損傷し、否定的に組織のパフォーマンス^14に影響^を与え得るストレッチの任意の並べ替えとして、それらを除去しながら、全くの血管を引っ張らないように注意してください。血管除去が最良除去すべき部分のそれぞれの端を横断してから、今孤立セクションに沿って配置したり、平行に切断することによって、行われます。簡単にするために、ピンセットで把握するいくつかの組織を提供するために、船と一緒に周囲の組織の一部を削除。
   2. ピンセットで、氷冷クレブス - ヘンゼライト緩衝液を含むチューブ内に組織サンプルを沈め、処理が、実験室で発生する可能性まで氷上で保存する。
4. 切断面やペトリ皿に組織サンプルを配置し、部分的に氷冷クレブス - ヘンゼライトに水没。
   1. スコープ＃5宝石商鉗子、ノイスアイリスはさみを使用して、ランプを拡大または解剖、慎重に周囲の脂肪とconnectiを離れて解剖（5.0X倍率に2.5で十分です）組織をVEの動脈と静脈を分離する。部分の一端で容器開口部を特定し、慎重に鉗子で血管の周囲の筋膜を把握する。
   2. ハサミでカットが提起筋膜の下にはさみの先端をスライドさせて、容器に平行にしてください。最初の切開の後、脂肪および結合組織をさらにハサミでいずれかの側を下に切断することによって容器から取り外すことができる。血管がベンチに費やす時間の量を最小限に抑えながら、船は、可能な限りクリーンであることを確認します。
   3. （サンプルは採取後、最大24時間保存され、まだ有効な収縮データを作成されたまますることができます）、4℃で新鮮なクレブス - ヘンゼライトバッファとストアのチューブに血管を返します。
   4. カミソリの刃を使用して、スライス容器は2mmの断片の所望の数にミオグラフに使用する（これは、一貫した断面を得るために、組織スライサーを使用すると便利である）。
   5. 解剖SCOの下で、各セクションを調べますPE（12.5X倍率）は、各セクションが誤って解剖し、洗浄中に行わない異常、枝、バルブ、あるいは表面的な損傷がないことを確認します。異常、支店、バルブ、あるいは表面的な損傷がある場合には、血管部分を交換してください。
5. （クレブス - ヘンゼライト緩衝液中に沈め）お店許容可能なスライス血管セクション氷の上または4℃でミオグラフ室（通常は<30分）に取り付ける直前まで、。
6. 静かに2〜3グラムの読みの上血管を伸ばさないように注意しながら（ミオグラフにマイクロポジショナーを使用して）管腔を通って支柱を挿入することによりミオグラフに容器をマウントし、緊張を高める。
7. すべてのチャンバが覆われると、全てのチャンバからバッファ真空とバッファの5.0ミリリットルを補充し、平衡期間、実験を開始するために、15分のタイマーを開始する。

4。実験

1. 安定した解像度を達成するために1.5時間、すべての血管のセクションを平衡化1.0グラムのティン張力。
   1. クレブス - ヘンゼライトインキュベーション緩衝液を15分毎に交換してください。
   2. 平衡時には、常に2グラムまでの血管セクションの張力を調整した後、約0.80グラムまで緩和することを可能にする。血管が（彼らはマウントを滑り落ちる場合があります）あまりリラックスすることができないようにしてください。容器は、調整を必要とせずに1グラム張力を保持している安定したベースラインの張力を達成してみてください。
2. 平衡時には、基準となるのKCl水溶液1.32 M溶液を調製。
3. 満足な平衡が完了した後、容器の入浴5.5ミリリットル溶液中の0.12モル溶液をもたらすと1.32 MのKCl溶液500μlを加える。
   1. この添加から最大応答は、組織の生存率を評価するために使用され、治療データを正規化するために使用することができるように1.32 M KClを添加した後、a側に（手動で例えば、濃度応答の張力を調節しないgonist）。
   2. 張力が1.0グラムのベースライン値に戻るまで15分間隔でバッファを交換してください。
4. ベースラインに到達すると、バッファを変更すると同時に、1分タイマーを開始する。開始時間の驚異を回避するために、同時に全てのチャンバのためにこれを行います。
   1. 追加される標準をボルテックスし、1分間のカウントダウン中にチャンバ1のコメントを準備します。
   2. （これは全体積の0.5％以下の治療を続ける）実験おもむくまま、各チャンバーに25μlのアリコートに基準を追加します。
   3. 最後の規格が追加されている場合には、9分タイマーを開始します。
   4. 9分、標準インキュベーションの最後に、チャンバーから治療を含む緩衝液を除去し、新鮮な緩衝液5.0mlのを追加し、2.5分タイマーを開始します。
   5. 繰り返し手順4.4.4。
   6. 第2.5分すすぎの最後に、チャンバーを真空、新鮮な緩衝液を追加し、seconの開始をカウントダウンするために1分間のタイマーを開始dの標準添加。
5. 一日の標準添加のすべてについて、このサイクルを繰り返します。
6. 最終基準の添加およびその後の9分間のインキュベーションの間に500μlに実行参照用量添加の終わりのための1.32 MのKCl参照化合物を準備します。
7. 最終処理を添加した後1分間隔の後に、塩化カリウムを追加し、9分タイマーを開始します。
   注：塩化カリウムの添加は、実験の終了時に組織生存を確認することであり、無視できる応答をもたらす治療を施す場合に便利です。
8. 最後の9分間の参照化合物のインキュベーションの終了時に、真空またはチャンバーのすべてのバッファを削除します。新鮮なバッファーを追加しないでください。実験を締結。
9. チャートファイルを保存し、血管のセクションを削除し、適切に処分する、とミオグラフ機器にクリーンアッププロトコル（製造業者によって提供され、実験室に特異的であり得る）に従う。

結果

含まれる結果を生成するために使用される血管は、3週間の間隔内で6ホルスタインの去勢牛（425±8キロ）から収集した。 KClおよび濃度の増加の治療の追加の典型的な腸間膜静脈収縮反応の例は、応答の大きさは、（ドナー動物の大きさと相関する）を容器のサイズに一部変化する。 図2に提示するだけでなく、缶れる回収·洗浄中に血管の（延伸）不適切な取り扱いによって（負?...

ディスカッション

このバイオアッセイの開発における最初の課題は、腸間膜血管系のための反復可能な収集場所の設立だった。回腸を通じて空腸からの進行の間の小腸の変化と、その結果腸間膜の機能のいくつかは同じようなパターンで変化するように、サンプルサイトの一貫性は、非常に重要です。腸間膜動脈と静脈の回腸枝は最も容易に解剖学的なランドマークを介して同定された。盲腸の位置を特定し?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156