Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Zusammenfassung

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Zusammenfassung

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Einleitung

Dynamische Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Synapsen sind die Markenzeichen der Entwicklung, Alterung, und zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen ^1-3. Die Fähigkeit der Neuronen synaptische Informationen zu erhalten und zu integrieren, hängt von dendritischen Morphologie und dynamische Veränderungen synaptischer Verbindungen. Tatsächlich existiert eine positive Korrelation zwischen dendritischen Dorn und Synapsen Nummer, die sowohl die kognitiven Funktionen beeinflussen ^4. So ist es nicht verwunderlich, dass Verringerungen in dendritischen Dorn Nummer haben mit kognitiven Störungen in einer Reihe von neurologischen Erkrankungen ^5-7 in Verbindung gebracht, woraufhin ein großes Interesse an dendritischen Dorn Quantifizierung. Dennoch ist die Quantifizierung der Wirbelsäule Dichte bleibt eine zeitaufwendige und mühsame Aufgabe, die nützliche Informationen über die Topographie und die Verteilung von Synapsen auf der Dendritenbaum erzeugen ausfällt. Glücklicherweise Färbemethoden (zB Golgi-Cox und Double (DCX)) in Verbindungmit hoch entwickelten bildgebenden Verfahren kann eingesetzt werden, um Strombarrieren überwinden und hochaufgelöste Bilder von dendritischen Verzweigung in einem zuverlässigen und schnellen Weise. Während Golgi-Cox-Färbung eingesetzt werden kann, um den Zustand der dendritischen Verzweigung in allen Neuronen ⁸ beurteilen können DCX eingesetzt werden, um neugeborene Neuronen besonders im Gyrus dentatus und Subventrikularzone ^9, eine wichtige Überlegung beschriften da die Neurogenese in beiden auftritt diese Regionen in der gesamten Lebensspanne ^10,11.

Nach der Färbung wurden zwei bildgebenden Verfahren eingesetzt werden, um dendritischen Eigenschaften zu bewerten: i) Echtzeit-Bildgebung (RTI) und ii) erweitert Schärfentiefe-Bildgebung (EDFI). Die FTI-Technik liefert eine mittlere zu verfolgen und zu quantifizieren, die Länge und die Reihenfolge der Verzweigung entlang der einzelnen dendritischen Segmente und Branchen. So ermöglicht sie es, die gesamte Fläche und Volumen von jedem dendritischen Baum besetzt schätzen. Mehr specifically im RTI Verfahren der Benutzer kontinuierlich identifiziert die Segmente und refokussiert iterativ das Neuron Spursoftware speichert die x, y und z-Koordinaten der dendritischen Struktur und rekonstruiert die Trajektorie der dendritische Struktur in 3D. Im Vergleich dazu bietet die EDFI-Methode eine ziemlich einfache und beschleunigten Mittel zur Bewertung dendritischen Dichte in ziemlich dicken Gewebeproben durch die Erzeugung eines zusammengesetzten Bildes, die Informationen über den gesamten Z-Achse. Dazu zeichnet der Anwender High-Definition-Video-Dateien über die Dicke des Abschnitts, und dann nutzt Software zu suchen, die Video-Frames, um Punkte zu identifizieren, wobei ein Pixel vollständig im Fokus. Anschließend werden die fokussierten Pixel zusammengeführt und in eine hochauflösende Bildverbund 2D integriert. Dieses zusammengesetzte Bild enthält alle Pixel, die In-Fokus unabhängig von ihrer Position in der z-Achse sind. Qualitative und quantitative Analyse dieser 2D-Bilder können anschließend verwendet werden, um die Dichte zu bestimmen,der dendritischen Verzweigungen in jedem Feld.

Schließlich stellen wir ein Verfahren zum Erzeugen von Panorama extrem hochauflösende Bilder für die Analyse und Bewertung von Dendriten in einem gesamten Bereich von Interesse. Diese Technik kann eingesetzt werden, um den mangelnden Zugang zu sehr hochauflösende und teure Digitalkameras überwinden. Mit dieser Methode, eine fängt Serienbilder an verschiedenen Orten entlang der x- und y-Achsen und automatisch Stiche sie zusammen mit einer Freeware (zB Image Composite Editor). Bemerkenswerterweise kann dieses Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse der dendritischen Verzweigung nicht in einem weiten Bereich verwendet werden.

Protokoll

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den vom Ausschuss für Tierforschung an der Veterans Affairs Palo Alto Gesundheitswesen genehmigt ethischen Standards durchgeführt.

1. Golgi-Cox Färbung

1. Gehirn-Extraktion und Färbung
   1. Am 1. Tag, tief betäuben Mäusen mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin vor euthanizing über Ausbluten.
   2. Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und sezieren das Gehirn.
      1. Entfernen Sie zuerst die Haut auf der Oberseite des Schädels, indem eine gekrümmte Schere an der Oberseite des Kleinhirns und sanft Messer durch die Schädeldach parallel zur zentralen Sulcus mit der Spitze der Schere spitz nach außen, bewegt sich in Richtung auf den Riechkolben. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf beiden Seiten.
      2. Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um das Schädeldach heben und drehen Sie ihn in Richtung der Riechkolben und abbrechen. Dann drehen Sie den Schädel auf den Kopf und verwenden Sie eine Abholung durch den Wellenleiter geschnittenNerven und lösen das Gehirn. Schließlich verwenden die Abholung, das Gehirn aus dem Rückenmark in der Höhe des Foramen magnum trennen.
   3. Sofort tauchen das Gehirn in 15 ml im Handel erhältlichen, unverdünnt Golgi-Cox-Lösung. Lagern Sie das Gehirn in Golgi-Lösung in einem verschlossenen, 20 ml Glasflasche bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   4. Am 2. Tag, gießen Sie langsam die Lösung, und ersetzen sie durch 15 ml frisches Golgi-Cox-Lösung. Verschließen Sie die Flasche, die das Gehirn und lassen Sie ungestört für weitere 9 Tage im Dunkeln.
2. Schnitte und Einbettung
   1. Am 11. Tag, legen Sie die Gehirne in 30% Saccharose-Lösung, in ddH ₂ O für die Dehydratisierung vorbereitet. Ändern Sie die Lösung mit frisch zubereiteten 30% Saccharose nach 12 Stunden. Das Gehirn in einer 30% igen Saccharoselösung für 3 Tage Inkubation bei 4 ° C.
   2. Am 14. Tag, füllen Sie das Reservoir des Vibratom mit einer 30% Saccharoselösung, bis die Klinge fallen. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 1 mm / s mit einer Amplitude von 0,95 mm.
   3. Tupfen Sie die Gehirne mit einem Kimwipe um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen, und entfernen Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge zu koronal geschnitten.
   4. Fest montieren das gesamte Gehirn auf die Vibratom-Plattform mit Sekundenkleber und lassen Sie es für 2-4 min eingestellt. Legen Sie die Plattform mit dem halten Gehirn in den Behälter und stellen Sie die Klinge an die Spitze des Gehirns.
   5. Mit dem Vibratom, schneiden das Gehirn in 150 & mgr; m dicke Schnitte bei Raumtemperatur, daran zu denken, die Klinge nach jedem dritten Gehirn verändern.
   6. Pick-up die Abschnitte aus dem Reservoir mit einem kleinen Pinsel gekippt und tauchen sie in eine Petrischale mit 0,3% Gelatine in ddH ₂ O. gemacht Während die Abschnitte in der Petrischale bleibt, fügen Sie 0,5 ml 0,3% Gelatine auf jeder Folie und mit einer Bürste verteilen und Mantel Superfrost + Rutschen.
   7. Vorsichtig holen die eingetauchten Abschnitte aus der Petrischale und legen Sie sie auf die verkleisterte Rutschen. Richten Sie die Hirnschnitten vonberühren sie nur an den Seiten und nicht an den Spitzen.
   8. Nach etwa zehn Minuten, Mantel die Schnitte mit 30% Saccharose, bevor das Gewebe vollständig getrocknet ist. Danach lufttrocknen Präparate an einem dunklen Ort in einem Objektträgergestell für 3 Tage.
   9. Verdünne Handel erhältlichen 10x Entwicklungslösung auf 1x mit ddH ₂ O. Tauchen Sie die Folien in Entwicklungslösung für 7-10 min. Spülen Sie die Folien 3 mal in ddH ₂ O.
3. Entwässerung
   1. Es werden 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 95% Ethanol-Lösungen mit destilliertem ddH ₂ O.
   2. Weichen Sie die Folien in immer höheren Ethanollösungen für jede 10 min.
   3. Weichen Sie die Folien in 100% Ethanol-Lösung 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit.
   4. Weichen Sie die Folien in 100% Xylol 3 Mal hintereinander für jeweils 5 min, wobei die Abschnitte in der endgültigen Lösung bis sie Cover-gerutscht sind.
   5. Legen Sie eine großzügige Menge von DPX (Di-n-butylphthalat in Xylol) Eindeckmedium (abaus 1-1,5 ml) auf jeder Folie mit einem Kunststofftransferpipette. Vorsichtig Deck um Blasen zu vermeiden.
   6. Luft trocknen Abdeckung glitt-Hirn Abschnitten horizontal für 3 Tage.

2. Double Färbung

1. Tief betäuben (siehe Schritt 1.1.1) die Tiere.
2. Führen Herzperfusion mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer ¹² gebildet.
3. Extrahieren Sie die Gehirne (siehe 1.1.2) und speichern Sie in 45 ml 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C über Nacht auf einem Schüttler.
4. Übertragen Sie die Gehirne zu einer 30% igen Zuckerlösung und warten, bis die vollständige Dehydratisierung für 48 Stunden bei 4 ° C. Entfernen Sie die Gehirne aus Saccharose und legen Sie sie direkt auf Kupferblöcken auf Trockeneis platziert.
5. Füllen Sie den Block mit optimalen Schnitttemperatur (OAT) Verbindung, und markieren Sie die Ausrichtung des Gehirns mit dem Riechkolben als Wahrzeichen.
6. Mit einem Kryostaten geschnitten 70 Mikrometer dicke Abschnitte bei -20 ºC und legen Sie siein Cryoschutzstofflösung (25% Ethylenglykol, 25% Glycerin, in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) und halten bei -20 ° C bis zur Verwendung.
7. Machen Sie eine Lösung von 50% Gefrierschutzmittel und 50% Methanol. Zu dieser Lösung werden 0,5% Wasserstoffperoxid (vol / vol). Inkubieren schwebenden Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur.
8. Warm Abschnitte in 37 ºC in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) für 30-40 min, indem man sie in einem histologischen Ofen.
9. Inkubieren der Schnitte mit 0,3% Triton und 3% normalem Pferdeserum für 45 min bei Raumtemperatur vor der Immunofärbung. Inkubiere die Abschnitte bei 4 ºC über Nacht in 3 ml Lösung des DCX Antikörper, verdünnt 1: 500 in TBS mit 0,3% Triton und 1% normales Pferdeserum.
10. Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte 3 Mal hintereinander in TBS (10 min jeweils).
11. Inkubieren Abschnitte mit biotinyliertem Pferde-anti-Ziege (1: 200 in TBS) für zwei Stunden bei Raumtemperatur. 3 Mal hintereinander in TBS waschen Sie die Abschnitte (10 min jeweils).
12. Inkubieren tSaum mit ABC Lite (1: 1000) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur.
13. Werden 5 ul 30% H ₂ O ₂ zu einer Tablette von 10 mg DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) in 15 ml von 1 M Tris-HCl (pH 7,6) gelöste Lösung. Die Abschnitte unmittelbar in dieser Lösung für 5 Minuten inkubieren.
14. Beenden Sie die Reaktion durch Waschen mit eiskaltem TBS dreimal, gefolgt von einem Waschen in TBS bei Raumtemperatur.
15. Entwässern Abschnitte mit einer Reihe von Ethanollösungen (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, jeweils 5 min), in Xylol klären und dann die Abdeckung Slip mit DPX wie in Schritt 1.3.

3. Visualisierung

1. Nach vollständiger Trocknung der Teile, überschüssiges DPX oben auf den Folien mit einer scharfen Klinge, und legen Sie sie auf dem Scan-Tisch des Mikroskops. Das System besteht aus einem Mikroskop mit Scantisch, einen Joystick und einen 12-Bit-Farbkamera ausgestattet zusammensetzt.
2. Starten Sie das Programm. Öffnen Sie eine neue Datei.
3. Platzein Bezugspunkt auf dem Bildschirm, indem Sie mit dem Mauszeiger an jedem Ort. Dadurch werden alle Icons aus der Werkzeugpalette des Programmfensters zu aktivieren.
4. Klicken Sie auf das Symbol "Joystick Free" in der Symbolleiste und dann verwenden Sie den Joystick, um die Gyrus dentatus des Hippocampus im ersten Abschnitt zu finden.
5. Im Reiter im Programmfenster "Extras", wählen Sie "Serial Section Manager". Klicken Sie auf das Symbol "Neuer Abschnitt" in der linken unteren Ecke des Fensters. Das Fenster "Serial Abschnitt Setup" zu öffnen.
6. Wählen Sie die Serien Abschnitt Setup-Fenster und geben Sie die Gesamtzahl der Abschnitte, die Hippokampus-Regionen enthalten. Wählen Sie das Auswertungsintervall. Geben Sie im Abschnitt Schnittdicke (70 & mgr; m für DCX und 150 & mgr; m für die Golgi-gefärbten Schnitten).
7. Starten Verfolgung der Gyrus dentatus Region, indem Sie auf das Symbol "Freihandkonturzeichnung" in der Werkzeugleiste. Skizzieren Sie die dentatus körnige Zellschicht.
8. Wählen Sie "100X" aus dem Menü "Vergrößerung". Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf der Strecke und schalten Sie das Ziel, 100X. Suchen Sie die dentatus Körnerzellkörpern und Dendriten im Rahmen dieses Ziels.
9. Konzentrieren Sie sich auf einen ausgewählten Neuron, und klicken Sie auf das Symbol "Neuron Tracing" auf der Symbolleiste. Verfolgen Sie den Umfang des dentatus Körnerzellkörper. Wenn Verfolgung beendet der rechten Maustaste auf "Fertigzellkörper" zu wählen.
10. Starten Sie Verfolgen der Dendriten manuell in x, y und z-Richtung und folgen jeder Zweig mit dem Joystick und z-Motor-Regler. An einer Gabelung oder Trifurkation Knoten, wählen Sie die entsprechende Option im Dropdown-Menü auf der rechten Maustaste. Verfolgen Sie jeden der Zweige, die von diesen Knoten entstehen. Am Ende jeder Verzweigung rechten Maustaste und wählen Sie "Beenden" aus dem Dropdown-Menü.
11. Mit den Pfeiltastensymbole im Software-Fenster wählen Sie zufällig ein anderes dentatus Körnerzellen und folgen Sie dem gleichen Verfahren wie described in Schritt 3,9 bis 3,10. Speichern Sie die gesamte Ablaufverfolgung.
12. Starten Sie die neuronale Tracing-Software.
13. Öffnen Sie das erste NRX Datendatei von der ersten Maus der Versuchsgruppe. Hängen Sie den NRX-Datei des zweiten Maus der Versuchsgruppe. Fortfahren, bis alle NRX Dateien aus dieser Gruppe werden angehängt.
14. Unter der Registerkarte Analyse, wählen Sie "Fan In-Diagramm". Es öffnet sich das Fan In-Analysefenster. Häkchen "Dendriten" und klicken Sie auf Anzeigen, die die Länge und Verzweigung Muster von Dendriten für diese Gruppe von Mäusen (Abbildung 1) zeigt.

4. EDFI

Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht es dem Benutzer, schnell erfassen eine große Anzahl von Bildern durch die z-Achse von jedem Feld und erzeugt ein 2D-Bild, das alle fokussierten Punkte in der gesamten z-Achse enthält. Das Ergebnis wird ein zusammengesetztes Bild, das alle fokussierten Pixel aus gesammelten Bilder enthält.

1. Schließen Sie das Mikroskop in ein digitales NockenÄra. Zeigen die Abschnitte zunächst auf dem Scantisch mit dem Mikroskop verbunden und dann zu einem 10X-Objektiv zu wechseln. Bewegen Sie die Bühne, um den Bereich von Interesse.
2. Starten Sie eine Video-Aufnahme-Programm.
3. Drücken Sie die Aufnahmetaste. Sobald der Aufnahmeknopf gedrückt wird, verwenden Sie das Makro-Fokus-Knopf, um von oben nach unten auf dem Abschnitt für insgesamt 4 Sekunden zu bewegen. Speichern Sie die Videodatei.
4. Verwenden ImageJ Freeware, um die AVI-Videodateien in einem unkomprimierten Format durch Öffnen der Datei und speichern Sie sie in unkomprimierte Dateiformat zu konvertieren.
5. Starten Sie eine Bildanalyse-Programm und öffnen Sie die AVI-Datei. Gehen Sie zum Menü "Bearbeiten" und klicken Sie auf "Erweiterte Tiefenschärfe". Wählen Sie den entsprechenden Videodatei. Im "Output" Optionen wählen "Geneverbund Bester-Fokus-Bild".
6. Im "Focus Analysis" Optionen, wählen Sie "Normalized Illumination" und "Max Local Contrast" Optionen. Wählen Sie dann "Create ". Das resultierende Bild repräsentiert alle fokussierten Punkte in der gesamten z-Achse (Figur 2).
7. Speichern Sie das resultierende Bild.

5. Generieren Extrem-Bilder mit hoher Auflösung

HINWEIS: Diese Methode erlaubt es dem Benutzer, mit geringer Vergrößerung und extrem hochauflösende Bilder von hoher Vergrößerung-Bilder mit hoher Auflösung automatisch in einer automatisierten Weise.

1. Zeigen die Abschnitte zunächst auf dem Scantisch mit dem Mikroskop verbunden. Das Mikroskop ist mit einer Digitalkamera verbunden ist. Bewegen Sie die Bühne, um den Bereich von Interesse.
2. Starten Sie eine Bildaufnahme-Programm.
3. Verwenden Sie einen 10X-Objektiv und zu erwerben, und speichern Sie hochauflösende (4076 x 3116) Bilder von der Region von Interesse achten Sie darauf, um mindestens 10% überlappen müssen.
4. Führen Image Composite Editor um Bilder zu nähen.
5. Gehen Sie zum Menü Datei, und klicken Sie auf "Neues Panorama". Wählen Sie den Ordner, in dem die Bilder stverknüpft. Wählen Sie die Bilder, die auf der gleichen Region und drücken Sie "OK" gehören.
6. Drücken Sie auf "Export to Disk" und speichern Sie das Bild. Diese Abbildung stellt eine extrem hochauflösende Bild des Bereichs von Interesse, die für die Analyse und / oder Demonstrations (Figur 3) verwendet werden könnten.

Ergebnisse

Das Ausmaß der Verzweigung, die aus vorhandenen und neu geboren dentatus Körnerzellen in Wildtyp-Mäusen entweder mit Golgi-Cox oder DCX-Färbung (Abbildung 1) analysiert. Dendritische Segmente DCX-positiven Zellen gefunden wurden 13-36 Micron lang. Die Normalverteilung der dendritischen Länge wurde mit Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; Figuren 4 und 5).

Bei der Analyse der Länge der Segment...

Diskussion

Hier wurden zwei Methoden beschrieben, um das Ausmaß der dendritischen Verzweigung in reifen und neugeborenen Neuronen mit herkömmlichen Färbemethoden in Verbindung mit RTI und EDFI quantifizieren. Die Übernahme von hochauflösenden Bildern von Neuronen ein extrem nützliches Verfahren zum Testen der schädlichen Wirkungen von neurodegenerativen Erkrankungen und wiederum stellt ein Mittel zur therapeutischen Strategien, Hippocampusneuronen Ziel beurteilen.

Während die RTI-Methode wurde ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00