Évaluation de l'arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l'hippocampe chez la souris

Résumé

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Résumé

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introduction

Modifications dynamiques dans le nombre et la structure des synapses sont les caractéristiques de développement, le vieillissement, et de nombreux troubles neurodégénératifs ^1-3. La capacité des neurones à recevoir et à intégrer l'information synaptique dépend de la morphologie dendritique et modifications dynamiques dans les connexions synaptiques. En effet, une corrélation positive existe entre épines dendritiques et le nombre de synapses, qui à la fois un impact fonction cognitive ^4. Ainsi, il ne est pas surprenant que les dégradations de nombre d 'épines dendritiques ont été associés à un dysfonctionnement cognitif dans un certain nombre de troubles neurologiques ^5-7, incitant un grand intérêt pour la quantification des épines dendritiques. Cependant, la quantification de la densité de la colonne vertébrale reste un temps long et fastidieux qui ne parvient pas à générer des informations utiles concernant la topographie et la distribution des synapses à travers l'arbre dendritique. Heureusement, les méthodes de coloration (par exemple, l'appareil de Golgi-Cox et doublecortine (DCX)) en conjonctionavec des techniques d'imagerie sophistiquées peuvent être utilisées pour surmonter les obstacles actuels et produire des images haute résolution de l'arborisation dendritique d'une manière fiable et rapide. Alors que méthode de coloration de Golgi-Cox peut être déployée pour évaluer l'état de l'arborisation dendritique dans tous les neurones ^8, DCX peut être déployé pour étiqueter neurones nouveau-nés en particulier dans le gyrus denté et la zone sous-ventriculaire ^9, une considération importante étant donné que la neurogenèse se produit à la fois ces régions tout au long de la durée de vie ^10,11.

Après la coloration, deux méthodes d'imagerie ont été déployés pour évaluer les caractéristiques dendritiques: i) l'imagerie en temps réel (RTI) et ii) la profondeur de l'imagerie de champ (EDFI) étendu. La technique RTI fournit un moyen de retracer et de quantifier la longueur et l'ordre des arborisation le long des segments et des branches dendritiques individuelles. Ainsi il permet une estimation de la surface totale et le volume occupé par chaque arbre dendritique. Plus de specifically, dans le procédé RTI l'utilisateur identifie de façon continue les segments et recentre itérative comme le neurone traçage logiciel recueille les x, y et z des coordonnées de la structure dendritique et reconstitue la trajectoire de la structure dendritique en 3D. En comparaison, la méthode EDFI fournit un moyen assez simples et rapides pour évaluer la densité dendritique dans des échantillons de tissus assez épaisses en générant une image composite, fournissant des informations sur l'ensemble de l'axe z. Pour ce faire, l'utilisateur enregistre des fichiers vidéo à haute définition sur toute l'épaisseur de la section puis utilise un logiciel pour rechercher les images vidéo pour identifier les points dans lequel un pixel est entièrement mis au point. Par la suite, les pixels ciblées sont fusionnés et intégrés dans une haute résolution, image 2D composite. Cette image composite contient tous les pixels qui sont de mise au point quelle que soit leur position dans l'axe z. L'analyse qualitative et quantitative de ces images en 2D peut être utilisé par la suite pour déterminer la densitéramification dendritique de chaque zone.

Enfin, nous présentons une méthode pour générer panoramique images de très haute résolution pour l'analyse et l'évaluation des dendrites dans toute une région d'intérêt. Cette technique peut être déployé pour surmonter le manque d'accès à très haute résolution et les appareils photo numériques coûteux. En utilisant cette méthode, permet de capturer des images en série à différents endroits le long du x et y axes et ensuite automatiquement des points les ensemble en utilisant un logiciel (par exemple, Image Composite Editor). En particulier, ce procédé peut être utilisé pour l'évaluation qualitative et quantitative de l'arborisation dendritique dans un assez large domaine.

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Protocole

NOTE: Des expériences ont été menées en conformité avec les normes éthiques approuvés par le Comité de la recherche animale au système de soins de santé Anciens Combattants Palo Alto.

1. Golgi-Cox Coloration

1. l'extraction du cerveau et de la coloration
   1. Le 1er jour, anesthésier profondément souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine avant euthanasie par exsanguination.
   2. Retirez délicatement la calotte crânienne et disséquer le cerveau.
      1. Première enlever la peau sur le dessus du crâne, en plaçant une paire de ciseaux courbes sur le dessus du cervelet et doucement couper à travers la calotte crânienne parallèle au sillon central avec la pointe du ciseau tourné vers l'extérieur, se déplaçant dans la direction vers le bulbe olfactif. Répétez ce processus sur les deux côtés.
      2. Utilisez un pincet chirurgicale pour soulever la calotte crânienne en le tournant vers les bulbes olfactifs et rompre. Ensuite, retournez le crâne à l'envers et utiliser une pioche pour couper à travers l'optiquenerfs et desserrer le cerveau. Enfin, utilisez le choix de séparer le cerveau de la moelle épinière au niveau du foramen magnum.
   3. Immédiatement immerger le cerveau dans 15 ml de disponible dans le commerce, solution non diluée Golgi-Cox. Rangez le cerveau en solution dans un appareil de Golgi plafonné, 20 ml bouteille en verre à la température ambiante dans l'obscurité.
   4. Au 2ème jour, versez lentement la solution et le remplacer par 15 ml de solution fraîche Golgi-Cox. Reboucher la bouteille contenant le cerveau et laisser reposer pendant encore neuf jours dans l'obscurité.
2. Sectionnement et de scellement
   1. Sur le 11e jour, placez le cerveau en solution de saccharose à 30%, préparés ddH ₂ O pour la déshydratation. Changer la solution fraîchement préparée avec 30% de saccharose après 12 heures. Incuber le cerveau dans une solution de saccharose à 30% pendant 3 jours à 4 ° C.
   2. Le 14e jour, remplir le réservoir de la vibratome avec une solution de saccharose à 30% jusqu'à ce que la lame est couvert. Réglez la vitesse à 1 mm / s avec une amplitude de 0,95 mm.
   3. Éponger les cerveaux avec un Kimwipe pour enlever l'excès d'humidité et retirez le cervelet en utilisant une lame de rasoir pour couper coronaire.
   4. Fermement monter l'ensemble du cerveau sur la plate-forme de vibratome utilisant superglue et laisser reposer pendant 2-4 min. Insérer la plate-forme avec le cerveau collée dans le réservoir et régler la lame à la partie supérieure du cerveau.
   5. Utilisation du vibratome, découper le cerveau en 150 sections um d'épaisseur à la température ambiante, sans oublier de changer la lame après chaque 3ème cerveau.
   6. Ramassez les sections du réservoir à l'aide d'une petite brosse à pointe et plongez-les dans une boîte de Pétri contenant 0,3% de gélatine faite en ddH ₂ O. Bien que les sections restent dans la boîte de Pétri, ajouter 0,5 ml de 0,3% de gélatine sur chaque diapositive et utilisez une brosse à se répandre et enduire les SuperFrost + diapositives.
   7. Prendre doucement les sections immergées de la boîte de Pétri et placez-les sur les lames gélatinisées. Orienter les sections de cerveau parles toucher uniquement sur leurs côtés et non sur les sommets.
   8. Après environ dix minutes, enrober les sections avec 30% de saccharose avant que le tissu sèche complètement. Puis sécher à l'air les lames préparées dans un endroit sombre dans un rack coulissant pour trois jours.
   9. Diluer disponible dans le commerce 10x solution de développement à 1x utilisant ddH ₂ O. Plonger les lames dans la solution de développement pour les 7-10 min. Rincer les lames trois fois en ddH ₂ O.
3. Déshydration
   1. Préparer 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, et des solutions d'éthanol 95% en utilisant distillée ddH ₂ O.
   2. Faire tremper les lames dans des solutions d'éthanol plus en plus élevés pendant 10 minutes chacun.
   3. Faire tremper les lames dans une solution d'éthanol à 100% trois fois pendant 10 min à chaque fois.
   4. Faire tremper les lames dans 100% xylène trois fois de suite à 5 min chacun, en gardant les sections dans la solution finale jusqu'à ce qu'ils soient couvercle-glissé.
   5. Placez une quantité généreuse de DPX (phtalate de di-n-butyle dans le xylène) milieu de montage (absur 1 à 1,5 ml) sur chaque diapositive à l'aide d'une pipette de transfert en plastique. Placez délicatement lamelles pour éviter les bulles.
   6. Couverture sèche-Air glissé cerveau sections horizontalement pour trois jours.

2. Doublecortin coloration

1. Profondément anesthésier (voir l'étape 1.1.1) les animaux.
2. Effectuer perfusion cardiaque avec fraîchement préparé paraformaldéhyde à 4% faite dans un tampon phosphate ^12.
3. Extraire le cerveau (voir 1.1.2) et entreposer dans 45 ml de paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant la nuit sur un agitateur à bascule.
4. Transférez les cerveaux à une solution de saccharose à 30% et d'attendre déshydratation complète pendant 48 heures à 4 ° C. Retirez les cerveaux à partir de saccharose et de les placer directement sur des blocs de cuivre placés sur de la glace sèche.
5. Remplir le bloc à température de coupe optimale (OCT) et composé marquer l'orientation du cerveau en utilisant le bulbe olfactif comme point de repère.
6. L'utilisation d'un cryostat, couper 70 sections microns d'épaisseur à -20 ºC et placez-lesdans une solution de cryoprotecteur (25% d'éthylèneglycol, 25% de glycerol, dans un tampon de phosphate de sodium 0,05 M, pH 7,4) et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
7. Ajouter une solution de methanol à 50% et 50% cryoprotecteur. Ajouter à cette solution 0,5% de peroxyde d'hydrogène (vol / vol). Incuber les coupes flottantes pendant 30 min à température ambiante.
8. Sections chaudes à 37 ° C dans du TBS (solution saline tamponnée au Tris) pour 30 à 40 min en les plaçant dans un four histologique.
9. Incuber les sections avec 0,3% de Triton et 3% de sérum de cheval normal à 45 min à température ambiante avant immunocoloration. Incuber les sections pendant une nuit à 4 ° C dans 3 ml de solution de l'anticorps DCX dilué à 1: 500 dans du TBS avec 0,3% de Triton et 1% de sérum normal de cheval.
10. Le lendemain, laver les sections 3 fois de suite dans du TBS (10 min chacun).
11. Incuber les coupes avec un anti-chèvre de cheval biotinylé (1: 200 dans du TBS) pendant deux heures à la température ambiante. Laver les sections 3 fois de suite dans du TBS (10 min chacun).
12. Incuber tourlet avec ABC Lite (1: 1000) pendant 1,5 heure à température ambiante.
13. Ajouter 5 ul de 30% de H ₂ O ₂ à un comprimé de 10 mg de DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) solution dissous dans 15 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,6). Incuber les sections immédiatement dans cette solution pendant 5 min.
14. Terminer la réaction en les lavant avec de la glace froide SCT trois fois suivi par un lavage dans du TBS à la température ambiante.
15. Déshydrater sections en utilisant une série de solutions d'éthanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 minutes chacun), clarifier dans le xylène, puis lamelle en utilisant DPX comme dans l'étape 1.3.

3. Visualisation

1. Après séchage complet des sections, enlever l'excès de DPX au-dessus des lames avec une lame tranchante, et placez-les sur la scène du microscope à balayage. Le système est composé d'un microscope équipé d'étape de balayage, manette de jeu, et une caméra couleur de 12 bits.
2. Démarrez le programme. Ouvrez un nouveau fichier de données.
3. Lieuun point sur l'écran de référence en cliquant avec le pointeur de la souris à ne importe quel endroit. Cela permettra d'activer toutes les icônes de la palette d'outils de la fenêtre de programme.
4. Cliquez sur l'icône "Joystick gratuit" sur la barre d'outils, puis utilisez le joystick pour localiser le gyrus denté de l'hippocampe dans la première section.
5. Dans l'onglet "Outils" de la fenêtre de programme, sélectionnez "chef de section de série". Cliquez sur l'icône "Nouvelle section" dans le coin inférieur gauche de la fenêtre. Cela va ouvrir la fenêtre "Section de configuration de série".
6. Sélectionnez la fenêtre Section de configuration de série, puis entrez le nombre total de sections qui contiennent des régions de l'hippocampe. Sélectionnez l'intervalle d'évaluation. Entrez l'épaisseur section de coupe (70 um pour DCX et 150 um pour les sections Golgi colorées).
7. Commencer à tracer la région de gyrus denté en cliquant sur l'icône "Freehand Dessin des contours" dans la barre d'outils. Décrire la couche de cellules granulaires dentées.
8. Sélectionnez "100X" dans le menu "Agrandissement". Ajouter une goutte d'huile d'immersion sur la section et passer l'objectif de 100X. Repérez les organismes et les dendrites des cellules granulaires dentés cadre de cet objectif.
9. Focus sur un neurone sélectionné et cliquez sur l'icône "Neuron Tracing" sur la barre d'outils. Trace de la circonférence du corps de cellules granulaires dentées. Lorsque vous avez terminé le traçage, cliquez sur la droite pour sélectionner "Terminer cellulaire du corps".
10. Commencer à tracer les dendrites manuellement en X, Y et Z et suivre chaque branche en utilisant le bouton du joystick et z-moteur. À un noeud de bifurcation ou trifurcation, sélectionnez l'option correspondante dans le menu déroulant sur clic-droit. Trace chacune des branches qui découlent de ces noeuds. À la fin de chaque branche clic droit et sélectionnez "Ending" dans le menu déroulant.
11. En utilisant les icônes des touches fléchées dans la fenêtre du logiciel de sélectionner au hasard un autre cellules granulaires dentées et suivez la même procédure que described à l'étape 3/9 à 3/10. Enregistrer l'ensemble du tracé.
12. Démarrez le logiciel de traçage neuronale.
13. Ouvrir le premier fichier de données à partir de la première NRX souris du groupe expérimental. Ajoutez le fichier NRX de la deuxième souris du groupe expérimental. Continuez jusqu'à ce que tous les fichiers NRX de ce groupe sont ajoutés.
14. Sous l'onglet Analyse, sélectionnez "Fan Dans diagramme". Cela ouvre la fenêtre Dans Fan-analyse. Coche «dendrites» et cliquez sur Affichage, qui représente les longueurs et une ramification de dendrites pour ce groupe de souris (Figure 1).

4. EDFI

Remarque: cette méthode permet à l'utilisateur d'enregistrer rapidement un grand nombre d'images à travers l'axe des z de chaque champ et de générer une image 2D qui contient tous les pixels focalisés à travers l'axe z. Le résultat sera une image composite qui contient tous les pixels ciblées à partir d'images collectées.

1. Connectez le microscope à une caméra numériqueépoque. Placez les premières sections sur la scène de balayage connecté au microscope, puis passer à un objectif 10X. Déplacez la scène pour la zone d'intérêt.
2. Lancer un programme de capture vidéo.
3. Appuyez sur le bouton d'enregistrement. Dès que le bouton d'enregistrement est pressée, utilisez le bouton macro-focus de passer du haut vers le bas de la section pour un total de 4 sec. Enregistrez le fichier vidéo résultant.
4. Utilisez ImageJ freeware pour convertir les fichiers vidéo AVI dans un format non compressé en ouvrant le fichier et de les enregistrer au format de fichier non compressé.
5. Lancer un programme d'analyse d'images et ouvrir le fichier AVI. Aller au menu "Processus" et cliquez sur "profondeur de champ étendue». Sélectionnez le fichier vidéo correspondant. Dans options "de sortie", sélectionnez "Générer Composite Meilleur-Focus Image".
6. Dans options "Analyse bref", sélectionnez "normalisé Illumination" et les options "Max" de contraste local. Ensuite, sélectionnez "Cremangé ". L'image résultante représente l'ensemble des pixels focalisés à travers l'axe z (figure 2).
7. Enregistrer l'image résultante.

5. Génération Résolution Images très haute

NOTE: Cette méthode permet à l'utilisateur de générer automatiquement un faible grossissement et images de très haute résolution à partir d'images à fort grossissement à haute résolution d'une manière automatisée.

1. Placer les sections de la première étape de balayage connecté au microscope. Le microscope est connecté à un appareil photo numérique. Déplacez la scène pour la zone d'intérêt.
2. Lancer un programme d'acquisition d'image.
3. Utilisez un objectif 10X et d'acquérir et sauvegarder haute résolution (4076 x 3116) des images de la région d'intérêt en se assurant d'avoir au moins 10% de chevauchement.
4. Image d'exécution Composite Editor d'assembler des images.
5. Allez dans le menu Fichier, puis cliquez sur "Nouveau Panorama". Sélectionnez le dossier dans lequel les images sont stORed. Sélectionnez les images qui appartiennent à la même région et appuyez sur "ok".
6. Appuyez sur le bouton "Exporter sur le disque" et enregistrer l'image. Cette image représente une image de très haute résolution de la zone d'intérêt qui pourrait être utilisé pour l'analyse et / ou de démonstration (Figure 3).

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Résultats

L'étendue de l'arborisation résultant de cellules granulaires du dentate existants et nouveaux-nés a été analysée chez des souris de type sauvage en utilisant soit Golgi-Cox ou DCX coloration (figure 1). Segments de cellules dendritiques DCX-positifs ont été trouvés pour être de 13 à 36 microns de long. La distribution normale de longueur dendritique a été testé en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; les figures 4...

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Discussion

Ici, deux méthodes ont été décrites pour quantifier l'ampleur de l'arborisation dendritique dans les neurones matures et les nouveaux-nés en utilisant des méthodes classiques de coloration en collaboration avec RTI et EDFI. L'acquisition d'images haute résolution de neurones fournit une méthode extrêmement utile pour tester les effets délétères des troubles neurodégénératifs et, à son tour, fournit un moyen d'évaluer les stratégies thérapeutiques qui ciblent les neurones de l'h...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00