Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

Resumo

O intestino delgado é freqüentemente expostos a toxinas que podem influenciar o fluxo sanguíneo e impactar negativamente a absorção de nutrientes. Usando uma artéria mesentérica e multimyograph e veia isolados, os compostos de interesse ou toxinas podem ser rastreados para a vasoactividade.

Resumo

Sistemas gastrointestinal de mamíferos são constantemente expostos a compostos (desejáveis ​​e indesejáveis) que podem ter um efeito sobre o fluxo de sangue para ea partir desse sistema. Alterações do fluxo sanguíneo para o intestino delgado podem resultar em efeitos nas funções de absorção do órgão. Interesse particular em toxinas liberadas a partir de alimentos através de processos fermentativos e digestivos desenvolveu em ruminantes como uma área onde a eficiência produtiva pode ser melhorada. O vídeo associado a este artigo descreve um ensaio biológico in vitro desenvolvido para compostos de tela para vasoactividade em isolados secções transversais da artéria mesentérica bovina e veia utilizando um multimyograph. Uma vez que os vasos sanguíneos são montados e equilibrada no myograph, o próprio bioensaio pode ser usado: como ferramenta de triagem para avaliar a resposta contrátil ou vasoactividade de compostos de interesse; determinar a presença de tipos de receptores por receptores farmacologicamente alvo com agonista específicos; determinar o papel de um receptor com a presença de um ou mais antagonistas; ou determinar interações potenciais de compostos de interesse com antagonistas. Através de tudo isso, os dados são recolhidos em tempo real, de tecido recolhida a partir de um único animal pode ser exposto a um grande número de diferentes tratamentos experimentais (uma vantagem in vitro), e representa a vasculatura de cada lado do leito capilar para fornecer uma exacta imagem do que poderia estar acontecendo no aferentes e eferentes fornecimento de sangue apoiando o intestino delgado.

Introdução

Alterações no fluxo sanguíneo para uma cama de tecido pode ter um grande impacto sobre a função do órgão. Uma função primária do intestino delgado é a absorção de nutrientes. O fluxo de sangue arterial para a superfície de absorção do intestino é necessária para a absorção de nutrientes e aumentar o fluxo sanguíneo para ajudar a absorção de nutrientes como digesta se move ao longo da superfície ^1. A diminuição do fluxo de sangue pode causar uma redução na absorção de nutrientes devido a uma diminuição do gradiente transepitelial ^2. Em adição aos nutrientes, o intestino delgado, podem também ser expostos a metabolitos secundários, drogas, toxinas ou que exercem um efeito sobre o fluxo sanguíneo localizado no mesentério. No caso de o animal ruminante, os compostos podem ser libertados a partir de um ingrediente alimentar (por exemplo, nutrientes, tais como aminoácidos, ou toxinas, tais como os alcalóides da cravagem do centeio) por meio de processos de fermentação do intestino anterior. Se estes compostos sobreviver ao metabolismo microbiano de fermentação ruminal, eles estão agora disponíveis para a absorçãoou interacção enquanto viajam através do tracto gastrointestinal do animal.

Há um número de métodos diferentes disponíveis para medir o fluxo de sangue, in vivo (por exemplo, ultra-som Doppler, residindo medidores de fluxo de sangue, microesferas radiomarcados, e técnicas de diluição-indicador) que permitem a avaliação de vários cenários ou tratamentos experimentais. No entanto, para obter informações sobre as propriedades mecânicas ou farmacológicas do músculo liso vascular, métodos permaneceu limitado a navios de grande porte até Mulvany e Halpern ³ publicou um artigo descrevendo uma técnica usando o fio montado preparações anel vascular em um myograph. Desde o desenvolvimento da técnica, modificações continuam a ser feitos para os sistemas myograph associados que permitem uma variedade de aplicações diferentes, para avaliação de estruturas tubulares. O sistema também foi adaptado para utilizar hastes fixas para montagem de navios de maior porte ^4, onde a perfusãotécnicas não são desejados.

Por causa de diferenças nos vasos de diferentes origens anatômicas e distinções nas mesmas embarcações de diferentes espécies de animais, dados da embarcação e tipo de animais não podem ser facilmente extrapolados em diferentes recipientes ou na mesma embarcação em diferentes tipos de animais ^5. Consequentemente, bioensaios separadas devem ser desenvolvidos e validados a qualquer momento estes aspectos são alterados. Recentemente, vários bioensaios foram realizados com estas tecnologias para uso em bovinos laterais da veia safena e artéria e veia ruminal ^6,7.

Este bioensaio foi desenvolvido especificamente para investigar os efeitos de que alcalóides da cravagem do centeio tem na vasculatura de suporte do intestino delgado. Foi relatado que 50-60% dos alcalóides alimentados aparecem no abomaso conteúdo, mas apenas 5% são recuperadas nas fezes ^8. Strickland et al. ⁹ afirmou em uma revisão de alcalóides da cravagem do centeio, que sugg dados disponíveisest que o intestino delgado pode ser o local mais importante para a absorção ergopeptine. Eckert et al. ¹⁰ aspectos biofarmacêuticos avaliação de alcalóides da cravagem do centeio e afirmou que, assim que atravessar a barreira epitelial, alcalóides da cravagem do centeio, são transportados pelo sistema linfático para a veia subclávia ou via veia mesentérica e em sangue portal. Rhodes et al. ¹¹ relataram uma diminuição do fluxo sanguíneo para duodeno e cólon em novilhos consumindo uma (alta alcalóide da cravagem do centeio) dieta rica infectadas pelo endófito. Usando o bioensaio artéria e veia ruminal direita, ¹² Foote et al. Demonstraram que alcalóides da cravagem do centeio são vasoativas na vasculatura ruminal. Foote et al. ¹³ subsequentemente demonstrado in vivo de que a exposição do rúmen de alcalóides da cravagem do centeio resulta em uma diminuição do fluxo de sangue no rúmen epitelial. Esta diminuição no fluxo do sangue para a superfície de absorção do rúmen concomitante causou uma redução de nutrientes (ácido gordo volátil) de fluxo. Dada a quantity de alcalóides da cravagem do centeio que passam para o intestino delgado do intestino anterior; foi formulada a hipótese de que um efeito semelhante na vasculatura do intestino delgado e a absorção de nutrientes ocorreria. Isto exigiu o desenvolvimento do bioensaio artéria mesentérica e na veia do íleo proximal bovina.

Protocolo

Os procedimentos utilizados neste estudo não necessitam de aprovação da Universidade de Kentucky Animal Care e do Comitê Use porque há animais vivos foram usados. Antes da coleta de uma amostra aqui utilizada, todos os animais foram atordoados com um parafuso prisioneiro e sangrar. Este foi realizado em um abatedouro inspecionado pelo governo federal, da Universidade de Kentucky. Um representante oficial do USDA Food Safety Inspection Service e observado todas as atividades que lidavam com o animal vivo e manuseio da carcaça.

1 Preparação de Instrumentação

1. Para minimizar a quantidade de tempo entre as colheitas das amostras de tecido para o início de uma experiência, montaram equipamentos e preparar tampões antes da recolha de tecidos experimental (ou, se o pessoal adicionais estão disponíveis, estas tarefas podem ocorrer simultaneamente).
   NOTA: Isto não só fornece a maior quantidade de tempo que o tecido permanece viável a realização de experiências, mas algunsexperimentos podem funcionar por longos períodos de tempo (ou há um desejo de completar várias experiências em um dia), portanto, é geralmente desejável para começar o mais cedo possível.
2. Ligue o computador associado, aquisições de dados de equipamentos, banho de água (para tampão (s)) e myograph unidade (s). Coloque o equipamento de calibração na unidade (s) myograph e ligue calor myograph (predefinido para 37,5 ° C) e deixe as unidades e equipamentos de calibração para aquecer para programar temperaturas.
   1. Abra um arquivo de configurações de software Chart previamente criado no computador e começar a correr (mas não a aquisição de dados).
3. Aqueça o equipamento durante 10 minutos.
   1. Comece a aquisição de dados.
   2. Zero todos os canais.
   3. Verifique, e realizar a calibração (se necessário) em cada canal (4 canais por multimyograph) para padronizar o sinal elétrico fornecido a partir do transdutor de força respectivo associado a esse canal para uma força de 2 g fornecido por um peso certificado.
   4. Após a calibração e uma conversão de unidades sejam concluídas, armazenar todos os dados subsequentes como gramas. Mudar de acordo com base em desejos de cada laboratório separado; o equipamento e software de permitir a utilização de outras unidades, tais como milinewtons e volts.
4. Certifique-se de que as linhas de gás são livre de bloqueios e ligue fornecimento de gás (95% _{de O2} / 5% CO ₂₎ para myograph (s) unidades. Continuamente gás Os tampões (nas câmaras myograph) durante todo o procedimento.
5. Preencha todas as câmaras myograph com etanol 70% e deixe de molho por 10 minutos, remover o etanol, e repita para uma segunda 10 min de molho.
   1. Após a remoção do etanol, enxaguar três vezes com água desionizada, seguido por três lavagens com tampão preparado (ver secção 2 para a preparação de tampão), deixando a terceira adição de tampão nas câmaras.
      NOTA: Neste ponto, o equipamento pode permanecer ociosa nesse estado até tampão e tecido são preparados e equipe está pronta para prosseguir com os experiment.

2 Preparação de Buffers

1. Prepara-se uma solução tampão de 1 L de solução de Krebs-Henseleit para o uso no transporte e processamento de amostras de tecidos, para atingir concentrações finais de 11,1 mM de D-glicose; 1,2 mM _MgSO4; 1,2 mM _de KH ₂ PO _4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM _CaCl2; 24,9 mM de NaHCO _3.
   1. Misture 9,6 g de sais de Krebs em aproximadamente 900 ml de água desionizada sobre uma placa de agitação.
   2. Misturar 0,373 g de cloreto de cálcio di-hidratado, seguido por bicarbonato de sódio a 2,1 g por L de solução tampão pretendida.
   3. Solução tampão de gás durante 20 minutos com 95% _O2 / 5% de CO _2.
   4. Depois de gaseamento, ajustar o pH para 7,05 (filtração de tampão aumenta o pH; pH meta final deve ser 7,4) e ajustar o volume a 1 L.
   5. Filtrar esterilizar tampão para um tampão de armazenamento de garrafas e limpo autoclavado 1 L mídia a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
2. Prepare separada de Krebs-Hsolução tampão enseleit para utilização em experiências myograph como descrito no passo 2.1 para o transporte de tampão de Krebs-Henseleit com compostos adicionais que se referem às experiências de contractilidade.
   NOTA: 2 L Tipicamente será suficiente para experiências descritas neste artigo, mas este volume pode necessitar de ser aumentada ou reduzida com base na duração da experiência, o número de câmaras myograph, e substituições de tampão (em relação ao número de adições de tratamento).
   1. Antes do passo de gaseificação (passo 2.1.3), adicionar 9,1 mg (por L de solução tampão a ser preparado) da desipramina-HCl para tamponar.
   2. Prepara-se uma solução de propranolol-HCl 1,0 uM e adicionar 1 ml (por L de solução tampão a ser preparado) desta solução para a solução tampão de Krebs-Henseleit. Faça este tampão no dia da utilização e mantenha a temperaturas myograph operando (uma temperatura que produz uma temperatura de 37,5 ° C no myograph).
      NOTA: A desipramina é adicionado para inibir os mecanismos selectivos da recaptação de aminas biogênicase permitir a compensação de acréscimos experimentais do buffer que banham os vasos sanguíneos a ocorrer mais rapidamente. A adição de propranolol impede a ligação não específica de compostos de tratamento para β-adrenérgicos.

3 Coleta e Preparação da vasculatura

1. Tão rapidamente quanto possível, remover o tracto gastrointestinal a partir da carcaça. Uma vez que o animal não apresenta qualquer reflexo involuntário, retire a cabeça e esconder e, em seguida, levantar a carcaça verticalmente. A remoção das vísceras gastrointestinal (esôfago até o ânus) na carcaça deve ser concluído até o pessoal de matadouros aprovados (<20 min de tempo de atordoamento).
   NOTA: Em quanto tempo, é geralmente limitada pela localização / instalação onde o trato intestinal está sendo coletado e de procedimentos operacionais padrão ou procedimentos mandato federal seguidos pelos funcionários do local.
   1. Na maioria das instalações, realizar manipulações do tracto gastrintestinal, num local distinto do tratamento da carcaça que está destinado a entrar na cadeia alimentar. Use uma localização próxima conveniente, onde o trato gastrointestinal podem ser tomadas e espalhar-se para o exame.
2. Uma vez que o tracto gastrointestinal é espalhado, identificar o intestino delgado, a dobra de ligação ileocecal do intestino delgado ao ceco, e estendendo-se o flange do íleo proximal à prega ileocecal (Figura 1A).
   1. Usando um bisturi ou uma faca, muito levemente fazer uma incisão na membrana mesentérica no centro da flange ileal. Usando dois dedos indicadores, sem rodeios dissecar longe do tecido adiposo e conjuntivo expondo a vasculatura mesentérica (Figura 1B).
3. Deste flange ou protuberância no mesentério intestinal, dissecar vários ramos (~ 2 cm de comprimento) dos feixes de artéria e veia mesentérica expostos que suportam esta parte do íleo (Figura 1C).
   1. Se ucantar uma pinça para agarrar tecido, tome cuidado para não captar diretamente ou puxe os vasos sanguíneos em tudo, removendo-os como qualquer tipo de alongamento pode causar danos e afetar negativamente o desempenho do tecido ^14. Remoção do vaso sanguíneo é melhor realizado, por corte ao longo de cada extremidade da secção a ser removida e, em seguida, o corte ao longo ou paralelamente à secção agora isolado. Para maior facilidade, remova uma parte do tecido circundante, juntamente com os vasos para fornecer algum tecido para agarrar com um par de fórceps.
   2. Com um par de fórceps, submergir amostra de tecido num tubo contendo tampão frio de Krebs-Henseleit gelada e armazenar em gelo até que o tratamento pode ocorrer no laboratório.
4. Colocar a amostra de tecido sobre uma superfície de corte ou de uma placa de petri e submergir parcialmente em gelo frio de Krebs-Henseleit.
   1. Usando # 5 joalheiros fórceps, Noyes íris tesoura e ampliação lâmpada ou dissecar escopo (2,5 a ampliação 5.0X é suficiente), dissecar cuidadosamente afastado o connecti gordura e envolventeve tecidos e separar a artéria e veia. Identificando a abertura vaso em uma extremidade da secção e cuidadosamente compreender a fáscia em torno do vaso, com a pinça.
   2. Fazer um corte com a tesoura paralela ao recipiente fazendo deslizar a ponta da tesoura por baixo da fáscia levantada. Após a incisão inicial, a gordura e os tecidos conjuntivos podem ser ainda isolada a partir do recipiente através da redução com um ou outro lado da tesoura. Certifique-se de que os vasos são tão limpas quanto possível, minimizando a quantidade de tempo que os navios passam no banco.
   3. Voltar vasos sanguíneos para tubos de tampão Krebs-Henseleit fresco e armazenar a 4 ° C (amostras podem permanecer armazenadas por até 24 horas após a coleta e ainda produzir dados de contratilidade válidos).
   4. Usando uma lâmina de barbear, vaso fatia a ser utilizado em myograph em número desejado de secções de 2 mm (isto é útil para usar um fatiador de tecidos para se obter secções transversais consistentes).
   5. Examine cada seção em uma sco de dissecaçãope (ampliação 12,5X) para garantir que cada seção tem nenhuma anormalidade, ramos, válvulas ou dano superficial, inadvertidamente, feito durante a dissecção e limpeza. Substituir seção do navio, se houver qualquer anormalidade, filial, válvula, ou dano superficial.
5. Armazenar aceitáveis ​​secções cortadas dos vasos submersos (em tampão de Krebs-Henseleit) em gelo ou a 4 ° C até pronto para montagem em câmaras myograph (geralmente <30 minutos).
6. Suavemente montar o recipiente na myograph inserindo os suportes através do lúmen e aumentar a tensão (usando o microposicionador na myograph) tendo o cuidado de não esticar os navios acima de uma leitura de 2 a 3 g.
7. Uma vez que todas as câmaras são cobertos, aspirar o tampão de todas as câmaras e reabastecer com 5,0 ml de tampão e iniciar um temporizador de 15 minutos para começar o período de equilíbrio e experiência.

4. Experiment

1. Equilibrar todas as seções da embarcação durante 1,5 horas para conseguir uma res estáveisting tensão de 1,0 g.
   1. Substituir o tampão de incubação Krebs-Henseleit a cada 15 min.
   2. Durante o equilíbrio, ajustar constantemente a tensão nas seções dos vasos sanguíneos até 2 g e deixa-se relaxar para baixo para cerca de 0,80 g. Tente não permitir que os navios para relaxar demais (eles podem escorregar as montagens). Tente alcançar um linha de base estável da tensão, quando o recipiente contém 1 g de tensão sem a necessidade de ajustamento.
2. Durante o equilíbrio, preparar uma solução aquosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como uma referência.
3. Após a conclusão de um equilíbrio satisfatório, adicionar 500 mL de solução 1,32 M de KCl para se obter uma solução 0,12 M em 5,5 ml da solução que banha o navio.
   1. Após a adição de 1,32 M de KCl, não ajustar manualmente a tensão como a resposta máxima a partir desta adição é usada para avaliar a viabilidade do tecido e pode ser usado para normalizar os dados de tratamento (por exemplo, respostas a uma concentração de umgonist).
   2. Substituir o tampão em 15 minutos de intervalo até que a tensão voltou ao valor inicial de 1,0 g.
4. Depois da linha de base é atingido, mudar o tampão e, simultaneamente, iniciar um temporizador de um minuto. Faça isso para todas as câmaras em simultâneo para evitar um escalonamento de horários de início.
   1. Vortex o padrão a ser adicionado e preparar um comentário a câmara 1 durante a 1 min de contagem regressiva.
   2. Adicionar as normas em 25 mL alíquotas de cada uma das câmaras, como os ditames experimentais (isto mantém o tratamento abaixo de 0,5% do volume total).
   3. Quando foi adicionado o último padrão, comece a 9 min timer.
   4. No final da incubação de 9 min padrão, remover o tampão contendo o tratamento das câmaras e adicionar 5,0 ml de tampão fresco, e iniciar o temporizador de 2,5 min.
   5. Repita o passo 4.4.4.
   6. No final da segunda lavagem 2.5 min, as câmaras de vácuo e adicionar tampão fresco, e inicia um temporizador de um minuto a contagem regressiva do início da Second adição de padrão.
5. Continuar este ciclo para todos adições padrão do dia.
6. Durante a adição de padrão final e posterior 9 min de incubação preparar o composto de referência 1,32 M KCl para o fim da adição de dose de referência prazo de 500 mL.
7. Após o intervalo de 1 min após a adição de tratamento final, adicione o KCl e começar a 9 min timer.
   NOTA: A adição de KCl é confirmar a viabilidade do tecido na conclusão do experimento e é útil se a administração de um tratamento que resulta em resposta insignificante.
8. Ao final da incubação composto referência final 9 min, aspirar ou remover o tampão de todas as câmaras. Não adicione uma solução tampão nova. Concluir o experimento.
9. Salvar arquivo gráfico, remover seções dos vasos sanguíneos, e descartar adequadamente e siga o protocolo de limpeza (fornecido pelo fabricante e pode ser específico de laboratório) para equipamentos myograph.

Resultados

Os vasos sanguíneos utilizados para gerar os resultados incluídos foram coletadas de seis novilhos da raça Holandesa (425 ± 8 kg), com intervalo de três semanas. Um exemplo típico de um mesentérica resposta contráctil da veia ao KCl e adições crescentes na concentração de tratamento está apresentado na Figura 2. A magnitude da resposta pode variar um pouco com o tamanho do recipiente (correlacionado com o tamanho do animal dador), mas pode também ser influenciadas (negativamente) pelo manu...

Discussão

O desafio inicial no desenvolvimento deste bioensaio foi a criação de um local de coleta repetível para a vasculatura mesentérica. Consistência sítio da amostra é crítico, como algumas das funções do intestino pequeno, a mudança durante a progressão através do jejuno e do íleo, por conseguinte, o mesentério variar segundo um padrão semelhante. Os ramos ileais da artéria mesentérica e veia foram os mais facilmente identificados através de marcos anatômicos. Ao localizar o ceco e seguindo a dobra ileoc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156