Bir Biyoassay olarak Sığır Mezenterik Arter ve Ven Bölüm yalıtma ve kullanma İnce Barsak vazoaktiviteye için Test

Özet

Ince bağırsak sık sık kan akışını etkileyen ve olumsuz besin emilimini etkileyebilir toksinler maruz kalmaktadır. , Bileşikleri veya ilgi duyulan bir toksin multimyograph ve mezenterik arter ve damar izole kullanarak vazoaktiviteye için taranabilir.

Özet

Memeli mide-bağırsak sistemlerinin sürekli ve bu sistemi için kan akışı üzerinde bir etkiye sahip olabilir bileşikler (istenen ve istenmeyen) maruz kalır. Ince bağırsağa kan akışında değişimler organın emme işlevlerine etkilere neden olabilir. Fermantatif ve sindirim süreçleri ile yemlerin kurtuldu toksinler özellikle faiz üretken verimliliği gelişmiş olabilir bir alanda gibi geviş getiren hayvanlarda gelişmiştir. Bu makale ile ilişkili video sığır mezenterik arter izole enine kesitlerde vazoaktiviteye ve bir multimyograph kullanarak damar bileşikleri taramak için geliştirilmiş bir in vitro biyo-tahlili tarif eder. Kan damarlarının monte edilir ve myograph içinde dengelenmiş sonra, biyolojik tayin kendisi kullanılabilir: gerilme tepkisini ya da ilgi çekici bir bileşik vazoaktiviteye değerlendirmek için bir tarama aracı olarak; farmakolojik olarak spesifik bir agoniste sahip reseptörleri hedefleyerek reseptör tiplerinin varlığını belirlemeks; Bir veya daha fazla antagonistlerinin varlığında bir reseptörünün rolünü belirlemek; veya antagonistleri ile ilgi çekici bir bileşik olası etkileşimleri belirler. Tüm bu sayesinde, verileri gerçek zamanda toplanır, tek bir hayvandan alınan doku farklı deneysel tedavilerin büyük sayıda (bir in vitro avantaj) maruz bırakılmış, ve doğru bir temin etmek üzere, kılcal damar yataklarının her iki tarafında damar sistemini temsil edilebilir ince bağırsağa destekleyen afferent ve efferent kanlanma oluyor ne olabilir resim.

Giriş

Bir doku yatağına kan akışında değişimler organ fonksiyonu üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. İnce bağırsağın birincil fonksiyonu, besin emilmesidir. Besin emilimini ve kan akışı artar yüzeyi boyunca digesta ¹ hareket ederken, besin emilimini yardımcı olmak için barsağın emme yüzeyine arter kan akışı gerekmektedir. Kan akışında bir azalma, transepitelyal gradyanı ² bir azalmaya besin emilimini bir azalmaya neden olabilir. Besin ek olarak, ince bağırsak, aynı zamanda mezenter lokalize kan akışı üzerinde bir etki gösterebilir sekonder metabolitler, ilaçlar veya toksinlere maruz kalabilir. Geviş getiren hayvanın durumunda, bileşikler, bir yem serbest bırakılabilir (örneğin, amino asitler, veya ergot alkaloitler gibi toksinler gibi besinler) ön bağırsağının fermantasyon süreçleri yoluyla. Bu bileşikler, rumen fermentasyon mikrobik metabolizmanın hayatta, şimdi emilim için kullanılabilirya da etkileşim ve hayvanın mide-bağırsak sistemi boyunca hareket ederken.

In vivo kan akışını ölçmek için kullanılabilir farklı yöntemler vardır (örneğin, Doppler ultrason, kan akış ölçerler, radyoaktif işaretli mikroküreler ve gösterge-seyreltme teknikleri kalıcı) çeşitli deneysel senaryolar veya tedavilerin değerlendirilmesine imkan. Mulvany ve Halpern ³ tel tekniğini açıklayan bir makale bir myograph vasküler halka hazırlıklarını monte zamana kadar yayınlanmış Ancak, damar düz kas mekanik veya farmakolojik özellikleri hakkında bilgi edinmek için, yöntem büyük damarların sınırlı kalmıştır. Bu tekniğin geliştirilmesi için, modifikasyonlar tüp şekilli yapıların değerlendirilmesi için çeşitli uygulamaların çeşitli izin ilişkili myograph sistemlere yapılacak devam etmektedir. Sistem ayrıca nerede perfüzyon daha büyük gemilerin ⁴ montaj için sabit çubuklar kullanmak için adapte edilmiştirteknikler arzu edilmez.

Damar ve hayvan türünden farklı hayvan türleri, verilerden aynı damarlarda anatomik kökeni ve ayrımlar gelen damar farklılıklardan dolayı kolay bir şekilde farklı damarlar ya da farklı hayvan türlerine ^5, aynı kap üzerinde tahmin edilemez. Sonuç olarak, ayrı biyotahliller geliştirilmiş ve bu yönleri değişti zaman valide edilmelidir. Son zamanlarda birçok biyoassayler safen ven ve sağ rumen arter ve ven ^6,7 sığırlarda kullanılan bu teknolojiler ile yanal geliştirilmiştir.

Bu biyoanaliz ergo alkaloidleri ince bağırsağa destekleyen damar üzerinde sahip olduğu özel etkilerini araştırmak için geliştirilmiştir. Bu beslenen alkaloit% 50-60 abomasal içeriği görünür olduğu bildirildi, ancak sadece% 5 dışkı ⁸ kurtarıldı. Strickland ve diğ. ^9, ergo alkaloidleri bir yorumda bu mevcut veriler Sugg belirttiest ince bağırsak ergopeptine emilmesi için en önemli site olabilir. Eckert ve ark. Ergo alkaloidleri ¹⁰ biofarmasötik yönleri ve epitel bariyeri geçmeye kez, ergo alkaloidleri subklavian ven veya mezenterik ven yoluyla ve portal kana lenfatik sistem tarafından ya taşınan belirtti. Rhodes vd. ¹¹ yüksek endofit-enfekte (yüksek ergot) diyet tüketen yükleyiciler bir duodenum kan akımında azalma ve kolon bildirdi. Doğru rumen arter ve ven biyolojik tayini kullanılarak, Foote ve ark. Ergot alkaloitleri, ¹² rumen damar vazoaktif olduğunu göstermiştir. Foote ve ark. ^13, daha sonra in vivo koşullarında ortaya bir azalma işkembe epitel kan akışında ergot alkaloitleri, sonuçlar rumen maruz kalma. Rumen emilim yüzeyi kan akışındaki bu azalma beraberinde besin (uçucu yağ asidi) akı bir azalmaya neden olmuştur. Qu göz önüne alındığındaforegut gelen ince bağırsağa aktarılması ergo alkaloidleri Antite; küçük bağırsak damar ve besin emilimi üzerinde benzer bir etki meydana olacağı varsayılmıştır. Bu sığır proksimal ileal mezenterik arter ve ven biyoassay geliştirilmesini gerekli kılmıştır.

Protokol

Hiçbir canlı hayvan kullanılmıştır, çünkü bu çalışmada kullanılan Prosedürler Kentucky Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi'nden onay gerektiren vermedi. Burada kullanılan herhangi bir numune toplamadan önce, tüm hayvanlar bir esir cıvata ile hayrete ve kan kaybetmiştir. Bu Kentucky Üniversitesi'nde federal teftiş mezbaha tesisinde gerçekleştirildi. USDA Gıda Güvenliği ve Kontrol Servisi resmi bir temsilci karkas canlı hayvan ve kullanımı ile ele tüm faaliyetleri gözlendi.

Enstrümantasyon hazırlanması 1.

1. Bir deneyin başlamasından doku örneklerinin koleksiyonları arasında geçen zaman miktarını ayarlamak ekipman en aza indirmek ve (ek personel mevcut olup olmadığını veya bu görevler, eş zamanlı olarak) deney doku toplanmasından önce, tamponlar hazırlamak.
   NOT: Bu doku deneyler için canlı kalır zaman büyük miktarda sağlar, ancak bazı sadecebu nedenle genellikle mümkün olduğunca erken başlamak için arzu edilir, deneyler uzun süre için çalıştırabilirsiniz (veya bir gün içinde birden çok deneyler tamamlamak için bir arzusu var).
2. Güç kadar ilişkili bilgisayar, veri satın almalar ekipmanları, (tampon (s)) su banyosu ve myograph birim (ler). Myograph birim (ler) hakkında kalibrasyon ekipmanları yerleştirin ve sıcaklıkları önceden ısınmaya birimleri ve kalibrasyon ekipmanları (37.5 ° C ayar) myograph ısı açmak ve izin verir.
   1. Bilgisayarda önceden oluşturulmuş Grafik yazılım ayarları dosyasını açın ve bir çalışma başlatmak (ancak veri elde değil).
3. 10 dakika boyunca ekipmanı ısıtın.
   1. Veri edinme başlatın.
   2. Tüm kanalları sıfır.
   3. Kontrol ve sertifikalı bir ağırlık tarafından sağlanan bir 2-g kuvveti bu kanala ait olan ilgili bir kuvvet transdüktörüne sağlanan elektrik sinyali standardize etmek için her kanalı (multimyograph 4 kanal) (gerekirse) kalibrasyonu yürütmektedirler.
   4. Kalibrasyon ve bir tane dönüşüm tamamlandıktan sonra, gram olarak sonraki tüm veri depolamak. Her ayrı laboratuvar arzuları dayalı buna göre değişir; donanım ve yazılım gibi milinewton ve volt gibi diğer birimlerin kullanımına izin verir.
4. Gaz hatları tıkanmalar açık olduğundan emin olun ve (ler) birimleri myograph gaz sağlama (% 95 O ₂ /% 5 CO ₂₎ açın. Sürekli bütün prosedür sırasında (myograph odalarına) tüm tamponları gaz.
5. % 70 etanol ile tüm myograph haznelerine ve 10 dakika için ıslanmaya, etanol çıkarmak, ve bir ikinci 10 dakika emmek için tekrar edin.
   1. Etanol uzaklaştırıldıktan sonra, odacıklar içinde tampon üçüncü ilave bırakarak hazırlanan tampon maddesi (tampon hazırlanması için bakınız bölüm 2) ile üç kez durulanır iyonu giderilmiş su ile üç kez yıkayın.
      NOT: tampon ve doku hazırlanıncaya kadar bu noktada ekipmanların bu durumda boşta kalabilir ve personel experimen ile devam etmeye hazır olduğunut.

Tamponlarının 2. Hazırlık

1. 11.1 mM D-glikoz son konsantrasyonları elde etmek için ulaşım ve doku örneklerinin işlemede kullanmak için bir 1 L'lik, Krebs-Henseleit-tampon çözeltisi hazırlayın; 1.2 mm ₄ MgSO; 1.2 mM KH ₂ PO _4; 4.7 mM KCI; 118.1 mM NaCI; 3,4 mM _CaCl2; 24.9 mM _NaHCO3.
   1. Bir karıştırma plakası üzerinde de-iyonize su, yaklaşık 900 ml Krebs tuzları, 9.6 g karıştırın.
   2. Istenilen tamponun her bir L başına 2.1 gram sodyum bikarbonat, ardından 0.373 gr kalsiyum klorür dihidrat ilave edin.
   3. % 95 O _{2/5% CO2} ile 20 dakika boyunca gaz tampon çözeltisi.
   4. L ve 1 hacim ayarlamak; gazı sonra 7,05 pH'ı ayarlamak (nihai hedeflenen pH 7,4 olmalıdır tamponu pH oranını yükselterek, filtrasyon)
   5. Filtre kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de temiz otoklavlandı 1 L medya şişe ve mağaza tampon içine tampon sterilize.
2. Ayrı bir Krebs-H 'nin HazırlanmasıKrebs-Henseleit kontraktilite deneyler ile ilişkili olan ek bileşikler tamponu taşıma Aşama 2.1 'de tarif edildiği gibi myograph deneylerinde kullanılmak üzere enseleit tampon çözeltisi.
   NOT: Genellikle 2 L Bu makalede açıklanan deneyler için yeterli olacaktır, ama bu hacim artışı veya deney uzunluğuna göre azalır gerekebilir, myograph odaları ve (tedavi eklemeler göre) sayı tampon değiştirmeleri sayısı.
   1. Gazlaştırma aşama (aşama 2.1.3) önce, 9.1 mg eklemek tampona desipramin-HCl tampon (L başına hazırlanmaktadır).
   2. Propranolol-HCl, 1.0 uM çözeltisi hazırlayın ve Krebs-Henseleit-tampon çözeltisi için bu çözeltinin (tampon hazırlanan her bir L başına) 1 ml. Kullanım gününde bu tampon yapmak ve myograph çalışma sıcaklıklarında (myograph 37,5 ° C sıcaklık veren bir sıcaklıkta) tutun.
      Not: desipramin biyojenik amin, yeniden alım mekanizmaları önlemek için ilave edilirve daha hızlı gerçekleşmesi için kan damarlarını banyo tampon deneysel eklemeler temizlenmesini sağlar. Propranolol ilavesi adrenerjik reseptörlerinin β muamele bileşiklerin bağlanması belirli olmayan engeller.

3. Toplama ve vaskülatürüne hazırlanması

1. En kısa sürede, karkas gastrointestinal sistem kaldırın. Hayvan artık istemsiz refleks sergileyen sonra, baş kaldırmak ve gizlemek ve sonra dikey karkas yükseltmek. Karkas gastrointestinal iç organları (anüs özofagus) kaldırılması onaylı mezbaha personeli (<20 dk zaman ve çarpıcı) tarafından doldurulmalıdır.
   NOT: Genellikle bağırsak, standart işletim prosedürleri veya tesis personelinin ardından federal zorunlu prosedürler ve toplanan ediliyor konum / tesis ile sınırlıdır nasıl yakında.
   1. En tesislerde, mide-bağırsak sisteminin işler gerçekleştirmedengıda kaynağı girmeye yönlendirilmiş olan karkasın işleme ayrı bir yerde. Gastrointestinal sistem almış ve inceleme için dışarı yayılır yakındaki bir konuma kullanın.
2. Gastrointestinal sistem yayılmış sonra, ince bağırsak, çekuma ince bağırsağa bağlantı ileoçekal kapağı ve ileoçekal kat (Şekil 1A) proksimal olarak uzanan bir flanş ileum tanımlar.
   1. Bir neşter veya bıçak kullanarak, çok hafifçe İleal flanş merkezinde mezenterik zarında bir kesi yapmak. Iki işaret parmaklarını kullanarak, açık açık mezenterik damarsal (Şekil 1B) açığa yağ ve bağ dokusu uzak teşrih.
3. Bağırsak mezenterinde bu flanş veya şişkinlik, birden fazla şubesi teşrih (~ 2 cm uzunluğunda) ileum (Şekil 1C) bu kısmını destekleyen maruz mezenterik arter ve ven demetleri.
   1. If u, doku kavramak doğrudan kavramak veya zarar ve olumsuz doku performansı ¹⁴ etkileyebilir germe herhangi bir tür olarak çıkarılırken, tüm kan damarları üzerinde çekmeyin dikkat çekmek için forseps şarkı. Kan damarı çıkarılması iyi kaldırılacak bölümün her iki ucunda arasında kesilmesi ve daha sonra, izole bölümüne yanında ya da paralel olarak kesilmesi ile, yapılır. Kolaylığı için, gemiler forseps bir çift ile kavramak için bazı doku sağlamak için birlikte çevreleyen doku bazı kaldırmak.
   2. Forseps bir çift, buzla soğutulmuş Krebs-Henseleit tamponu içeren bir tüpe doku numunesi daldırın ve işleme laboratuarda oluşabilir kadar buz üzerinde muhafaza edin.
4. Bir kesme yüzeyi veya bir petri ince dokulu numuneyi, kısmen buz soğukluğunda Krebs-Henseleit daldırın.
   1. Kapsamını # 5 kuyumcular forseps, Noyes iris makası kullanarak ve lamba büyüteç veya kesme, dikkatle çevreleyen yağ ve bağlant uzak teşrih (5,0X büyütme 2,5 yeterlidir)dokuları ettik ve arter ve ven ayrı. Bölümün bir ucunda kap açıklığı belirlenmesi ve dikkatli bir forseps ile kabı çevreleyen fasya tutun.
   2. Makasla kesme yükseltilmiş Kaplamanın altına makas ucu kaydırarak kabına paralel olun. İlk kesildikten sonra, yağ, bağ dokusu ve bundan başka, bir makas ile iki tarafı da keserek tekneden ayrılabilir. Gemiler bankta harcamak süreyi en aza indirerek gemiler mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
   3. (Örnekler alındıktan sonra en fazla 24 saat için depolanmış ve halen geçerli veri üretmek kontraktilite kalabilir), 4 ° C 'de taze Krebs-Henseleit tamponu ve mağaza tüplere kan damarlarının dönün.
   4. Bir jilet kullanarak, dilim damar 2-mm kesit istenilen sayıda içine myograph kullanılacak (tutarlı kesitler elde etmek için bir doku dilimleme makinesi kullanmak yararlı olur).
   5. Diseksiyon sco altında her bölümü inceleyinpe (12,5X büyütme) her bölüm yanlışlıkla diseksiyon ve temizlenmesi sırasında yapılan herhangi bir anormallik, şube, vanalar, ya da yüzeysel hasar sahip olmasını sağlamak. Herhangi bir anormallik, şube, kapak, ya da yüzeysel hasar varsa damar bölümü değiştirin.
5. Myograph odaları (genellikle <30 dk) montaj için hazır olana kadar C buz üzerinde veya 4 ° (Krebs-Henseleit tamponunda batık) Mağaza kabul dilimlenmiş gemi bölümleri.
6. Yavaşça bir lümen aracılığı ile destek takarak myograph üzerindeki toplama kabı yuvası ve bir 2-3 g okumasının oldukça üzerindedir damarları germek için dikkatli olmak (myograph üzerindeki micropositioner kullanarak) gerilimi arttırır.
7. Tüm odaları kaplıdır sonra, tüm odalarından tampon vakum ve tampon 5.0 ml dolum ve dengeleme dönemi ve deney başlamak için 15 dakika zamanlayıcı başlar.

4. Deney

1. Istikrarlı res elde etmek için 1.5 saat boyunca, tüm gemi bölümleri dengeye1.0 g ting gerilim.
   1. Krebs-Henseleit inkübasyon tamponu her 15 dakikada bir değiştirin.
   2. Dengeleme sırasında, sürekli olarak 2 g, kan damarı bölümleri üzerindeki gerilimi ayarlamak kadar ve daha sonra yaklaşık 0.80 g aşağı rahatlamak için izin verir. Gemiler (onlar bağlar kayabilir) çok dinlenmek için izin çalışın. Damar ayarı gerekmeksizin 1 gr gerginliği tutan bir sabit başlangıç ​​gerilimi elde etmek için deneyin.
2. Dengeleme sırasında, KCI sulu 1.32 M çözelti, bir referans olarak kullanılmak üzere hazırlanması.
3. Tatmin edici bir dengeleme tamamlanmasından sonra, banyo kabına 5.5 ml çözelti içinde 0.12 M çözelti ile sonuçlandığı 1.32 M KCI çözeltisi 500 ul ilave edin.
   1. Bu ilave gelen azami tepki doku canlılığını ölçmek için kullanılmaktadır ve bir A (tedavi verileri normalize etmek için, örneğin konsantrasyon yanıtlar kullanılabilir üzere manüel olarak gerginliğini ayarlamak için değil, 1.32 M KCl eklenmesini takibengonist).
   2. Gerilim 1.0 g başlangıç ​​değerine geri dönene kadar 15 dakikalık aralıklarla tampon değiştirin.
4. Temel ulaşıldığında, tampon değiştirme ve aynı zamanda, 1 dakika süre zamanlayıcı başlar. Başlangıç ​​kez şaşırtıcı önlemek için aynı anda tüm odaları için bunu yapın.
   1. Eklenecek standart vorteks ve 1 dakika geri sayım esnasında gözün 1 yorum hazırlar.
   2. (Bu toplam hacminin% 0.5 altında tutan tedavi) verildi gerektirdiği her bölmeye 25 ul alikolar içinde standart ekleyin.
   3. Son standart eklendiğinde, 9 dakika zamanlayıcı başlar.
   4. 9 dk standart İnkübasyonun sonunda, bölmeden gelen tedavi içeren tampon kaldırmak ve taze tampon maddesi içinde 5.0 ml ekleyin ve 2.5 dakika zaman ölçeri başlat.
   5. Adımı tekrarlayın 4.4.4.
   6. İkinci 2.5 dakika çalkalama sonunda odacıkları, vakum ve taze tampon eklemek ve Secon başlamasından geri sayım, 1 dakika süre zaman ölçeri başlatd standart ekleme.
5. Günün standart eklemeler için tüm bu döngüyü devam edin.
6. Nihai standart ek ve sonraki 9 dakika inkübasyon sırasında 500 ul çalışma referans dozunun yanı sıra bir sonu için 1.32 M KCI referans bileşik hazırlamak.
7. Son bir muamele ilave edilmesinden sonra 1 dakika aranın ardından KCI ekleyin ve 9 dk zaman ölçeri başlat.
   NOT: KCI ilaveli deney sonuca doku canlılığını onaylamak ve önemsiz tepki ile sonuçlanan bir tedaviyi tatbik durumunda yararlıdır.
8. Nihai 9 dk referans bileşiği İnkübasyonun sonunda, vakum odası ya da tümünden tampon çıkarın. Taze tampon katmayın. Denemeyi sonlandırın.
9. , Grafik dosyayı kaydedin kan damarı bölümleri çıkarmak ve imha ediniz ve yukarı temiz protokolü takip (üretici tarafından sağlanan ve laboratuvar spesifik olabilir) myograph ekipman için.

Sonuçlar

Dahil sonuçları üretmek için kullanılan kan damarları, 3 hafta aralığında olan 6 Holstein yükleyiciler (425 ± 8 kg) toplanmıştır. KCl ve konsantrasyon içerisinde arttırılarak tedavi eklemeler için tipik damar mezenterik kasılma tepkisinin bir örneği cevabının büyüklüğü (verici hayvanın boyutu ile ilişkili) kabın boyutu ile bir değişir. Şekil 2'de sunulmuştur, ama aynı zamanda bir can yanlış kullanım sonucu (olumsuz) etkilenir toplanması ve temizlenmesi sıras?...

Tartışmalar

Bu biyoanalizde gelişiminde ilk zorluk mezenterik damarların bir tekrarlanabilir toplama sitenin kurulması oldu. Ileum ve sonuç olarak mezenter yoluyla jejunumda ilerlemesi sırasında, ince bağırsak değişim bazı fonksiyonlarını benzer bir modeli farklılaşabilecektir olarak Örnek Alanı tutarlılığı büyük önem taşımaktadır. Mezenterik arter ve ven İleal dalları en kolay tespit anatomik noktalara aracılığıyla vardı. Çekum bulma ve mezenter sol tarafında kendi terminaline ileosekal kat izle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156