Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Özet

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Özet

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Giriş

Sinaps sayısı ve yapısı, dinamik değişiklikler gelişme, yaşlanma işaretlerinden, ve çok sayıda nörodejeneratif hastalıklar ^1-3 vardır. sinaptik bilgi almak ve entegre nöronların yeteneği dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantıları dinamik değişikliklere bağlıdır. Nitekim, pozitif bir korelasyon bilişsel fonksiyonu ⁴ darbe hem dendritik omurga ve sinaps sayısı arasında var. Bu nedenle, bu dendritik omurga sayısında bir azalır dendritik omurga miktarının büyük ilgi isteyen, nörolojik ^{hastalıklar, 5-7} arasında bir dizi bilişsel işlev bozukluğu ile bağlantılı olması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, omurga yoğunluğu ölçümü dendritik ağacın üzerinde sinaps topografya ve dağıtımı ile ilgili faydalı bilgiler üretmek için başarısız bir zaman alıcı ve sıkıcı bir görev olarak durmaktadır. Neyse ki, boyama yöntemleri (örneğin, Golgi-Cox ve doublekortin (DCX)) birliktegelişmiş görüntüleme teknikleri ile mevcut engelleri aşmak ve güvenilir ve süratli bir şekilde dendritik arborization yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için kullanılabilir. Golgi-Cox boyama yöntemi tüm nöronların ⁸ dendritik arborization durumunu değerlendirmek için dağıtılabilir olsa, DCX nöron hem de meydana geldiği göz önüne alındığında özellikle dentat girus ve subventriküler bölge ^9, önemli bir dikkate yeni doğmuş nöronlar etiket dağıtılabilir ömrü boyunca bu bölgeler ^10,11.

Boyama ardından, iki görüntüleme yöntemleri dendritik özelliklerini değerlendirmek için konuşlandırıldı: i) gerçek zamanlı görüntüleme (RTI) ve saha görüntüleme (EDFI) ii) genişletilmiş derinliği. RTI tekniği takip ve bireysel dendritik segment ve dallar boyunca arborization uzunluğunu ve düzeni ölçmek için bir araç sunmaktadır. Böylece toplam alanı ve her dendritik ağacın tarafından işgal hacmini tahmin etmek birini sağlar. Daha specifically, RTI yönteminde kullanıcı sürekli kesimleri tanımlar ve yazılım izleme nöron dendritik yapının x, y, ve z koordinatlarını toplar gibi iteratif yeniden odaklanan ve 3D dendritik yapının yörüngesini yeniden yapılandırır. Nispeten, EDFI yöntemi, bir kompozit görüntü üreten tüm z-ekseninde bilgi vererek oldukça kalın doku örneklerinde dendritik yoğunluğunu değerlendirmek için oldukça basit ve hızlandırılmış bir araç sağlar. Bunu yapmak için, kullanıcı bölümünün kalınlığı boyunca yüksek çözünürlüklü video dosyalarını kaydeder ve daha sonra bir piksel odak tamamen burada noktaları belirlemek için video kareleri aramak için yazılım kullanır. Daha sonra, odaklanmış piksel birleştirilmiş ve bir yüksek çözünürlüklü, kompozit 2D görüntü entegre edilmiştir. Bu birleşik görüntü ne olursa olsun z ekseninde kendi pozisyonu içinde odak olan tüm pikselleri içerir. Bu 2D görüntülerin kalitatif ve kantitatif analiz yoğunluğunu belirlemek için sonradan kullanılabilirdendritik Her alan dallanmanın.

Son olarak, biz bir ilgi tüm bölgede analiz ve dendritler değerlendirilmesi için son derece yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bir panoramik yöntem mevcut. Bu teknik çok yüksek çözünürlüklü ve pahalı dijital kameralar erişimin eksikliği aşmak için dağıtılabilir. Bu yöntemi kullanarak, bir x- ve y-eksenleri boyunca farklı yerlerde seri görüntüleri yakalar ve daha sonra otomatik olarak bunları birlikte ücretsiz kullanarak dikişleri (örneğin, Image Composite Editor). Özellikle, bu yöntem, oldukça geniş bir alanda dendritik arborization kalitatif ve kantitatif bir değerlendirme için kullanılabilir.

Protokol

NOT: Deneyler Gazi İşleri Palo Alto Sağlık Sisteminde Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak yapılmıştır.

1. Golgi Cox Boyama

1. Beyin çıkarma ve boyama
   1. 1. gününde, derin eksanginasyonunun yoluyla euthanizing önce 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg xylazin ile fareler uyutmak.
   2. Dikkatle kalvaryumda kaldırmak ve beyin teşrih.
      1. İlk beyincik üstünde kavisli makas yerleştirerek, kafatasının üst deri kaldırmak ve yavaşça koku ampul doğru yönde hareket, dışa sivri makas ucu ile merkezi sulkus kalvaryumun paralel kesti. Her iki tarafta bu işlemi tekrarlayın.
      2. Koku ampuller doğru döndürerek kalvaryumda kaldırın ve bunu koparmaya bir cerrahi pincet kullanın. Ardından, baş aşağı çevirmek kafatası ve optik yoluyla kesmek için bir seçim kullanınsinirler ve beyin gevşetin. Son olarak, foramen magnum seviyesinde omurilikten beyin ayırmak için seçim kullanın.
   3. Hemen ticari olarak temin edilebilen, seyreltilmemiş Golgi Cox çözeltisi 15 ml beyin bırakın. Karanlıkta, oda sıcaklığında bir başlıklı, 20 ml'lik bir cam şişe Golgi çözeltisi beyin saklayın.
   4. 2. gün, yavaş yavaş çözüm dökün ve 15 ml taze Golgi-Cox çözüm ile değiştirin. Beyinleri içeren şişe tekrarlamak ve karanlıkta başka 9 gün rahatsız bırakın.
2. Kesit ve gömme
   1. 11. günde, dehidratasyon için GKD ₂ O hazırlanan% 30 sukroz çözeltisi içerisinde beyinleri yerleştirin. 12 saat sonra, taze hazırlanmış% 30 sakaroz ile çözelti değiştirin. 4 ° C 'de 3 gün süre ile% 30 sukroz çözeltisi içinde beyinleri inkübe edin.
   2. Bıçak kaplanana kadar 14 gün,% 30 sukroz çözeltisi ile vibratome doldurun. 1 m hızını ayarlamam / 0.95 mm genliği ile.
   3. Aşırı nem kaldırmak ve koronal kesmek için bir jilet kullanarak beyincik kaldırmak için bir Kimwipe beyinleri kurulayın.
   4. Sıkıca superglue kullanarak vibratome platformu üzerine bütün beyin monte ve 2-4 dakika ayarlamak için izin verir. Rezervuar içine yapışık beyin platformu yerleştirin ve beynin üstüne bıçak ayarlayın.
   5. Vibratome kullanarak, her 3 beynin sonra bıçağı değiştirmek için hatırlayarak, oda sıcaklığında 150 mikron kalınlığında bölüme beyin dilim.
   6. Küçük uçlu bir fırça kullanarak rezervuar bölümleri Pick up ve GKD ₂ O. yapılan% 0.3 jelatin içeren bir petri içine batırmak Bölümler petri kalırken, her slaytta 0.5 ml% 0.3 jelatin ilave ve yaymak ve kat SuperFrost + slaytlar için bir fırça kullanın.
   7. Yavaşça petri dalmış bölümleri pick up ve jelatinize slaytlar üzerine koyun. Beyin bölümleri OrientSadece onların yüzüne değil, üstleri onları dokunmadan.
   8. Yaklaşık on dakika sonra, kat doku tamamen kurur% 30 sakaroz ile bölümler önce. Sonra hava 3 gün boyunca bir slayt rafa karanlık bir yerde hazırlanmış slaytlar kurulayın.
   9. GKD ₂ kullanarak O. 1x piyasada bulunan 10x geliştirilmesi çözümü sulandırmak 7-10 dakika için çözüm geliştirme slaytlar daldırın. GKD ₂ O. içinde slaytlar 3 kez durulayın
3. Kurutma
   1. Damıtılmış GKD ₂ O. ile% 20,% 30,% 40,% 50,% 60,% 70,% 80,% 90 ve% 95 etanol solüsyonları hazırlayın
   2. 10 dakika her biri için giderek daha yüksek etanol çözümleri slaytlar bekletin.
   3. 10 dakika her zaman için% 100 etanol çözeltisi içinde 3 kez slaytlar bekletin.
   4. Onlar kapak astarlı kadar nihai çözüm bölümleri tutarak, 5 dakika her biri için% 100 ksilen 3 kez arka arkaya slaytlar bekletin.
   5. DPX (ksilen içinde di-n-bütil ftalat) orta montaj (ab bol miktarda yerleştirinplastik bir transfer pipeti kullanarak her slayt üzerinde 1-1.5 ml). Dikkatle kabarcıkları önlemek için lamelleri yerleştirin.
   6. Hava kuru kapak astarlı-beyin bölümleri yatay 3 gün boyunca.

2. doublekortin Boyama

1. Derinden (adım 1.1.1 bakınız) hayvanları uyutmak.
2. Fosfat tamponu ¹² içinde taze olarak hazırlanmış% 4 paraformaldehit ile kardiyak perfüzyon yapın.
3. Sallanan bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 ° C 'de% 4 paraformaldehit içinde 45 ml beyin (1.1.2) ve mağaza ekstrakte edin.
4. % 30 sukroz çözeltisi beyinleri aktarın ve 4 ° C'de 48 saat süre ile tam bir dehidrasyon bekleyin. Sakaroz gelen beyinleri çıkarın ve kuru buz üzerinde yerleştirilen bakır bloklar doğrudan koyun.
5. Optimum kesme sıcaklığı (Ekim) bileşik ile blok doldurun ve bir dönüm noktası olarak koku ampul kullanarak beynin yönünü işaretleyin.
6. Bir Kriyostat kullanarak, -20 ° C'de 70 mikron kalınlığında kesitler kesmek ve koyundondurarak saklama çözeltisi (0.05 M sodyum fosfat tamponu içinde% 25 etilen glikol,% 25 gliserol, pH 7,4) ve -20 ° C'de kullanıma kadar devam edin.
7. % 50 krio-koruyucu ve% 50 metanol ihtiva eden bir çözelti yapmak. Bu çözeltiye,% 0.5 hidrojen peroksit (hacim / hacim) ilave edin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca değişken bölümleri inkübe edin.
8. Histolojik fırında yerleştirerek 30-40 dakika TBS içinde 37 ° C (Tris-tamponlu tuzlu su) içinde sıcak bölümleri.
9. Önce immunosteyn oda sıcaklığında 45 dakika boyunca% 0.3 triton% 3, normal at serumu bölümleri inkübe edin. % 0.3 triton ve% 1 normal at serumu ile TBS içinde 500: gece boyunca 1 seyreltilmiş DCX antikor 3 ml çözelti içinde 4 ° C'de bölümleri inkübe edin.
10. Ertesi gün TBS bölümleri (10 dakika her) 3 kez art arda yıkayın.
11. Oda sıcaklığında iki saat boyunca (TBS, 200 1) bir biyotinile at anti-keçi bölümleri inkübe edin. TBS bölümleri (10 dakika her) 3 kez art arda yıkayın.
12. T inkübeoda sıcaklığında 1.5 saat süre ile ABC Lite (1.000 1) ile kenar.
13. ₂ O ₂ DAB 10 mg, 1 M Tris-HCl (pH 7.6), 15 ml içinde çözülmüş (3,3 "-Diaminobenzidine) çözeltisi, bir tablet% 30, H 5 ul ekle. 5 dakika boyunca bu çözelti içinde hemen bölümleri inkübe edin.
14. Buz soğukluğunda TBS ile oda sıcaklığında TBS içinde bir yıkama ve ardından üç kez yıkamadan reaksiyonu bitirin.
15. Ksilen açık etanol çözeltileri, bir dizi (50,% 60,% 70,% 80,% 90,% 95,% 100,% 5 dk) kullanılarak bölümlere kurutmak ve daha sonra adım 1.3 olarak DPX ile kayma kapsamaktadır.

3. Görselleştirme

1. Bölümlerin tam kurutmanın ardından, keskin bir bıçak ile slaytlar üzerine aşırı DPX kaldırmak ve mikroskop tarama aşamasında üzerine yerleştirin. Sistem tarama aşamasında, joystick ve renkli 12-bit kamera ile donatılmış bir mikroskop oluşur.
2. Programını başlatın. Yeni bir veri dosyasını açın.
3. Yerherhangi bir yerde fare imleci ile tıklayarak ekranda bir referans noktası. Bu program penceresinin araç panelinden tüm simgeleri aktive edecektir.
4. Araç çubuğunda "Joystick Free" ikonuna tıklayın ve daha sonra ilk bölümde hipokampusun dentat girus bulmak için joystick'i kullanın.
5. Program penceresinin "Araçlar" sekmesinden "Seri Bölüm Yöneticisi" seçeneğini seçin. Pencerenin sol alt köşesinde "Yeni Bölüm" simgesine tıklayın. Bu "Seri Bölüm Setup" penceresi açılacaktır.
6. Seri Bölüm Kurulum penceresini seçin ve ardından hipokampal bölümlerini ihtiva bölümlerin toplam sayısını girin. Değerlendirme aralığını seçin. Bölüm kesme kalınlığı (DCX için 70 um ve Golgi-lekeli bölümler için 150 mikron) girin.
7. Araç çubuğunda "Serbest Kontur Çizim" ikonuna tıklayarak dentat girus bölgesini izleme başlayın. Dentat granül hücre tabakası Anahat.
8. "Büyütme" menüsünden "100X" seçiniz. Bölümünde daldırma petrol bir damla ekleyin ve 100X için objektif geçiş. Bu hedef kapsamında dentat granül hücre gövdeleri ve dendrit bulun.
9. Seçilen nöron odaklanın ve araç çubuğundaki "Nöron İzleme" ikonuna tıklayın. Dentat granül hücre gövdesinin çevresi Trace. Izleme bittiğinde, doğru "Finish Hücre Gövde" seçmek için tıklayın.
10. X, y ve z yönlerinde el dendritler izleme başlayın ve joystick ve z motor düğmesini kullanarak her dalını izleyin. Bir çatallanma ya da trifurkasyon düğümünde, sağ tıklama üzerine açılan menüden ilgili seçeneği seçin. Bu düğümler kaynaklanan şube her Trace. Her dalın sonunda sağ tıklayın ve açılan menüden "Bitiş" seçeneğini seçin.
11. Yazılım penceresinde ok tuşu simgeleri kullanarak rastgele başka dentat granül hücre seçin ve descr'in gibi aynı prosedürü takipAşama 3,9-3,10 anlatılagelmiştir. Tüm izlemeyi kaydedin.
12. Nöronal izleme yazılımını başlatın.
13. Deney grubunda ilk fare ilk NRX veri dosyasını açın. Deney grubunda ikinci fare NRX dosyasını ekleyin. Bu gruptaki tüm NRX dosya eklenmiş kadar devam edin.
14. Analiz sekmesi altında, "Fan In-diyagramı" seçeneğini seçin. Bu Fan In-analiz penceresi açılır. Işareti "dendrit" Kontrol ve fareler, bu grup (Şekil 1) için dendritlerin uzunlukları ve dallanma kalıplarını gösteriyor Ekran tıklatın.

4. EDFI

NOT: Bu yöntem hızla her alanın z-ekseni boyunca görüntüleri çok sayıda kayıt ve z ekseni boyunca tüm odaklı piksel içeren bir 2D görüntü oluşturmak için olanak sağlar. Sonuç toplanan görüntülerden tüm odaklanmış piksel içeren bir kompozit görüntü olacaktır.

1. Dijital kam mikroskop bağlayındönemi. Mikroskop bağlı tarama sahnede ilk bölümleri yerleştirin ve daha sonra bir 10X objektif geçmek. Ilgi alanına sahne taşıyın.
2. Bir video yakalama programını başlatın.
3. Kayıt düğmesine basın. En kısa sürede kayıt düğmesine basıldığında gibi, 4 sn toplam bölümün yukarıdan aşağıya taşımak için makro-odak topuzu kullanın. Ortaya çıkan video dosyasını kaydedin.
4. Dosyasını açarak ve sıkıştırılmamış dosya formatında kaydederek sıkıştırılmamış biçime AVI video dosyalarını dönüştürmek için ImageJ freeware kullanın.
5. Bir görüntü analiz programı başlatın ve AVI dosyasını açın. "Süreç" menüsüne gidin ve "Alan Genişletilmiş Derinlik" üzerine tıklayın. Ilgili video dosyasını seçin. "Çıktı" seçeneklerinde, "Kompozit İyi-Odak Image oluştur" seçeneğini seçin.
6. "Odak Analizi" seçeneklerinde, "Normalize Aydınlatma" ve "Max Yerel Kontrast" seçeneklerini belirleyin. Ardından, "Cre seçin"yedik. Ortaya çıkan görüntü, z ekseni boyunca her odaklanmış piksel (Şekil 2) karşılık gelmektedir.
7. Ortaya çıkan görüntü kaydetme.

5. Son derece yüksek Çözünürlük Görüntüler oluşturuluyor

NOT: Bu yöntem kullanıcı otomatik olarak otomatize bir şekilde düşük büyütme ve yüksek büyütme-yüksek çözünürlüklü görüntüler son derece yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için olanak sağlar.

1. Mikroskop bağlı tarama sahnede ilk bölümleri yerleştirin. Mikroskop bir dijital kamera bağlı. Ilgi alanına sahne taşıyın.
2. Bir görüntü elde etme programını başlatın.
3. 10X objektif kullanın ve kazanmak ve en az% 10 örtüşme var emin ilgi bölgeden yüksek çözünürlüklü (x 3116 4076) görüntüleri kaydetmek.
4. Run Image Composite Editor görüntüleri dikiş.
5. Menüden Dosya gidin ve "Yeni Panorama" üzerine tıklayın. Görüntüleri st olduğu klasörü seçinORed. Aynı bölgede ve basın "Tamam" ait görüntüleri seçin.
6. Basın "İhracat Disk" düğmesine basın ve görüntüyü kaydedin. Bu görüntü analizi ve / veya gösteri (Şekil 3) için kullanılan olabilir ilgi alanı son derece yüksek çözünürlüklü resim temsil eder.

Sonuçlar

günümüze kadar gelen ve yeni doğan dişli granül hücrelerden kaynaklanan arborization ölçüde Golgi Cox DCX boyama (Şekil 1) kullanılarak doğal tip farelerde incelenmiştir. DCX-pozitif hücrelerin dendritik bölümleri 13-36 mikron uzunluğunda olduğu bulunmuştur. Dendritik uzunlukta normal dağılım Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak test edildi (D = 0,1217, p <0.01, Liliefors p <0.001; Şekil 4 ve 5).

Arborization ...

Tartışmalar

Burada, iki yöntem RTI ve EDFI ile birlikte geleneksel bir boyama yöntemleri kullanılarak, olgun ve yeni doğmuş nöronlar dendritik arborization derecesini ölçmek için tanımlanmıştır. nöronların yüksek çözünürlüklü görüntülerin elde edilmesi da hipokampal nöronlar hedef terapötik stratejiler değerlendirmek için bir araç sağlar, nörodejeneratif hastalıkların zararlı etkilerini test etmek için son derece kullanışlı bir yöntem sağlar ve.

RTI yöntemi deri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00