Оценка ветвления дендритов в зубчатой ​​извилине гиппокампа области у мышей

Резюме

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Аннотация

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Введение

Динамические изменения в количестве и структуре синапсов являются отличительными чертами развития, старения, а также многочисленные нейродегенеративные расстройства ^1-3. Способность нейронов получать и интегрировать синаптической информации зависит от дендритных морфологии и динамических изменений в синаптических соединений. Действительно, положительная корреляция существует между дендритных позвоночника и количество синапсов, которые, как повлиять на когнитивные функции ^4. Таким образом, нет ничего удивительного в том, что уменьшается на единицу в дендритной числа позвоночника были связаны с когнитивной дисфункции в ряде неврологических расстройств ^5-7, побуждая большой интерес к дендритной количественного позвоночника. Тем не менее, количественное определение плотности позвоночника остается много времени и утомительной задачей, которая не генерирует полезную информацию о топографии и распределения синапсов через дендритной дерева. К счастью, методы окраски (например, Гольджи-Кокса и Даблкортин (DCX)) в сочетаниисо сложными методами визуализации может быть использован для преодоления существующих барьеров и создания изображений с высоким разрешением ветвления дендритов в надежной и оперативным образом. В то время как метод окрашивания Гольджи-Кокса могут быть развернуты для оценки состояния ветвления дендритов во всех нейронов ^8, DCX могут быть развернуты для обозначения новорожденных нейронов, особенно в зубчатой ​​извилине и субвентрикулярной зоне ^9, важный фактор, учитывая, что нейрогенез происходит в обоих эти регионы на протяжении всей жизни ^10,11.

После окрашивания два метода визуализации были развернуты для оценки дендритных характеристики: я) в реальном времени томография (РТИ) и б) Увеличение глубины резкости изображений (EDFI). Техника RTI обеспечивает среднее проследить и количественно длину и порядок разветвление вдоль отдельных дендритных сегментов и отраслей. Таким образом, она позволяет оценить общую площадь и объем, занимаемый каждым дереве дендритов. Ещё Specifically, в способе РТИ пользователь постоянно определяет сегменты и перефокусирует многократно, как нейрон отслеживания программного обеспечения собирает X, Y, и Z координаты дендритной структуры и восстанавливает траекторию дендритной структуры в 3D. Для сравнения, метод EDFI обеспечивает достаточно простые и быстрые средства для оценки дендритных плотность в образцах довольно толстых тканей путем создания составного изображения, обеспечивая информацию о всей оси. Чтобы сделать это, пользователь записывает видео высокой четкости файлы по всей толщине секции, а затем использует программное обеспечение для поиска видеокадров для идентификации точки, в котором пиксель полностью в фокусе. Впоследствии, ориентированные пикселы объединяются и интегрируются в высоком разрешении, композитный 2D изображения. Это составное изображение содержит все пиксели, которые были в фокусе независимо от их положения на оси Z. Качественный и количественный анализ этих 2D-изображений может быть использован в дальнейшем для определения плотностидендритных ветвлений в каждой области.

Наконец, мы представляем панорамный метод для генерации чрезвычайно высоким разрешением изображения для анализа и оценки дендритов в целой области интереса. Этот метод может быть развернута, чтобы преодолеть отсутствие доступа к очень высоким разрешением и дорогих цифровых камер. Используя этот метод, один захватывает последовательные изображения в различных местах вдоль х и у топоров, а затем автоматически сшивает их вместе, используя бесплатное программное обеспечение (например, изображения Композитный редактор). Следует отметить, что этот метод может быть использован для качественного и количественного определения ветвления дендритов в довольно большой площади.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты были проведены в соответствии с этическими стандартами, утвержденными Комитетом по исследованиям животных в системе здравоохранения по делам ветеранов в Пало-Альто.

1. Гольджи-Кокса Окрашивание

1. Добыча Мозг и окрашивание
   1. На первый день, глубоко анестезию мышей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина до эвтаназии с помощью обескровливания.
   2. Осторожно снимите свода черепа и рассекать из мозга.
      1. Первый удаления кожи на верхней части черепа, размещение изогнутую ножницы в верхней части мозжечка и осторожно прорезать свода черепа параллельно центральной борозды с кончиком ножниц обращена наружу, двигаясь в направлении к обонятельной луковицы. Повторите этот процесс с обеих сторон.
      2. Используйте хирургическую pincet поднять свода черепа при повороте ее в направлении обонятельных луковиц и сломать его. Тогда, переверните череп с ног на голову и использовать кирку, чтобы прорваться через оптикойнервы и ослабить мозг. И, наконец, использовать выбор, чтобы отделить мозг от спинного мозга на уровне затылочного отверстия.
   3. Сразу погрузиться в мозг в 15 мл коммерчески доступного, неразбавленным раствором Гольджи-Кокса. Хранить в мозг Гольджи раствора в закрытой, 20 мл стеклянный флакон при комнатной температуре в темноте.
   4. На 2-й день, медленно вылейте раствор и заменить его 15 мл свежего раствора Гольджи-Кокса. Напомним бутылку, содержащую мозги и оставить в покое еще на 9 дней в темноте.
2. Секционирование и посадки
   1. На 11-й день, место мозги в 30% растворе сахарозы, подготовленные в DDh ₂ O для обезвоживания. Изменение раствора свежеприготовленного 30% сахарозы после 12 часов. Инкубируйте мозги в 30% -ном растворе сахарозы в течение 3 дней при температуре 4 ° С.
   2. На 14-й день, заполните резервуар vibratome с 30% раствором сахарозы в пока лезвие не покрыта. Установить скорость 1 мм / с с амплитудой 0,95 мм.
   3. Пятно мозги с Kimwipe, чтобы удалить лишнюю влагу и удалить мозжечок, используя лезвие бритвы, чтобы сократить коронки.
   4. Надежно смонтировать весь мозг на vibratome платформы с помощью суперклея и позволить ему установить в течение 2-4 мин. Вставьте платформу с прикрепленной мозга в резервуар и регулировать лезвие, чтобы в верхней части головного мозга.
   5. Использование vibratome, нарезать на мозг в 150 мкм секций при комнатной температуре, запоминание изменить лезвие после каждого третьего мозга.
   6. Возьмите разделы из резервуара с помощью небольшого наконечником кисть и погружают их в чашку Петри, содержащую 0,3% желатина, достигнутый в DDh ₂ O. В то время как сечения остаются в чашке Петри, добавляют 0,5 мл 0,3% желатина на каждом слайде и использовать кисть, чтобы распространить и пальто SuperFrost + слайды.
   7. Аккуратно поднять погруженных участков из чашки Петри и помещают их на желатинизированные слайдов. Сориентируйте срезы головного мозга покасаясь их только на их сторонах, а не на вершинах.
   8. После примерно десяти минут нанесите на участки с 30% сахарозы до тканей полностью высохнет. Тогда воздух сухой подготовленные слайды в темном месте в режиме слайд-стойку в течение 3 дней.
   9. Развести имеющихся в продаже 10x Разработка решение 1x помощью DDh ₂ O. Погрузитесь слайдов в разработке решения для 7-10 мин. Промыть слайды 3 раза в DDh ₂ O.
3. Обезвоживание
   1. Подготовка 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% этанола решений с использованием дистиллированной DDH ₂ O.
   2. Замочите слайдов в более высоких решений этанол на 10 минут каждый.
   3. Замочите слайдов в 100% -ном растворе этанола 3 раза в течение 10 мин каждый раз.
   4. Замочите слайдов в 100% ксилола 3 раза подряд 5 мин каждая, сохраняя разделы в конечном растворе, пока они не прикрытие поскользнулся.
   5. Поместите щедрое количество DPX (ди-н-бутил фталат в ксилоле) монтажа среде (ABиз 1-1,5 мл) на каждого слайда, используя пластиковую передачи пипетки. Осторожно положите покровные, чтобы избежать пузырей.
   6. Воздух сухой покров поскользнулся-мозговые участки по горизонтали на 3 дня.

2. Даблкортин Окрашивание

1. Глубоко обезболить (см шаг 1.1.1) животных.
2. Выполните сердечной перфузии со свежеприготовленным 4% параформальдегида, сделанные в фосфатном буфере ^12.
3. Выписка мозги (1.1.2) и в магазине в 45 мл 4% параформальдегида при 4 ° С в течение ночи на ротационном шейкере.
4. Передача мозги 30% раствора сахарозы в и ждать полного обезвоживания в течение 48 ч при 4 ° С. Удалить мозги из сахарозы и разместить их непосредственно на медных блоков, размещенных на сухом льду.
5. Заполните блок с оптимальным температурным резки (OCT) соединения и отметить ориентацию мозга с помощью обонятельной луковицы в качестве ориентира.
6. Использование криостат, разрезать 70 мкм срезы толщиной при -20 ° С и поместить ихВ криопротектора раствора (25% этиленгликоля, 25% глицерина, в 0,05 М буфере фосфата натри, рН 7,4) и держать при температуре от -20 ° С до использования.
7. Сделать раствор 50% криопротектора и 50% метанола. К этому раствору добавляют 0,5% пероксида водорода (об / об). Инкубируйте плавающей секции в течение 30 мин при комнатной температуре.
8. Теплые участки в 37 ° С в TBS (трис-солевой буфер) в течение 30-40 мин, помещая их в гистологической печи.
9. Инкубируйте участки с 0,3% тритона и 3% нормальной лошадиной сыворотки в течение 45 мин при комнатной температуре до иммунной. Инкубируйте секций на 4 ° С в течение ночи в 3 мл раствора антитела DCX разбавленного 1: 500 в TBS с 0,3% тритона и 1% нормальной лошадиной сыворотки.
10. На следующий день мыть разделах 3 раза подряд в TBS (10 мин каждый).
11. Инкубировать срезы с биотинилированным анти-лошади козы (1: 200 в TBS) в течение двух часов при комнатной температуре. Вымойте разделах 3 раза подряд в TBS (10 мин каждый).
12. Выдержите ткромка с ABC Lite (1: 1000) в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
13. Добавить 5 мкл 30% H ₂ O ₂ в одной таблетке 10 мг ДАБ (3,3 ") -Diaminobenzidine раствора, растворенного в 15 мл 1 М Трис-HCl (рН 7,6). Сразу же Инкубируйте секций в этом растворе в течение 5 мин.
14. Завершение реакции промыванием их ледяным три раза TBS с последующей одной промывкой в ​​TBS при комнатной температуре.
15. Высушить с помощью секции серию растворов этанола (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 мин каждый), четкое в ксилоле, а затем покрывают скольжения с помощью DPX, как на стадии 1.3.

3. Визуализация

1. После полного высыхания секции, удалить излишки DPX на вершине горки с острым лезвием, и разместить их на этапе сканирования микроскопа. Система состоит из микроскопа, снабженного этапе сканирования, джойстика и 12-битного цвета камеры.
2. Запустите программу. Откройте новый файл данных.
3. МестоОпорная точка на экране, щелкнув указателем мыши в любом месте. Это активирует все иконки на панели инструментов окна программы.
4. Нажмите на иконку "Джойстик Free" на панели инструментов, а затем с помощью джойстика найдите зубчатой ​​извилине гиппокампа в первом разделе.
5. На вкладке "Сервис" в окне программы, выберите "Serial Раздел Manager". Нажмите на иконку "Новый раздел" на нижнем левом углу окна. Это откроет окно «Настройка последовательного сечения".
6. Выберите последовательный окно настройки секции и затем введите общее количество разделов, которые содержат гиппокампа регионах. Выберите интервал оценки. Введите Раздел толщина резки (70 мкм для DCX 150 мкм для Гольджи окрашенных срезов).
7. Начать трассировку зубчатой ​​извилине область, нажав на значок "Freehand Контур рисунка" на панели инструментов. Опишите зубчатые зернистый слой.
8. Выберите "100X" из меню "увеличивающим". Добавить каплю иммерсионного масла на участке и включить цель 100X. Найдите зубчатые тела ЗК и дендриты в рамках данной цели.
9. Сосредоточьтесь на выбранной нейрона и нажмите на значок "Нейрон розыска" на панели инструментов. Проследите окружность зубчатого тела гранулярных клеток. После завершения трассировки, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать "Finish Cell Body".
10. Начать трассировку дендриты вручную в х, у и направлениях г и следуйте каждую ветвь с помощью ручки джойстика и Z-двигателя. В бифуркации или трифуркации узла, выберите соответствующую опцию из выпадающего меню при правой кнопкой мыши. Трассировка каждой из ветвей, которые возникают из этих узлов. В конце каждой ветви правой кнопкой мыши и выберите "Завершение" из выпадающего меню.
11. Используя клавишу со стрелкой иконки в окне программы случайным образом выбрать другой зубчатой ​​ЗК и следовать той же процедуре, что и DESCRibed в шаге 3.9-3.10. Сохраните всю трассировку.
12. Запустите программу нейронов трассировки.
13. Открыть первый файл данных NRX от первой мыши из экспериментальной группы. Добавление файла NRX второго мыши из экспериментальной группы. Продолжайте, пока все файлы NRX из этой группы не добавляются.
14. На вкладке Analysis, выберите "вентилятор в-схема". Это открывает вентилятор в-анализа окно. Галочка "дендриты" и нажмите дисплей, который изображает длины и ветвления шаблоны дендритов для этой группы мышей (рис 1).

4. EDFI

Примечание: Этот метод позволяет пользователю быстро записывать большое количество изображений с помощью Z-оси каждого поля и создать 2D изображение, которое содержит все сфокусированные пикселей по всей оси. Результат будет составное изображение, которое содержит все сосредоточены пикселей от собранных изображений.

1. Подключите микроскоп к цифровому кулачкаЭпоха. Поместите разделы первую очередь на этапе сканирования, подключенного к микроскопу, а затем перейти к цели в 10 раз. Перемещение на сцену, чтобы интересующей области.
2. Запуск программы оцифровки изображений.
3. Нажмите на кнопку записи. Как только будет нажата кнопка записи, с помощью ручки макро-фокус, чтобы перейти от верхней к нижней части раздела в общей сложности 4 сек. Сохраните полученный видеофайл.
4. Используйте ImageJ бесплатная программа для преобразования AVI видео файлов в несжатом формате, открыв файл и сохранять их в несжатом формате.
5. Начните программу анализа изображения и откройте файл AVI. Перейти к меню "Process" и нажмите на кнопку "Увеличение глубины резкости». Выберите соответствующий видеофайл. В «выхода» вариантов, выберите "Создать композитный Best-фокус изображения".
6. В «Фокус анализ» вариантов, выберите "нормализованное Освещение" и "Макс локальный контраст" варианты. Затем выберите "Creели ". Полученное изображение представляет все целенаправленные пикселей по всей оси (рис 2).
7. Сохраните полученное изображение.

5. Создание Экстремально высокое разрешение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет пользователю автоматически генерировать низкой кратности и чрезвычайно изображения с высоким разрешением изображения с высоким увеличением высоким разрешением, в автоматизированной форме.

1. Поместите секции первого на этапе сканирования, подключенного к микроскопу. Микроскоп подключен к цифровой камере. Перемещение на сцену, чтобы интересующей области.
2. Начните программу захвата изображений.
3. Используйте цели 10X и приобрести и сохранить высокое разрешение (4076 х 3116) изображения с интересующей нас области убедившись, что есть по крайней мере 10% перекрытие.
4. Запустите Image Composite Editor, чтобы сшить изображений.
5. Перейти к меню File и нажмите на "Новом Панорама". Выберите папку, в которой Изображения улORed. Выберите изображения, которые принадлежат к той же области и нажмите "OK".
6. Нажмите кнопку "Экспорт на диск" и сохраните изображение. Это изображение представляет картину чрезвычайно высоким разрешением области интересов, которые могут быть использованы для анализа и / или демонстрации (рисунок 3).

Результаты

Степень разветвление, вытекающие из существующих и вновь рожденных зубчатой ​​ЗК была проанализирована в мышей дикого типа с использованием либо Гольджи-Кокса или DCX окрашивание (рисунок 1). Дендритные сегменты DCX-позитивных клеток были признаны пор 13-36 мкм. Нормальное распре...

Обсуждение

Вот два способа были описаны количественно степень ветвления дендритов в зрелых и новорожденных нейронов с помощью обычных методов окрашивания в сочетании с РТИ и EDFI. Получение изображений высокого разрешения нейронов обеспечивает чрезвычайно полезный метод для проверки вредное во?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00