Изоляция и Использование разделов крупного рогатого брыжеечной артерии и вены, как биологических испытаний для тестирования для вазоактивности в тонком кишечнике

Резюме

Тонкая кишка часто подвергаются воздействию токсинов, которые могут повлиять приток крови и отрицательно повлиять усвоение питательных веществ. Использование multimyograph и брыжеечной артерии и вены изолирует, соединения или токсины, представляющие интерес может пройти обследование на вазоактивности.

Аннотация

Млекопитающих желудочно-кишечные системы постоянно подвергаются соединений (желательных и нежелательных), которые могут оказать влияние на приток крови к и от этой системы. Изменения в кровоток в тонком кишечнике может привести к воздействию на поглотительной функции органа. Особый интерес в токсинов, освобожденных от кормов через ферментативных и пищеварительных процессов сложилась в жвачных животных, как области, где производительные эффективность может быть улучшена. Видео, связанные с данной статье описывается биопробы в пробирке, разработанный для скрининга соединений для вазоактивности в изолированных сечений бычьего брыжеечной артерии и вены с использованием multimyograph. После того, как кровеносные сосуды монтируются и уравновешивали в миографа, сам биологический анализ может быть использован: как инструмент скрининга для оценки сократительной реакции или вазоактивности соединений, представляющих интерес; определения присутствия типов рецепторов путем фармакологически ориентации рецепторы с конкретной агонистас; определения роли рецептора с наличием одного или нескольких антагонистов; или определить возможные взаимодействия соединений, представляющих интерес с антагонистами. В течение всего этого, данные собираются в режиме реального времени, ткани собирали из одного животного может подвергаться воздействию большого количества различных экспериментальных процедур (преимущество в пробирке), и представляет собой сосудистую по обе стороны от капиллярного русла, чтобы обеспечить точное картина того, что может происходить в афферентной и эфферентной кровоснабжения поддерживающей тонкую кишку.

Введение

Изменения кровотока к кровати ткани может иметь большое влияние на функции органов. Основная функция тонкой кишки является питательной поглощения. Артериальная приток крови к поглощающей поверхности кишечнике необходим для поглощения питательных веществ и кровоток увеличивается, чтобы помочь в абсорбции питательных веществ, как еды движется вдоль поверхности ^1. Уменьшение кровотока может привести к снижению абсорбции питательных веществ за счет уменьшения в трансэпителиальной градиента ^2. В дополнение к питательных веществ, тонкой кишки также могут подвергаться вторичных метаболитов, наркотиками или токсинами, которые оказывают влияние на локализованной кровотока в брыжейки. В случае жвачных животных, соединения могут быть освобождены от корма (например, питательные вещества, такие как аминокислоты или токсины, такие как алкалоидов спорыньи) через ферментативных процессов передней кишки. Если эти соединения выжить микробного метаболизма рубца брожения, они теперь доступны для поглощенияили взаимодействие, так как они проходят через желудочно-кишечный тракт животного.

Есть целый ряд различных методов, доступных для измерения потока крови в естественных условиях (например, доплеровского ультразвукового, пребывающего расходомеры крови, меченных радиоактивным изотопом микросферы, и методы Индикатор-разведение), которые позволяют оценить различных экспериментальных сценариев или лечения. Однако, чтобы получить информацию о механических и фармакологических свойств гладких мышцах сосудов, методы остались ограничивается крупных сосудов до Mulvany и Халперн ³ не опубликована статья, описывающая способ связи, использующий провод монтируется препараты сосудистого кольца в миографа. Так как развитие этой техники, модификации продолжают быть внесены в соответствующие системы миографа которые позволяют множество различных приложений для оценки трубчатых структур. Система также была адаптирована для использования фиксированных стержней для монтажа крупные суда ^4, где перфузииметоды не желательно.

Из различий в сосудах из различных анатомических происхождении и различиях в тех же судов из разных видов животных, данные судна и типа животного не может быть легко экстраполированы на различных судах или же судна в различных типах животных ^5. Следовательно, отдельные биоанализы должны быть разработаны и утверждены в любое время эти аспекты будут изменены. Недавно несколько биоанализы были разработаны с этими технологиями для использования в скота боковая подкожной вены и правой рубца артерия и вена ^6,7.

Это биопроб был разработан специально, чтобы исследовать эффекты, что алкалоиды спорыньи иметь на сосудистую сеть, поддерживающей тонкий кишечник. Было сообщено, что 50-60% от подаваемых алкалоидов появляются в abomasal содержания, но только 5% из них восстановлено в Кале ^8. Стрикленд и др. ⁹ говорится в обзоре алкалоидов спорыньи, что доступный Sugg данныхПредполагаемое что тонкая кишка может быть самым важным местом для поглощения ergopeptine. Эккерт и др. ¹⁰ отзывы биофармацевтических аспекты алкалоидов спорыньи и заявил, что, как только они пересекают эпителиальный барьер, алкалоиды спорыньи транспортируются либо лимфатической системы в подключичную вену или через брыжеечной вены и в портальной крови. Родос и др. ¹¹ сообщили об уменьшении кровотока в двенадцатиперстной кишке и толстой кишки в бычков потребляющих высокий эндофитов-инфицированных (высокая алкалоид спорыньи) диеты. С помощью правой артерии и вены биоанализ рубца, Фут и др. ¹² показано, что алкалоиды спорыньи являются сосудоактивный в рубце сосудистой. Foote и соавт. ¹³ впоследствии показали, что в естественных рубца воздействие алкалоидов спорыньи приводит к снижению потока рубца эпителиальных крови. Это уменьшение притока крови к поглощающей поверхности рубца одновременно вызывает снижение питательных веществ (летучих жирных кислот) потока. Учитывая Куantity из алкалоидов спорыньи, проходящих на тонкой кишки от передней кишки; было высказано предположение, что будет происходить аналогичный эффект на тонкой кишки сосудистой и поглощения питательных веществ. Это потребовало разработки крупного рогатого скота проксимального подвздошной брыжеечной артерии и вены биотестирования.

протокол

Процедуры, используемые в этом исследовании не требуют утверждения в Университете Кентукки уходу и использованию животных комитета, потому что не использовались живые животные. До коллекции любого образца, используемого в данном документе, все животные были ошеломлены с пленной болта и обескровлены. Это было проведено в федерально проверяемого мясожирового объекта в Университете штата Кентукки. Официальный представитель контролю безопасности продуктов питания Министерства сельского хозяйства США наблюдается все мероприятия, которые имели дело с живым животным и обработки туши.

1 Подготовка приборостроения

1. Чтобы свести к минимуму количество времени между коллекциями образцов тканей на начало эксперимента, настроить оборудование и подготовить буферы до сбора экспериментальной ткани (или, если дополнительный персонал доступны, эти задачи могут происходить одновременно).
   Примечание: Это не только обеспечивает наибольшее количество времени, которое остается жизнеспособной ткани для проведения экспериментов, но некоторыеЭксперименты могут работать в течение длительных периодов времени (или есть желание завершить несколько экспериментов в день), поэтому, как правило, желательно, чтобы начать как можно раньше.
2. Включите связан компьютер, приобретения данных оборудования, водяная баня (для буфера (ов)) и миографа блок (ы). Поместите калибровочный оборудование на миографа блока (блоков) и включите миографа тепла (предустановки до 37,5 ° C) и позволяют единиц и калибровки оборудования для нагревания до заранее температур.
   1. Откройте ранее созданную настройки программного обеспечения Chart файл на компьютере и начать работать (но не получения данных).
3. Разминка оборудования в течение 10 мин.
   1. Начните сбор данных.
   2. Нулевой все каналы.
   3. Проверьте, и провести калибровку (при необходимости) на каждом канале (4 канала на multimyograph) стандартизировать электрический сигнал, подаваемый от соответствующего датчика силы, связанной с этого канала на 2-г силы, поставляемой сертифицированной веса.
   4. После калибровки и преобразования единиц будут завершены, хранить все последующие данные в граммах. Измените соответствующим образом на основе желаний каждого отдельного лаборатории; оборудование и программное обеспечение позволяют использовать другие единицы, например, мН и вольт.
4. Убедитесь, что газовые линии четкие завалов и включите газоснабжения (95% O _2/5% CO ₂₎ в миографа (ы) единиц. Постоянно Газ все буферов (в миографа камер) в течение всей процедуры.
5. Заполните все миографа камеры с 70% этанола и замочить на 10 мин, удаляя этанол, и повторите для второго 10 мин замочить.
   1. После удаления этанола, промыть три раза деионизированной водой, после чего три цикла полоскания с подготовленной буфера (смотри раздел 2 для приготовления буфера), в результате чего третье добавление буфера в камерах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент оборудование может бездействовать в этом состоянии до тех пор, буфер и ткани не получают и персонал готов приступить к экспериментальт.

2 Получение буферов

1. Подготовить 1 л Кребса-буферный раствор для использования в транспортировке и переработке образцов тканей для достижения конечных концентраций 11,1 мМ D-глюкозы; 1,2 ммоль MgSO _4; 1,2 ммоль KH ₂ PO _4; 4,7 мМ КСl; 118,1 мМ NaCl; 3,4 мМ CaCl _2; 24,9 мМ NaHCO _3.
   1. Смешайте 9,6 г Кребса солей в примерно 900 мл деионизированной воды на магнитной мешалки.
   2. Соединение в 0,373 г дигидрата хлорида кальция с последующим 2,1 г бикарбоната натрия в л буфера желаемой.
   3. Буферный раствор газа в течение 20 мин с 95% O _2/5% CO _2.
   4. После отравления газами, отрегулировать рН до 7,05 (фильтрация буфера увеличивает рН; конечная цель рН должен быть 7,4) и регулировать громкость до 1 Л.
   5. Фильтр не стерилизуют буфера в чистую автоклавного 1 л бутылки и медиа-магазина буфере при 4 ° С до готовности к использованию.
2. Подготовьте отдельный Кребса-Henseleit буферный раствор для использования в экспериментах миографа как описано на стадии 2.1 для транспортировки Кребса-буфере с дополнительными соединениями, которые относятся к сократимость экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 2 л хватит для экспериментов, описанных в этой статье, но этот объем может потребоваться быть увеличена или уменьшена на основе длины эксперимента, количество миографа камер, и число буферных замен (по отношению к дополнений лечение).
   1. До газообразования стадию (схема 2.1.3), добавьте 9,1 мг (на л буфера готовится) дезипрамина-HCl буфера.
   2. Приготовьте 1,0 мкМ раствор пропранолол-HCl и добавить 1 мл (на л буфера готовится) этого раствора в буферном растворе Кребса-. Сделайте этот буфер на день использования и держать на миографа рабочих температур (температуры, которая дает C температуру 37,5 ° в миографа).
      Примечание: дезипрамин добавляется для подавления механизмы обратного захвата биогенных аминови позволяют очистку экспериментальных дополнений из буфера купание кровеносные сосуды, происходит более быстро. Добавление пропранолол препятствует неспецифического связывания соединений лечения в β-адренорецепторов.

3 Сбор и подготовка сосудистой

1. Как можно скорее снимите желудочно-кишечный тракт от туши. После того, как животное больше не проявляет никакого непроизвольное рефлекс, не снять голову и скрыть, а затем поднять тушу вертикально. Удаление желудочно внутренностей (пищевода в анус) от туши должна быть завершена к сертифицированной бойне персонала (<20 мин, время от оглушения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как скоро, как правило, ограничивается расположения / объекта, где кишечный тракт собираемой от и стандартных операционных процедур или федеральной утвержденных процедур с последующим персонала установки.
   1. В большинстве объектов, проводить манипуляции желудочно-кишечного трактав отдельном месте от обработки туши, которой суждено войти в поставку продовольствия. Используйте неподалеку удобным расположением, где желудочно-кишечного тракта могут быть приняты и распространиться на экспертизу.
2. После того, как желудочно-кишечный тракт распространено, определить тонком кишечнике, илеоцекальный раз соединительный тонкой кишки к слепой кишке, подвздошной и фланец, проходящий проксимально по отношению к илеоцекального раза (фиг.1А).
   1. Использование скальпель или нож, очень легко сделать разрез в брыжеечной мембраны в центре подвздошной фланца. Использование двух указательных пальцев, тупо отсечь жира и соединительной ткани, раскрывающую брыжеечной сосудистой (Рисунок 1В).
3. От этого фланца или выпуклость в кишечном брыжейки, рассекать из нескольких филиалов (~ 2 см в длину) из открытых пучков брыжеечной артерии и вены, которые поддерживают эту часть подвздошной кишки (Рисунок 1C).
   1. Если ипеть щипцы понять ткани, заботиться, чтобы не схватить прямо или тянуть на кровеносные сосуды вообще, удаляя их как любого рода растяжения может повредить и отрицательно повлиять производительность ткани ^14. Удаление кровеносных сосудов лучше всего делать путем резки на каждом конце секции должны быть удалены, а затем резки вдоль или параллельно теперь изолированной секции. Для простоты, удалить некоторые из окружающих тканей вместе с судов, чтобы обеспечить некоторые ткани захватить с парой щипцов.
   2. С парой щипцов, погрузить образец ткани в пробирку, содержащую охлажденного льдом буфера Кребса-и хранить на льду до обработки не может произойти в лаборатории.
4. Поместите образец ткани на режущей поверхности или в чашку Петри и частично погрузить в охлажденном льдом Кребса-.
   1. Использование # 5 ювелиров щипцы, Нойес диафрагмы ножницы, и увеличительное лампу или рассечения сферу (2,5 к 5.0x увеличением достаточно), тщательно отсечь окружающий жира и connectiве тканей и отделить артерию и вену. Определение отверстие емкости на одном конце раздела и тщательно усвоить фасции, окружающую корпус с пинцетом.
   2. Сделайте разрез с ножницами параллельно судна, сдвинув кончик ножницами под поднятым фасции. После первоначального разреза, жира и соединительной ткани могут быть дополнительно отделяется от судна, сокращая обе стороны с ножницами. Убедитесь, что сосуды как можно более чистым, минимизируя количество времени сосуды потратить на скамейке.
   3. Возвращение кровеносные сосуды трубок свежем буфере Кребса-и хранят при температуре 4 ° С (образцы могут по-прежнему сохраняется до 24 ч после сбора и до сих пор производят действительные данные сократимости).
   4. Используя лезвие, ломтик судно будет использоваться в миографа в нужное число 2-мм разделов (это полезно использовать ткани слайсер получить последовательные сечения).
   5. Исследуйте каждый раздел при вскрытии ШОСре (12.5X увеличения), чтобы гарантировать, что каждая секция не имеет аномалии, филиалов, клапаны, или поверхностное повреждение по неосторожности сделали во время вскрытия и очистки. Замените раздел сосудов, есть ли нарушение, филиал, клапан, или поверхностное повреждение.
5. Храните приемлемые нарезанные участки сосудов (погруженные в Кребса-буфера) на льду или при 4 ° С до готовности для монтажа в миографа камер (обычно <30 мин).
6. Аккуратно установите судно на миографа вставив опоры через просвет и увеличить натяжение (используя микроподвижки на миографа) будьте осторожны, чтобы не растянуть сосуды выше 2 до 3 г чтения.
7. После того, как все камеры покрыты, вакуум буфер из всех камер и залить 5,0 мл буфера и начать 15 мин таймер, чтобы начать периода уравновешивания и эксперимент.

4 Эксперимент

1. Равновесие все разделы сосудов в течение 1,5 часа, чтобы достичь стабильных резтин натяжение 1,0 г.
   1. Замените инкубационном буфере Кребса-каждые 15 мин.
   2. Во время установления равновесия, постоянно регулировать натяжение секций кровеносных сосудов до 2 г, а затем позволить, чтобы расслабить до примерно 0,80 г. Старайтесь не позволяют судам расслабиться слишком много (они могут соскользнуть с опоры). Попробуйте добиться стабильного базового напряжения, в котором судно держит 1 г напряженность, не требуя корректировки.
2. Во время установления равновесия, приготовить водный 1,32 М раствор KCl, которые будут использоваться в качестве ссылки.
3. После завершения удовлетворительного равновесия, добавьте 500 мкл 1,32 М раствора KCl, чтобы привести к 0,12 М раствора в 5,5 мл раствор, омывающий судна.
   1. После добавления в 1,32 М KCl, не регулировать натяжение вручную, как максимальный ответ от этого того используется для оценки жизнеспособности ткани и могут быть использованы для нормализации данных о лечении (например, реакции концентрации на Аgonist).
   2. Замените буфер в 15-минутными интервалами, пока напряжение не вернется к исходному значению 1,0 г.
4. После того, как базовый достигается, изменить буфер и одновременно начать 1 мин таймер. Сделайте это для всех камер одновременно, чтобы избежать ошеломляющие из времени начала.
   1. Vortex стандарт для добавления и подготовить комментарий для камеры 1 в течение 1 мин обратного отсчета.
   2. Добавить стандартам в 25 мкл аликвоты каждой камеры в качестве эксперимента диктует (это ведет обработку ниже 0,5% от общего объема).
   3. Когда последний стандарт был добавлен, начать 9 мин таймер.
   4. В конце 9 мин стандартной инкубации удалить обработки, содержащей буфер из камер и добавить 5,0 мл свежего буфера, и начать 2,5 мин таймер.
   5. Повторите шаг 4.4.4.
   6. В конце второй промывки 2,5 мин, вакуум в камерах и добавить свежий буфер, и начать 1 мин таймер обратного отсчета на возбуждение SECONд стандартной добавки.
5. Продолжайте этот цикл для всех стандартных добавок дня.
6. Во время окончательного стандарта того и последующего 9 мин инкубации подготовить 1,32 М KCl эталонного соединения для конец отчетного выполнения дозы добавлением 500 мкл.
7. После интервале 1 мин после последнего добавления обработки, добавить KCl и начать 9 мин таймер.
   Примечание: KCl дополнение для подтверждения жизнеспособности тканей при завершении эксперимента и является полезным, если введение лечение, которое приводит к пренебрежимо малой ответ.
8. В заключительной 9 мин эталонным соединением инкубации, пропылесосить или удалить буфер из всех камер. Не добавляйте свежий буфер. Заключить эксперимент.
9. Сохранить файл Chart, удалить разделы кровеносных сосудов и утилизировать надлежащим образом, и следовать очистить протокол (предоставляется изготовителем и может быть лаборатория конкретных) для миографа оборудования.

Результаты

Кровеносные сосуды, используемые для генерации включены результаты были получены от 6 голштинской бычков (425 ± 8 кг) в течение 3-недельного интервала. Пример типичной брыжеечной вены сократительной реакции на KCl и дополнений обработки увеличения концентрации представлена ​​на рис?...

Обсуждение

Первоначальная задача в развитии этой биотестирования стало создание повторяемой пункт сбора для брыжеечной сосудистой. Пример последовательность сайта имеет решающее значение, так как некоторые из функций кишечника небольшое изменение во время перехода от тощей кишки через подвзд...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156