הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

Summary

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Abstract

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introduction

שינויים דינמיים במספר ובמבנה של סינפסות הם מסימני היכר של פיתוח, הזדקנות, והפרעות ניווניות רבות ^1-3. היכולת של נוירונים לקבל ולשלב מידע הסינפטי תלויה מורפולוגיה הדנדריטים ושינויים דינמיים בקשרים סינפטיים. ואכן, נמצא מתאם חיובי בין עמוד השדרה הדנדריטים ומספר סינפסה, ששניהם משפיעים על תפקוד הקוגניטיבי ^4. לפיכך, אין זה מפתיע שdecrements במספר עמוד השדרה דנדריטים נקשר עם תפקוד קוגניטיבי לקוי במספר הפרעות נוירולוגיות ^5-7, מה שגרם עניין רב בכימות עמוד השדרה הדנדריטים. אף על פי כן, כימות של צפיפות עמוד השדרה נשארה זמן רב ומשימה מייגעת שלא מצליח לייצר מידע שימושי בנוגע לטופוגרפיה וההפצה של סינפסות על פני העץ הדנדריטי. למרבה המזל, בשיטות צביעה (למשל, Golgi-קוקס וdoublecortin (DCX)) בשיתוףבעזרת שיטות הדמיה מתוחכמות יכול להיות מנוצל כדי להתגבר על מחסומים הנוכחיים ולהפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של arborization הדנדריטים באופן אמין ומהיר. בעוד ששיטת צביעת Golgi-קוקס ניתן לפרוס על מנת להעריך את המצב של arborization הדנדריטים בכל הנוירונים ^8, ניתן לפרוס DCX לתייג נוירונים שזה עתה נולד במיוחד ברכס המשונן ואזור subventricular ^9, שיקול חשוב בהתחשב בכך שneurogenesis מתרחשת בשני אזורים אלה בתוחלת החיים ^10,11.

בעקבות צביעה, שתי שיטות הדמיה נפרסו להעריך מאפיינים דנדריטים: i) הדמיה בזמן אמת (RTI) ו- II) עומק מורחב של הדמיה שדה (EDFI). טכניקת RTI מספקת בממוצע לאתר ולכמת את האורך וסדר arborization לאורך המקטעים דנדריטים הפרט וסניפים. כך שהוא מאפשר לאמוד את השטח ונפח שנכבש על ידי כל עץ הדנדריטי הכולל. עוד specifically, בשיטת RTI המשתמש ברציפות מזהה את הקטעים והפניה מחודש איטרטיבי כנוירון התחקות תוכנה אוסף את x, y, z וקואורדינטות של המבנה הדנדריטי ומשחזר את מסלולו של המבנה הדנדריטי ב3D. יחסית, שיטת EDFI מספקת אמצעי פשוט למדי ומזורז להערכת צפיפות דנדריטים בדגימות רקמה עבות למדי על ידי יצירת תמונה מורכבת, מתן מידע על Z- הציר כולו. לשם כך, המשתמש רשומות קבצי וידאו בחדות גבוה בכל העובי של הסעיף ולאחר מכן משתמש בתוכנה כדי לחפש מסגרות וידאו לזהות נקודות בי פיקסל הוא לגמרי בפוקוס. בהמשך לכך, פיקסלים ממוקדים מתמזגים ומשתלבים ברזולוציה גבוהה, תמונת 2D מורכבת. תמונה מורכבת זה מכילה את כל הפיקסלים שהיו בפוקוס, ללא קשר למיקום שלהם בציר z. ניתוח איכותי וכמותי של תמונות 2D אלה יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את הצפיפותשל הדנדריטים הסתעפות בכל תחום.

לבסוף, אנו מציגים שיטת פנורמי ליצירת מאוד תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוח וההערכה של דנדריטים באזור כולו של עניין. טכניקה זו ניתן לפרוס כדי להתגבר על חוסר הנגישות לרזולוציה גבוהה מאוד ומצלמות דיגיטליות יקרות. באמצעות שיטה זו, אחד לוכד תמונות סידורי במקומות שונים לאורך הקואורדינטות x ו- y צירים ולאחר מכן באופן אוטומטי תפרים אותם יחד באמצעות תוכנה חופשית (למשל, תמונה מורכבת עורך). יש לציין, שיטה זו יכולה לשמש להערכה איכותית וכמותית של arborization הדנדריטים באזור רחב למדי.

Protocol

הערה: ניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים אושרו על ידי הוועדה למחקר בבעלי חיים במערכת הבריאות לענייני יוצאי צבא פאלו אלטו.

1. Golgi-קוקס מכתים

1. חילוץ מוח וצביעה
   1. ביום 1 ב, עמוק להרדים עכברים עם 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם xylazine לפני הרדמת החסד באמצעות exsanguination.
   2. מוציא בזהירות את calvarium ולנתח את המוח.
      1. ראשית להסיר את העור בחלק העליון של הגולגולת, הצבת מספריים מעוגלים בחלקו העליון של המוח הקטן ובעדינות לחתוך המקביל calvarium למענית המרכזית עם הקצה של המספריים הצביע החוצה, נע בכיוון לכיוון הנורה חוש הריח. חזור על תהליך זה בשני הצדדים.
      2. השתמש pincet כירורגית להרים calvarium תוך הפיכתו לכיוון נורות חוש הריח ולשבור אותו. ואז, להפוך את הגולגולת הפוכה ולהשתמש איסוף לחתוך האופטיעצבים ולשחרר את המוח. לבסוף, השתמש בבחירה להפריד את המוח מחוט השדרה ברמה של מגנום foramen.
   3. מייד לטבול את המוח ב- 15 מיליליטר של תמיסה מסחרית-זמינה, חי Golgi-קוקס. אחסן את המוח בפתרון Golgi ב, בקבוק זכוכית 20 מיליליטר כתרים בטמפרטורת חדר בחושך.
   4. , ביום 2 לשפוך לאט את הפתרון ולהחליף אותו עם 15 מיליליטר פתרון Golgi-קוקס טרי. לסכם את הבקבוק המכיל את המוח ולהשאיר ללא הפרעה לעוד 9 ימים בחושך.
2. חתך וembedment
   1. ביום ה -11, מקום המוח בתמיסת סוכרוז 30%, שהוכן DDH ₂ O להתייבשות. לשנות את הפתרון עם סוכרוז 30% מוכנים טרי לאחר 12 שעות. דגירה המוח בתמיסת סוכרוז 30% במשך 3 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
   2. ביום ה -14, למלא את המאגר של vibratome עם תמיסת סוכרוז 30% עד שהלהב מכוסה. קבע את המהירות 1 מ 'ים עם משרעת של 0.95 מ"מ מ '/.
   3. למחוק את המוח עם Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת ולהסיר את המוח הקטן באמצעות סכין גילוח לחתוך coronally.
   4. בתוקף לעלות את המוח כולו על גבי פלטפורמת vibratome באמצעות דבק מגע ולאפשר לו להגדיר במשך 2-4 דקות. הכנס את הפלטפורמה עם המוח דבק לתוך המאגר ולהתאים את הלהב לחלק העליון של המוח.
   5. באמצעות vibratome, פורס את המוח ל-150 מיקרומטר חלקים עבים בטמפרטורת חדר, לזכור להחליף את הלהב לאחר כל מוח 3.
   6. להרים את החלקים מהמאגר בעזרת מברשת היטה קטנה ולטבול אותם לתוך צלחת פטרי המכילה ג'לטין 0.3% תוצרת DDH ₂ O. בעוד הסעיפים יישארו בצלחת פטרי, להוסיף 0.5 מיליליטר של ג'לטין 0.3% בכל שקופית ולהשתמש במברשת כדי להפיץ ומעיל Superfrost + השקופיות.
   7. בעדינות להרים את החלקים שקועים מצלחת פטרי ומניח אותם על גבי שקופיות gelatinized. כוון את החלקים במוח על ידילגעת בם רק על צדם ולא על ראשי.
   8. לאחר כעשר דקות, מעיל הקטעים עם סוכרוז 30% לפני הרקמה מתייבשת לגמרי. לאחר מכן אוויר יבש השקופיות מוכנות במקום חשוך במעמד שקופית במשך 3 ימים.
   9. לדלל פתרון 10x מסחרי-זמין לפיתוח 1x באמצעות DDH ₂ O. לטבול את השקופיות בפיתוח פתרון ל7-10 דקות. יש לשטוף את השקופיות 3 פעמים בDDH ₂ O.
3. התייבשות
   1. הכן 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ופתרונות אתנול% 95 באמצעות DDH ₂ O. מזוקק
   2. משרים את השקופיות בפתרונות אתנול גבוהים יותר ויותר במשך 10 דקות כל אחד.
   3. משרים את השקופיות ב 100% פתרון אתנול 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
   4. משרים את השקופיות ב 100% קסילן 3 פעמים ברציפות במשך 5 דקות כל אחד, שמירה על הסעיפים בפתרון הסופי עד שהם החליקו-כיסוי.
   5. מניחים כמות נדיבה של DPX (phthalate Di-n-בוטיל בקסילן) הרכבה בינונית (ab1-1.5 מתוך מיליליטר) על כל שקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק. זהירות במקום coverslips כדי למנוע בועות.
   6. כיסוי האוויר יבש החליק-מוח סעיפים אופקי במשך 3 ימים.

2. Doublecortin מכתים

1. עמוק להרדים (ראה שלב 1.1.1) בעלי החיים.
2. בצע זלוף לב עם paraformaldehyde 4% מוכנים טרי שנעשה בחיץ פוספט ^12.
3. חלץ את המוח (ראה 1.1.2) וחנות ב -45 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך לילה על שייקר נדנדה.
4. העבר את המוח לפתרון סוכרוז 30% ולחכות להתייבשות מלאה במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את המוח מסוכרוז ומניח אותם ישירות על בלוקי נחושת מונחים על קרח יבש.
5. מלא את הבלוק עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר) ולסמן את הכיוון של המוח באמצעות הנורה חוש הריח כנקודת ציון.
6. באמצעות cryostat, לחתוך 70 סעיפים מיקרון עבים ב -20 ºC ולמקם אותםבפתרון cryoprotectant (25% אתילן גליקול, גליצרול 25%, ב0.05 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.4) ולשמור ב -20 ° C עד לשימוש.
7. הפוך פתרון של 50% מתנול cryoprotectant ו -50%. לפתרון זה מוסיף 0.5% מי חמצן (כרך / כרך). סעיפי דגירה צף במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
8. קטעים חמים ב -37 ºC בTBS (נאגר מלוח טריס) במשך 30-40 דקות על ידי הצבת אותם בתנור היסטולוגית.
9. דגירה הקטעים עם טריטון 0.3% ו -3% בסרום סוס רגיל במשך 45 דקות בטמפרטורת חדר לפני immunostaining. דגירה הסעיפים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 3 מיליליטר פתרון של נוגדן DCX בדילול 1: 500 בTBS עם טריטון 0.3% ו -1% בסרום סוס רגיל.
10. למחרת לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד).
11. סעיפי דגירה עם אנטי-עז סוס biotinylated (1: 200 בTBS) לשתי שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד).
12. דגירה tמכפלת עם ABC לייט (1: 1000) תמורת 1.5 שעות בטמפרטורת חדר.
13. הוסף 5 μl של H 30% ₂ O ₂ לטבליה אחת של 10 מ"ג של DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) פתרון המומס ב 15 מיליליטר של 1 M טריס- HCl (pH 7.6). דגירה הסעיפים מייד בפתרון זה במשך 5 דקות.
14. לסיים את התגובה על ידי שטיפתם עם כפות קרות כקרח שלוש פעמים ואחרי שטיפה אחת בTBS בטמפרטורת חדר.
15. ליבש חלקים באמצעות סדרה של פתרונות אתנול (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 דקות כל אחד), ברורה בקסילן, ואז לכסות להחליק באמצעות DPX כמו בשלב 1.3.

3. ויזואליזציה

1. בעקבות ייבוש של החלקים שלמים, להסיר DPX העודף על גבי השקופיות עם להב חד, ומניח אותם על הבמה הסריקה של מיקרוסקופ. המערכת מורכבת של מיקרוסקופ מצויד בשלב סריקה, ג'ויסטיק, ומצלמה 12-bit צבע.
2. הפעל את התכנית. פתיחת קובץ נתונים חדש.
3. מקוםנקודת התייחסות על המסך על ידי לחיצה עם סמן העכבר בכל מקום. זה יהיה להפעיל את כל הסמלים מהלוח הכלי של חלון תכנית.
4. לחץ על הסמל "ג'ויסטיק חינם" בסרגל הכלים ולאחר מכן להשתמש בג'ויסטיק כדי לאתר את gyrus המשונן של ההיפוקמפוס בסעיף הראשון.
5. בכרטיסייה "כלים" של חלון התכנית, בחר "מנהל מדור סידורי". לחץ על הסמל "סעיף חדש" בפינה השמאלית התחתונה של החלון. הפעולה זו תפתח את החלון "הגדרת סעיף סידורי".
6. בחר את חלון הגדרת סעיף הסידורי ולאחר מכן להזין את המספר הכולל של קטעים המכילים אזורים בהיפוקמפוס. בחר את מרווח ההערכה. הזן את עובי חתך סעיף (70 מיקרומטר לDCX ו -150 מיקרומטר לחלקים צבעוניים Golgi).
7. התחל התחקות אזור gyrus המשונן על ידי לחיצה על הסמל "Freehand Contour הציור" בסרגל הכלים. להתוות את שכבת תאים הגרעינית משוננת.
8. בחר באפשרות "100X" מתפריט "הגדלה". להוסיף טיפה של שמן טבילה בסעיף ולעבור למטרת 100X. אתר את הגופים המשונן תא גרגיר ודנדריטים תחת מטרה זו.
9. להתמקד בנוירון שנבחר ולחץ על הסמל "Neuron Tracing" בסרגל הכלים. עקוב אחר ההיקף של גוף תא גרגיר המשונן. בסיום מעקב, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור "תא בגוף סיום".
10. התחל מעקב דנדריטים ידני בx, y, z וכיוונים ועיקבו אחרי כל ענף באמצעות כפתור הג'ויסטיק וz-מוטורי. בצומת הסתעפות או trifurcation, בחר את האפשרות המתאימה מהתפריט הנפתח על הלחצן ימני של העכבר. עקוב אחר כל אחד מהענפים הנובעים מבלוטות אלה. בסופו של כל סניף קליק ימני ובחר "סיום" מהתפריט הנפתח.
11. שימוש בסמלי מקש החץ בחלון התוכנה יבחר באופן אקראי תא אחר גרגיר המשונן ובצע את אותו הנוהל כמו described בשלב 3.9-3.10. שמור את כל המעקב.
12. הפעל את תוכנת מעקב העצבית.
13. פתח את קובץ נתוני NRX הראשון מהעכבר הראשון של קבוצת הניסוי. צרף את קובץ NRX של העכבר השני של קבוצת הניסוי. המשך עד שכל קבצי NRX מקבוצה זו יתווספו.
14. תחת לשונית ניתוח, בחר "מאוורר ב- תרשים". פעולה זו פותחת את החלון ב- ניתוח המאוורר. בדוק "דנדריטים" סימן ולחץ על תצוגה, המתארת ​​את האורכים ודפוסי הסתעפות של הדנדריטים עבור קבוצה זו של עכברים (איור 1).

4. EDFI

הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש להקליט במהירות מספר רב של תמונות דרך Z- הציר של כל שדה וליצור תמונת 2D המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z. התוצאה תהיה תמונה מורכבת המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים מתמונות שנאספו.

1. חבר את המיקרוסקופ למצלמת דיגיטליתעידן. מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ ולאחר מכן לעבור למטרת 10X. הזז את הבמה לאזור של עניין.
2. להפעיל תכנית לכידת וידאו.
3. לחץ על כפתור ההקלטה. ברגע שכפתור ההקלטה נלחץ, השתמש בכפתור מאקרו הפוקוס כדי לעבור מהחלק העליון לחלק התחתון של הסעיף עבור הסכום כולל של 4 שניות. שמור את קובץ וידאו וכתוצאה מכך.
4. השתמש בתוכנה חופשית ImageJ להמיר קבצי וידאו מסוג AVI לפורמט דחוס על ידי פתיחת הקובץ ולשמור אותם בפורמט קובץ דחוס.
5. התחל תכנית ניתוח תמונה ולפתוח את קובץ AVI. עבור לתפריט "תהליך" ולחץ על "עומק שדה מורחב". בחר את קובץ וידאו המתאים. באפשרויות "פלט", בחר "צור תמונה הטובה ביותר-פוקוס Composite".
6. באפשרויות "פוקוס ניתוח", בחר "מנורמלת תאורה" ואפשרויות "ניגודיות המקומית מקס". לאחר מכן, בחר "Creאכל ". התמונה המתקבלת מייצגת את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z (איור 2).
7. שמור את התמונה וכתוצאה מכך.

5. יצירת תמונות ברזולוציה מאוד גבוהות

הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור באופן אוטומטי בהגדלה נמוכה ומאוד תמונות ברזולוציה גבוהה מתמונות ברזולוציה גבוהה בהגדלה גבוהה באופנת automatized.

1. מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ. מיקרוסקופ מחובר למצלמה דיגיטלית. הזז את הבמה לאזור של עניין.
2. התחל תכנית רכישת תמונה.
3. השתמש במטרת 10X ולרכוש ולשמור ברזולוציה גבוהה (4076 x 3116) תמונות מהאזור של עניין ולוודא שיש לפחות 10% חפיפה.
4. תמונה לרוץ Composite עורך לתפור תמונות.
5. עבור אל תפריט קובץ, ולחץ על "ניו פנורמה". בחר את התיקייה שבה התמונות הן stכבדתי. בחר את התמונות ששייכים לאותו האזור ולחץ על "אישור".
6. לחץ על לחצן "יצוא לדיסק" ולשמור את התמונה. תמונה זו מייצגת תמונה ברזולוציה גבוהה מאוד של תחומי עניין של שיכול לשמש לניתוח ו / או הפגנה (איור 3).

תוצאות

של arborization הנובע מתאי גרגיר המשונן קיימים ושזה עתה נולדו המידה נותחה בעכברים מסוג בר או באמצעות Golgi-קוקס או הכתמת DCX (איור 1). מגזרי דנדריטים של תאי DCX-חיוביים נמצאו להיות ארוך 13-36 מיקרון. ההתפלגות הנורמלית של אורך דנדריטים נבדקה באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב ...

Discussion

כאן, שתי שיטות שתוארו לכמת את היקף arborization הדנדריטים בתאים בוגרים וזה עתה נולד בשיטות צביעה קונבנציונליות בשיתוף עם RTI וEDFI. הרכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי עצב מספקת שיטה מאוד שימושית לבדיקת ההשפעות המזיקות של הפרעות ניווניות ו, בתורו, מספקת אמצעי להערכת אסטרט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00