Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Resumo

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Resumo

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introdução

Alterações dinâmicas no número e na estrutura das sinapses são características de desenvolvimento, envelhecimento, e inúmeras doenças neurodegenerativas ^1-3. A capacidade dos neurônios de receber e integrar informações sináptica depende morfologia dendrítica e alterações dinâmicas em conexões sinápticas. Na verdade, existe uma correlação positiva entre a espinha dendrítica e número de sinapses, que tanto impacto função cognitiva ^4. Assim, não é surpreendente que decréscimos da espinha dorsal dendríticas têm sido associados com a disfunção cognitiva em um número de distúrbios neurológicos ^5-7, provocando um grande interesse em dendrítica quantificação espinha. No entanto, a quantificação da densidade da coluna continua a ser uma tarefa consumidora de tempo e tedioso que falha para gerar informação útil a respeito da topografia e distribuição de sinapses em toda a árvore dendrítica. Felizmente, métodos de coloração (por exemplo, de Golgi-Cox e duplacortina (DCX)) em conjuntocom técnicas de imagem sofisticadas podem ser utilizadas para superar as barreiras atuais e produzir imagens de alta resolução de arborização dendrítica de uma maneira confiável e rápida. Enquanto método de coloração Golgi-Cox pode ser implantado para avaliar o estado de arborização dendrítica em todos os neurônios ^8, DCX pode ser implantado para rotular os neurônios recém-nascidos particularmente no giro denteado e zona subventricular ^9, uma consideração importante, dado que a neurogênese ocorre tanto estas regiões em todo o tempo de vida ^10,11.

Após a coloração, dois métodos de imagem foram mobilizados para avaliar as características dendríticas: i) imagens em tempo real (RTI) e ii) Maior profundidade do campo de imagem (EDFI). A técnica RTI fornece um meio para localizar e quantificar o comprimento e ordem de arborização ao longo dos segmentos dendríticas individuais e galhos. Assim, possibilita estimar a área total e do volume ocupado por cada árvore dendrítica. Mais specifically, no método RTI o usuário identifica continuamente os segmentos e reorienta iteratively como o rastreamento de software neurônio recolhe os x, y, e z coordenadas da estrutura dendrítica e reconstrói a trajetória da estrutura dendrítica em 3D. Comparativamente, o método EDFI fornece um meio bastante simples e rápidos para avaliar a densidade dendrítica em amostras de tecido, em vez de espessura, gerando uma imagem composta, fornecendo informações sobre o eixo z inteiro. Para fazer isso, o utilizador grava arquivos de vídeo de alta definição em toda a espessura da secção e, em seguida, usa software para pesquisar os quadros de vídeo para identificar pontos em que um pixel é completamente no foco. Em seguida, os pixels focadas são fundidas e integradas em uma imagem 2D compósito de alta resolução,. Esta imagem composta contém todos os pixels que estavam em foco, independentemente da sua posição no eixo z. A análise qualitativa e quantitativa destas imagens 2D pode ser utilizada subsequentemente para determinar a densidadede ramificação dendrítica em cada campo.

Por fim, apresentamos um método panorâmica para a geração de imagens extremamente de alta resolução para a análise e avaliação das dendrites em toda uma região de interesse. Esta técnica pode ser implantado para superar a falta de acesso a muito alta resolução e câmeras digitais caros. Usando este método, uma captura imagens em série em diferentes locais ao longo do xey eixos e, em seguida, automaticamente junta-as usando um freeware (por exemplo, Imagem Composite Editor). Notavelmente, este método pode ser utilizado para a avaliação qualitativa e quantitativa de arborização dendrítica numa área bastante larga.

Protocolo

NOTA: Os experimentos foram conduzidos de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal no Sistema Único de Saúde Veterans Affairs Palo Alto.

1. A coloração de Golgi-Cox

1. Extracção do cérebro e coloração
   1. No 1º dia, profundamente anestesiar ratos com 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina antes eutanásia via sangria.
   2. Retire cuidadosamente o calvarium e dissecar o cérebro.
      1. Primeiro remover a pele na parte superior do crânio, colocando uma tesoura curvada na parte superior do cerebelo e cortado suavemente através da calvária paralelo ao sulco central, com a ponta da tesoura apontado para fora, movendo-se na direcção para o bolbo olfactivo. Repita esse processo em ambos os lados.
      2. Use um pincet cirúrgico para levantar o calvarium enquanto girando-a para os bulbos olfatórios e quebrá-lo fora. Em seguida, vire o crânio de cabeça para baixo e usar uma picareta para cortar através da óticanervos e afrouxe o cérebro. Finalmente, use a pick para separar o cérebro da medula espinhal ao nível do forame magno.
   3. Mergulhe imediatamente o cérebro em 15 ml de venda no mercado, não diluído solução Golgi-Cox. Armazenar o cérebro em solução de Golgi de uma tampado, 20 ml garrafa de vidro à temperatura ambiente no escuro.
   4. No 2º dia, despeje lentamente a solução e substituí-lo com 15 ml de solução de Golgi-Cox fresco. Tampe novamente a garrafa que contém o cérebro e deixar em repouso por mais 9 dias no escuro.
2. Seccionamento e embedment
   1. No 11º dia, coloque os cérebros em solução de sacarose 30%, preparadas em _ddH2O para a desidratação. Alterar a solução preparada de fresco com sacarose a 30% após 12 horas. Incubar os cérebros em uma solução de sacarose a 30% durante 3 dias a 4 ° C.
   2. No 14 ° dia, encher o reservatório de vibratome com uma solução de sacarose a 30% até que a lâmina está coberta. Defina a velocidade de 1 mm / s com uma amplitude de 0,95 mm.
   3. Seque os cérebros com um Kimwipe para remover o excesso de umidade e remover o cerebelo usando uma lâmina de barbear para cortar coronally.
   4. Monte firmemente todo o cérebro para a plataforma vibratome usando supercola e deixe-a marcada para 2-4 min. Inserir a plataforma com o cérebro respeitado para dentro do reservatório e ajustar a lâmina para o topo do cérebro.
   5. Usando o vibratome, fatiar o cérebro em 150 mm de espessura à temperatura ambiente, lembrando-se de mudar a lâmina após cada 3 cérebro.
   6. Pegue as seções do reservatório usando um pequeno pincel de ponta e mergulhe-os em uma placa de Petri contendo 0,3% de gelatina feita em DDH ₂ O. Embora as secções permanecem na placa de Petri, adicionar 0,5 ml de 0,3% de gelatina em cada lâmina e usar uma escova para espalhar e revestem-se as lâminas SuperFrost +.
   7. Levante com cuidado as seções imersos da placa de petri e colocá-los nas lâminas gelatinizadas. Orientar as seções do cérebro portocá-los apenas em seus lados e não nos tops.
   8. Depois de cerca de dez minutos, revestir as seções com 30% de sacarose antes do tecido secar completamente. Em seguida, o ar seco das lâminas preparadas em um lugar escuro em um rack de slides durante 3 dias.
   9. Diluir disponível comercialmente 10x solução Desenvolvendo para 1x usando DDH ₂ O. Mergulhe as lâminas em solução de desenvolvimento para 7-10 min. Lavar as lâminas três vezes em DDH ₂ O.
3. Desidratação
   1. Preparar 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e soluções de etanol usando destilada DDH ₂ O.
   2. Mergulhe as lâminas em soluções de etanol cada vez mais elevados para 10 min cada.
   3. Mergulhe as lâminas em solução de etanol 100% 3 vezes por 10 min de cada vez.
   4. Mergulhe as lâminas em 100% xileno 3 vezes consecutivas por 5 min cada, mantendo as seções na solução final até que estejam escorregou-cover.
   5. Coloque uma quantidade generosa de DPX (ftalato de di-n-butil em xileno) meio de montagem (abfora de 1-1,5 ml) em cada slide usando uma pipeta de transferência de plástico. Com cuidado, coloque lamelas para evitar bolhas.
   6. Ar seco tampa escorregou-cerebrais seções horizontalmente durante 3 dias.

2. duplacortina Coloração

1. Profundamente anestesiar (veja o passo 1.1.1) os animais.
2. Execute perfusão cardíaca com recém-preparados paraformaldeído 4% em tampão fosfato ^12.
3. Extraia os cérebros (ver 1.1.2) e loja em 45 ml de 4% de paraformaldeído a 4 ° C durante a noite num agitador de balanço.
4. Transferir os cérebros a uma solução de sacarose a 30% e esperar por desidratação completa durante 48 horas a 4 ° C. Remover os cérebros a partir de sacarose e colocá-las directamente em blocos de cobre colocados sobre gelo seco.
5. Preencha o bloco com a temperatura ideal de corte (OCT) composto e marcar a orientação do cérebro usando o bulbo olfatório como um marco.
6. Usando um criostato, cortar 70 seções micron de espessura a -20 ºC e colocá-losem solução de crioprotector (25% de etileno glicol, glicerol a 25%, em tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,4) e manter a -20 ° C até à sua utilização.
7. Adicione uma solução de 50% de metanol e 50% de crioprotector. A esta solução junta-se 0,5% de peróxido de hidrogénio (vol / vol). Incubar secções de flutuação durante 30 minutos à temperatura ambiente.
8. Seções quentes em 37 ºC em TBS (salina Tris) por 30-40 min, colocando-os em um forno histológica.
9. Incubam-se as secções com 0,3% de triton e 3% de soro normal de cavalo durante 45 min à temperatura ambiente antes da imunocoloração. Incubam-se as secções durante a noite a 4 ° C em 3 ml de solução de anticorpo a DCX diluído 1: 500 em TBS com 0,3% de triton e 1% de soro normal de cavalo.
10. No dia seguinte, lave as seções 3 vezes consecutivas em TBS (10 min cada).
11. Incubar secções com um cavalo anti-cabra biotinilado (1: 200 em TBS) durante duas horas à temperatura ambiente. Lave as seções 3 vezes consecutivas em TBS (10 min cada).
12. Incubar tbainha com ABC Lite (1: 1000) durante 1,5 h à temperatura ambiente.
13. Adiciona-se 5 ul de 30% de H ₂ O ₂ para um comprimido de 10 mg de DAB solução (3,3 "-Diaminobenzidine) dissolvido em 15 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,6). Incubar as secções imediatamente nesta solução durante 5 minutos.
14. Terminar a reacção por lavagem com TBS gelado três vezes, seguido por uma lavagem em TBS à temperatura ambiente.
15. Desidratar secções, utilizando uma série de soluções de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min cada), clara em xileno e, em seguida cobrir deslizamento usando DPX como no passo 1.3.

3. Visualização

1. Após a secagem completa das secções, remover o excesso de DPX no topo das lâminas com uma lâmina afiada, e colocá-las sobre a plataforma de varrimento do microscópio. O sistema é composto por um microscópio equipado com plataforma de varrimento, joystick, e uma câmara de 12 bits cor.
2. Inicie o programa. Abra um novo arquivo de dados.
3. Lugarum ponto de referência na tela, clicando com o ponteiro do mouse em qualquer lugar. Isso irá ativar todos os ícones do painel de ferramentas da janela do programa.
4. Clique no ícone "Joystick Livre" na barra de ferramentas e, em seguida, usar o joystick para localizar giro dentado do hipocampo na primeira seção.
5. Na aba "Ferramentas" da janela do programa, selecione "Serial Seção Manager". Clique no ícone "Novo capítulo" no canto inferior esquerdo da janela. Isso abrirá a janela "Serial Seção Configuração".
6. Selecione a janela Configuração da Seção de série e, em seguida, digite o número total de seções que contêm regiões do hipocampo. Selecione o intervalo de avaliação. Digite a espessura de corte de corte (70 mm para DCX e 150 mm para seções Golgi-coradas).
7. Comece traçando a região giro denteado, clicando no ícone "Freehand Desenho do Contorno" na barra de ferramentas. Faça o contorno da camada granular denteado.
8. Selecione "100X" a partir do menu "Ampliação". Adicionar uma gota de óleo de imersão em secção e exibir o objectivo de 100X. Localize os corpos celulares giro denteado e dendrites no âmbito deste objectivo.
9. Concentre-se em um neurônio selecionado e clique no ícone "Neuron Tracing" na barra de ferramentas. Traçar a circunferência do corpo celular giro denteado. Quando terminar o rastreio, clique direito para selecionar "Finish celular Body".
10. Comece traçando as dendrites manualmente em X, Y e Z e siga cada ramo usando o botão de joystick e z-motor. Em um nó bifurcação ou trifurcação, selecione a opção correspondente no menu suspenso em cima do botão direito. Seguir a cada um dos ramos que surgem a partir desses nós. No final de cada ramo botão direito e selecione "Ending" no menu suspenso.
11. Usando os ícones chave de seta na janela do software selecionar aleatoriamente outra célula giro denteado e siga o mesmo procedimento que described na etapa 3,9-3,10. Salve todo o traçado.
12. Inicie o software de rastreamento neuronal.
13. Abra o primeiro arquivo de dados NRX do primeiro mouse do grupo experimental. Anexe o arquivo NRX do segundo rato do grupo experimental. Continue até que todos os arquivos NRX deste grupo são acrescentados.
14. Sob a guia Análise, selecione "Fan In-diagrama". Isso abre a janela In-análise a Fan. Marca de verificação "dendrites" e clique em Exibir, que retrata os comprimentos e padrões de ramificação dos dendritos para este grupo de ratos (Figura 1).

4. EDFI

NOTA: Este método permite ao utilizador gravar rapidamente um grande número de imagens por meio do eixo z de cada campo e gerar uma imagem 2D que contém todos os pixels focadas em todo o eixo z. O resultado será uma imagem composta que contém todos os pixels focadas a partir de imagens recolhidas.

1. Ligue o microscópio para uma cam digitaisera. Coloque as secções em primeiro lugar na fase de varredura ligado ao microscópio e depois mudar para uma objetiva de 10X. Mover a fase com a área de interesse.
2. Iniciar um programa de captura de vídeo.
3. Pressione o botão de gravação. Assim que o botão é pressionado ficha, usar o botão de macro-focagem para mover a partir do topo para o fundo da secção de um total de 4 segundos. Salve o arquivo de vídeo resultante.
4. Use ImageJ freeware para converter os arquivos de vídeo AVI em um formato não comprimido, abrindo o arquivo e salvá-las no formato de arquivo descompactado.
5. Iniciar um programa de análise de imagem e abra o arquivo AVI. Ir para o menu "Processos" e clique em "profundidade de campo estendida". Selecione o arquivo de vídeo correspondente. Nas opções de "Saída", selecione "Gerar Composite Melhor-Focus Imagem".
6. Nas opções de "análise de Foco", selecione "Iluminação Normalizado" e opções "Max contraste local". Em seguida, selecione "Crecomi ". A imagem resultante representa todos os pixels focadas em todo o eixo z (Figura 2).
7. Salve a imagem resultante.

5. Gerando Extremamente-imagens de alta resolução

NOTA: Este método permite que o usuário para gerar automaticamente baixa ampliação e extremamente imagens de alta resolução a partir de imagens de alta ampliação de alta resolução de uma forma automatizada.

1. Coloque as secções em primeiro lugar na plataforma de varrimento ligado ao microscópio. O microscópio é ligado a uma câmara digital. Mover a fase com a área de interesse.
2. Iniciar um programa de aquisição de imagem.
3. Use uma objetiva de 10X e adquirir e guardar as imagens de alta resolução (4076 x 3116) a partir da região de interesse certificando-se de ter pelo menos 10% de sobreposição.
4. Execute Imagem Composite Editor para costurar imagens.
5. Ir para o menu Arquivo e clique em "Novo Panorama". Selecione a pasta na qual as imagens são stORed. Selecione as imagens que pertencem a uma mesma região e pressione "OK".
6. Pressione o botão "Exportar para o disco" e salve a imagem. Esta imagem representa uma imagem extremamente alta-resolução da zona de interesse que pode ser utilizado para a análise e / ou demonstração (figura 3).

Resultados

O grau de arborização resultantes de células de grânulos dentados existentes e recém-nascidos foi analisado em ratinhos do tipo selvagem usando o Golgi-Cox ou coloração DCX (Figura 1). Segmentos de células dendríticas DCX-positivos foram encontrados para ser 13-36 mícrons de comprimento. A distribuição normal de comprimento dendríticas foi testada utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; As Figuras 4 e 5).

Discussão

Aqui, dois métodos foram descritos para quantificar a extensão da arborização dendrítica em neurônios maduros e recém-nascidos, usando métodos de coloração convencionais em conjunto com RTI e EDFI. A aquisição de imagens de alta resolução de neurónios proporciona um método extremamente útil para testar os efeitos deletérios de doenças neurodegenerativas e, por sua vez, proporciona um meio para avaliar estratégias terapêuticas que visam neurónios do hipocampo.

Enquanto o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00