Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Resumen

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Resumen

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introducción

Alteraciones dinámicas en el número y la estructura de las sinapsis son características de desarrollo, el envejecimiento, y numerosos trastornos neurodegenerativos ^1-3. La capacidad de las neuronas para recibir e integrar la información sináptica depende de la morfología dendrítica y alteraciones dinámicas en las conexiones sinápticas. De hecho, existe una correlación positiva entre la espina dendrítica y el número de sinapsis, que tanto el impacto de la función cognitiva ^4. Por lo tanto, no es sorprendente que decrementos en número de la espina dendrítica se han asociado con la disfunción cognitiva en un número de trastornos neurológicos ^5-7, lo que provocó un gran interés en la cuantificación de la espina dendrítica. Sin embargo, la cuantificación de la densidad de la espina sigue siendo un tiempo y tarea tediosa, que no genera información útil con respecto a la topografía y la distribución de las sinapsis en todo el árbol dendrítico. Afortunadamente, los métodos de tinción (por ejemplo, Golgi-Cox y doublecortin (DCX)), en relacióncon sofisticadas técnicas de imagen se puede utilizar para superar las barreras actuales y producir imágenes de alta resolución de la arborización dendrítica de una manera fiable y rápida. Si bien el método de tinción de Golgi-Cox se puede implementar para evaluar el estado de la arborización dendrítica en todas las neuronas ^8, DCX puede desplegarse para etiquetar las neuronas recién nacidas en particular en el giro dentado y la zona subventricular ^9, una consideración importante dado que la neurogénesis ocurre tanto estas regiones a lo largo de la vida útil ^10,11.

Después de la tinción, dos métodos de imagen fueron desplegados para evaluar las características dendríticas: i) una imagen en tiempo real (RTI) y ii) de profundidad ampliada de la imagen de campo (EDFI). La técnica de RTI proporciona un medio para rastrear y cuantificar la longitud y orden de arborización largo de los segmentos y ramas dendríticas individuales. Por lo tanto, le permite a uno para estimar el área total y el volumen ocupado por cada árbol dendrítico. Más specifically, en el método RTI el usuario identifica continuamente los segmentos y reenfoca iterativamente como la neurona software de rastreo recoge las x, y, z y las coordenadas de la estructura dendrítica y reconstruye la trayectoria de la estructura dendrítica en 3D. Comparativamente, el método EDFI proporciona un medio más bien simples y rápidos para evaluar la densidad dendríticas en muestras de tejido en lugar de espesor mediante la generación de una imagen compuesta, proporcionando información sobre todo el eje z. Para ello, el usuario registra los archivos de vídeo de alta definición de todo el espesor de la sección y, a continuación utiliza el software para buscar los fotogramas de vídeo para identificar los puntos en el que un píxel es completamente enfocado. Posteriormente, los píxeles enfocados se fusionan e integran en una alta resolución, imagen 2D compuesta. Esta imagen compuesta contiene todos los píxeles que eran de enfoque, independientemente de su posición en el eje z. Análisis cualitativo y cuantitativo de estas imágenes en 2D se puede utilizar posteriormente para determinar la densidadde ramificación dendrítica en cada campo.

Por último, se presenta un método panorámica para generar imágenes de muy alta resolución para el análisis y evaluación de las dendritas en toda una región de interés. Esta técnica se puede implementar para superar la falta de acceso a muy alta resolución y cámaras digitales caras. Usando este método, uno capta imágenes en serie en diferentes lugares a lo largo de los ejes x e y ejes y luego automáticamente puntadas juntos usando un programa gratuito (por ejemplo, Imagen Composite Editor). En particular, este método se puede utilizar para la evaluación cualitativa y cuantitativa de arborización dendrítica en una zona bastante amplia.

Protocolo

NOTA: Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas aprobadas por el Comité de Investigación Animal de la Sistema de Salud de Asuntos de Veteranos de Palo Alto.

1. Golgi-Cox tinción

1. La extracción de cerebro y tinción
   1. En la primera jornada, profundamente anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina antes de la eutanasia a través desangrado.
   2. Retire con cuidado la bóveda craneal y diseccionar el cerebro.
      1. Primero quitar la piel en la parte superior del cráneo, la colocación de una tijera curvada en la parte superior del cerebelo y suavemente cortar a través de la bóveda craneal paralelo al surco central con la punta de la tijera señalado hacia el exterior, moviéndose en la dirección hacia el bulbo olfatorio. Repita este proceso en ambos lados.
      2. Use un pincet quirúrgico para levantar la bóveda craneal, mientras que si lo gira hacia los bulbos olfatorios y romper con él. A continuación, dar la vuelta el cráneo al revés y utilizar un pico para cortar a través de la ópticanervios y aflojan el cerebro. Por último, utilice la selección para separar el cerebro desde la médula espinal a nivel del foramen magnum.
   3. Inmediatamente sumerja el cerebro en 15 ml de solución comercialmente disponible de Golgi-Cox, sin diluir. Guarde el cerebro en solución de Golgi en una botella de vidrio de 20 ml tapado a temperatura ambiente en la oscuridad.
   4. En el segundo día, se vierte lentamente la solución y reemplazarla con 15 ml de solución de Golgi-Cox fresco. Vuelva a tapar el frasco que contiene el cerebro y dejar en reposo durante otros 9 días en la oscuridad.
2. Seccionamiento y empotramiento
   1. El día 11, colocar los cerebros en solución de sacarosa al 30%, preparado en _ddH2O para la deshidratación. Cambie la solución recién preparada con 30% de sacarosa después de 12 horas. Incubar los cerebros en una solución de sacarosa al 30% durante 3 días a 4 ° C.
   2. El día 14, llenar el depósito de la vibratome con una solución de sacarosa al 30% hasta que la hoja está cubierta. Ajuste la velocidad de 1 mm / s con una amplitud de 0,95 mm.
   3. Seque el cerebro con un Kimwipe para eliminar el exceso de humedad y eliminar el cerebelo utilizando una hoja de afeitar para cortar coronal.
   4. Monte firmemente todo el cerebro a la plataforma vibratome usando pegamento y deje que se seque durante 2-4 min. Inserte la plataforma con el cerebro adherido en el depósito y ajustar la hoja a la parte superior del cerebro.
   5. Utilizando el vibratome, cortar el cerebro en 150 micras de espesor secciones a temperatura ambiente, recordando que cambiar la hoja después de cada tercera cerebro.
   6. Recoge las secciones del depósito con un cepillo pequeño de punta y sumergirlos en una placa de Petri que contiene 0,3% de gelatina hecha en ddH ₂ O. Mientras que las secciones permanecen en la placa de Petri, añadir 0,5 ml de 0,3% de gelatina en cada diapositiva y utilice un cepillo para difundir y recubrir las Superfrost + diapositivas.
   7. Recoger suavemente hasta las secciones sumergidas de la placa de Petri y colocarlos sobre los portaobjetos gelatinizados. Oriente las secciones del cerebro portocarlos sólo en sus lados y no en la parte superior.
   8. Después de unos diez minutos, recubrir las secciones con 30% de sacarosa antes de que el tejido se seque por completo. Luego secar al aire las muestras preparadas en un lugar oscuro en una parrilla corrediza durante 3 días.
   9. Diluir disponible comercialmente solución Desarrollar 10x a 1x usando _ddH2O Sumergir los portaobjetos en solución de revelado para 7-10 min. Enjuague las diapositivas 3 veces en ddH ₂ O.
3. Deshidratación
   1. Preparar 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% y soluciones de etanol usando destilada ddH ₂ O.
   2. Remoje las diapositivas de soluciones cada vez más altas de etanol durante 10 minutos cada uno.
   3. Remojar los portaobjetos en solución de etanol al 100% 3 veces durante 10 min cada vez.
   4. Remoje las diapositivas en el 100% de xileno 3 veces consecutivas durante 5 minutos cada uno, manteniendo las secciones en la solución final hasta que estén encubrimiento resbaló.
   5. Coloque una cantidad generosa de DPX (ftalato de di-n-butilo en xileno) medio de montaje (abfuera 1-1,5 ml) en cada diapositiva utilizando una pipeta de plástico. Coloque cuidadosamente cubreobjetos para evitar burbujas.
   6. Cubierta seca Aire deslizó cerebro secciones horizontalmente durante 3 días.

2. Doublecortin tinción

1. Profundamente anestesiar (consulte el paso 1.1.1) a los animales.
2. Realizar la perfusión cardíaca con recién preparada 4% de paraformaldehído hecho en tampón fosfato ^12.
3. Extraer el cerebro (véase 1.1.2) y se guardan en 45 ml de paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante la noche en un agitador de balanceo.
4. La transferencia de los cerebros de una solución de sacarosa al 30% y esperar a que la deshidratación completa durante 48 horas a 4 ° C. Retire el cerebro a partir de sacarosa y colocarlos directamente en bloques de cobre colocados en hielo seco.
5. Llenar el bloque con la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto y marcar la orientación del cerebro usando el bulbo olfatorio como un hito.
6. El uso de un criostato, cortar secciones 70 micras de espesor a -20 ºC y colocarlosen solución crioprotector (25% de glicol de etileno, 25% de glicerol, en tampón de fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,4) y mantener a -20 ° C hasta su uso.
7. Hacer una solución de 50% de metanol crioprotector y 50%. A esta solución añadir peróxido de hidrógeno al 0,5% (vol / vol). Incubar las secciones flotantes de 30 min a temperatura ambiente.
8. Secciones calientes en 37 ºC en TBS (solución salina tamponada con Tris) para 30-40 min colocándolos en un horno histológico.
9. Incubar las secciones con 0,3% de Triton y 3% de suero de caballo normal durante 45 min a temperatura ambiente antes de la inmunotinción. Incubar las secciones a 4 ºC durante la noche en 3 ml de solución del anticuerpo DCX diluido 1: 500 en TBS con 0,3% de Triton y 1% de suero de caballo normal.
10. Lavar Al día siguiente las secciones 3 veces consecutivas en TBS (10 min cada uno).
11. Incubar las secciones con un caballo biotinilado anti-cabra (1: 200 en TBS) durante dos horas a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 veces consecutivas en TBS (10 min cada uno).
12. Incubar tdobladillo con ABC Lite (1: 1000) durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
13. Añadir 5 l de 30% de H ₂ O ₂ a un comprimido de 10 mg de DAB (3,3 "diaminobenzidine) solución disuelta en 15 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubar las secciones inmediatamente en esta solución durante 5 min.
14. Terminar la reacción por lavado con TBS enfriado con hielo tres veces seguido de un lavado en TBS a temperatura ambiente.
15. Deshidratar secciones usando una serie de soluciones de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min cada uno), aclarar en xileno, y luego cubrir deslizamiento usando DPX como en el paso 1.3.

3. Visualización

1. Tras el secado completo de las secciones, eliminar el exceso de DPX en la parte superior de las diapositivas con una cuchilla afilada, y colocarlos en la etapa de exploración del microscopio. El sistema se compone de un microscopio equipado con la etapa de exploración, palanca de mando, y un color de la cámara 12-bit.
2. Inicie el programa. Abra un nuevo archivo de datos.
3. Lugarun punto de referencia en la pantalla haciendo clic con el puntero del ratón en cualquier lugar. Esto activará todos los iconos del panel de herramientas de la ventana del programa.
4. Haga clic en el icono "Joystick gratis" en la barra de herramientas y luego usar el joystick para localizar el giro dentado del hipocampo en la primera sección.
5. En la pestaña "Herramientas" de la ventana del programa, seleccione "Sección Administrador serie". Haga clic en el icono "Nueva sección" en la esquina inferior izquierda de la ventana. Esto abrirá la ventana "Configuración de la Sección de serie".
6. Seleccione la ventana de la sección de configuración de serie y luego ingrese el número total de secciones que contienen las regiones del hipocampo. Seleccione el intervalo de evaluación. Introduzca el espesor de la sección de corte (70 micras para DCX y 150 m para las secciones teñidas-Golgi).
7. Iniciar rastreo de la región giro dentado haciendo clic en el icono "Freehand Diseño de contorno" en la barra de herramientas. Contorno de la capa de células granulares dentadas.
8. Seleccione "100X" en el menú "Ampliación". Añadir una gota de aceite de inmersión sobre la sección y cambiar el objetivo de 100X. Localice los cuerpos de células granulares dentadas y dendritas marco de este objetivo.
9. Centrarse en una neurona seleccionado y haga clic en el icono "Neurona Rastreo" en la barra de herramientas. Trazar la circunferencia del cuerpo de células granulares dentadas. Cuando termine el rastreo, haga clic derecho para seleccionar "Finalizar Cell Cuerpo".
10. Iniciar rastreo de las dendritas manualmente en X, Y y Z y seguir cada rama con el mando joystick y z-motor. En un nodo de bifurcación o trifurcación, seleccione la opción correspondiente en el menú desplegable en el botón derecho. Traza cada una de las ramas que surgen de estos nodos. Al final de cada rama, haga clic derecho y seleccione "Terminar" en el menú desplegable.
11. Utilizando los iconos de la tecla de flecha en la ventana del software seleccionar aleatoriamente otra de células granulares dentadas y siga el mismo procedimiento que described en el paso 3.9 a 3.10. Guarde todo el trazado.
12. Inicie el software de rastreo neuronal.
13. Abra el primer archivo de datos NRX desde el primer ratón del grupo experimental. Anexar el archivo NRX del segundo ratón del grupo experimental. Continúe hasta que se adjuntan todos los archivos NRX de este grupo.
14. En la ficha Análisis, seleccione "Fan In-diagrama". Esto abre el ventilador en-análisis ventana. Marca de verificación "dendritas" y haga clic en Mostrar, que representa a las longitudes y los patrones de ramificación dendrítica para este grupo de ratones (Figura 1).

4. EDFI

NOTA: Este método permite al usuario grabar rápidamente un gran número de imágenes a través del eje z de cada campo y generar una imagen 2D que contiene todos los píxeles centrados a lo largo del eje z. El resultado será una imagen compuesta que contiene todos los píxeles enfocados de las imágenes recogidas.

1. Conecte el microscopio a una cámara digitalera. Coloque las secciones primera en la etapa de exploración conectado con el microscopio y luego cambiar a un objetivo de 10X. Mueva el escenario para el área de interés.
2. Iniciar un programa de captura de vídeo.
3. Pulse el botón de grabación. Tan pronto como se pulsa el botón de grabación, utilice el mando macro de enfoque para pasar de la parte superior a la parte inferior de la sección para un total de 4 seg. Guarde el archivo de vídeo resultante.
4. Utilice ImageJ software gratuito para convertir los archivos de vídeo AVI en un formato sin compresión abriendo el archivo y guardarlo en formato de archivo sin comprimir.
5. Iniciar un programa de análisis de imagen y abrir el archivo AVI. Ir al menú "Acción" y haga clic en "profundidad de campo". Seleccione el archivo de vídeo correspondiente. En opciones de "salida", seleccione "Generar Composite Best-Focus de imagen".
6. En opciones de "Análisis Focus", seleccione "Normalizado Iluminación" y opciones "Max Contraste Local". A continuación, seleccione "Crecomió ". La imagen resultante representa todos los píxeles centrados a lo largo del eje z (Figura 2).
7. Guarda la imagen resultante.

5. Generar Extremadamente Imágenes de alta resolución

NOTA: Este método permite al usuario generar automáticamente bajo aumento y imágenes de muy alta resolución de imágenes de alta magnificación de alta resolución de forma automatizada.

1. Colocar las secciones primera en la etapa de exploración conectado al microscopio. El microscopio está conectado a una cámara digital. Mueva el escenario para el área de interés.
2. Iniciar un programa de adquisición de imágenes.
3. Utilice un objetivo de 10X y adquirir y guardar imágenes de alta resolución (4076 x 3116) de la región de interés, asegurándose de tener por lo menos 10% de superposición.
4. Image Composite Editor Ejecutar a la puntada imágenes.
5. Ir al menú Archivo y haga clic en "Nuevo Panorama". Seleccione la carpeta en la que las imágenes son stORed. Seleccione las imágenes que pertenecen a la misma región y pulse "ok".
6. Pulse el botón "Exportar a disco" y guardar la imagen. Esta imagen representa una imagen de muy alta resolución de la zona de interés que podrían ser utilizados para el análisis y / o demostración (Figura 3).

Resultados

La extensión de la arborización derivada de células granulares dentadas existentes y recién nacidos se analizó en ratones de tipo salvaje utilizando Golgi-Cox o tinción DCX (Figura 1). Se encontraron segmentos dendríticos de células DCX-positivas que ser 13 a 36 micras de largo. La distribución normal de la longitud dendrítica se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; las figuras 4 y 5).

Discusión

Aquí, dos métodos se describieron para cuantificar el grado de arborización dendrítica en las neuronas maduras y recién nacidos utilizando métodos de tinción convencionales en conjunción con RTI y EDFI. La adquisición de imágenes de alta resolución de las neuronas proporciona un método extremadamente útil para probar los efectos perjudiciales de los trastornos neurodegenerativos y, a su vez, proporciona un medio para evaluar las estrategias terapéuticas que se dirigen a las neuronas del hipocampo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00