マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

要約

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

要約

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

概要

シナプスの数と構造の動的な変化は、開発の特徴で、高齢化、および多数の神経変性疾患^1-3である。シナプスの情報を受信し、統合するための神経細胞の能力は、樹状形態とシナプス結合の動的な変化に依存している。確かに、正の相関が樹状突起棘と認知機能^4に影響^を与えるの両方シナプス数、間に存在する。従って、樹状突起棘の数のデクリメントが樹状突起棘の定量化に大きな関心を促し、神経疾患^5-7多数の認知機能障害と関連していることは驚くべきことではない。それにもかかわらず、背骨密度の定量化は、樹状ツリー全体のシナプスの地形や流通に関する有用な情報を生成するのに失敗し、時間がかかり、面倒な作業のまま。一緒に幸いなことに、染色方法（ 例えば 、ゴルジ-コックスとダブルコルチン（DCX））高度なイメージング技術と現在の障壁を克服し、信頼性が高く、迅速な方法で樹枝状分岐の高解像度画像を生成するために利用することができる。ゴルジ-コックス染色法は、すべてのニューロン⁸の樹樹枝状分岐の状態を評価するために展開することができますが、DCXは、特に歯状回と脳室下帯⁹で新たに生まれたニューロンを標識するために展開することができ、重要な考慮事項は、神経新生の両方で発生していることを与えられた寿命^10,11を通じて、これらの地域。

染色後、つの撮像方法は、樹状特性を評価するために配備された：i）のリアルタイムイメージング（RTI）及びフィールドイメージング（EDFI）のii）の拡張深度。 RTI技術は、個々の樹状セグメントと枝に沿って樹枝状分岐の長さと順序をトレースし、定量化するための平均値を提供します。したがって、それぞれの樹状ツリー占める総面積と体積を推定するために1を可能にします。以上のSpecifically、RTIの方法では、ユーザは、連続的セグメントを識別し、ソフトウェアを追跡するニューロンは、樹枝状構造のx、y、およびz座標を収集するように反復的に再集束及び3Dにおける樹枝状構造の軌道を再構成する。比較的、EDFI方法は全体z軸に関する情報を提供し、合成画像を生成することではなく、厚い組織標本において、樹状密度を評価するための比較的単純かつ迅速な手段を提供する。そうするために、ユーザは、セクションの厚さ全体の高解像度ビデオファイルを記録し、画素に焦点が完全であることを特徴とするポイントを識別するためにビデオフレームを検索するためのソフトウェアを使用する。その後、フォーカスピクセルがマージされ、高解像度、合成2D画像に統合される。この合成画像は関係なく、z軸での位置の中で、焦点となったすべてのピクセルが含まれています。これらの2D画像の定性的および定量的分析は、濃度を決定するためにその後に使用することができの樹状突起の各分野での分岐。

最後に、関心領域全体における樹枝状結晶の分析および評価のために非常に高解像度の画像を生成するパノラマの方法を提示する。この技術は、非常に高解像度で高価なデジタルカメラへのアクセスの欠如を克服するために展開することができる。この方法を使用して、一方がx軸とy軸に沿った異なる位置で連続画像を取得し、自動的にそれらを一緒にフリーウェアを使用してステッチ（ 例えば 、画像のコンポジット·エディタ）。特に、この方法は、かなり広範囲に樹状樹枝状分岐の定性的および定量的評価のために使用することができる。

プロトコル

注：実験は、退役軍人パロ​​アルトヘルスケアシステムにおける動物研究委員会によって承認された倫理基準に従って行った。

1.ゴルジ - コックス染色

1. 脳抽出と染色
   1. 第一日目には、深く放血を経由して安楽死の前に100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgキシラジンでマウスを麻酔。
   2. 慎重に頭蓋冠を削除し、脳を解剖する。
      1. まず小脳の上に湾曲したハサミを置く、頭蓋骨の上に皮膚を除去し、軽くはさみの先で中心溝に頭蓋冠と平行を切断嗅球に向かう方向に移動する、外側に指摘した。両側にこのプロセスを繰り返します。
      2. 嗅球に向かってそれを回しながら頭蓋冠を持ち上げるために、外科ピンセットを使用して、それを破る。その後、逆さまに頭蓋骨を反転し、視神経を切断するためにピックを使って神経や脳を緩めます。最後に、大後頭孔のレベルで脊髄から脳を分離するためにピックを使用しています。
   3. すぐに市販の、希釈されていないゴルジ - コックス溶液15mlで脳を浸す。暗所で室温で蓋をし、20ミリリットルのガラス瓶にゴルジ液に脳に保管してください。
   4. 2日目、ゆっくりとソリューションを注ぐと15ミリリットル新鮮なゴルジ - コックス·ソリューションと交換してください。脳を含むボトルをおさらいし、暗所で別の9日間、平静なままにしておきます。
2. セクショニングと埋め込み
   1. 11日の日に、脱水のためのddH ₂ O中で調製30％のショ糖溶液中で脳を、置く。 12時間後に、新たに調製した30％のスクロースを含むソリューションを変更します。 4℃で3日間、30％ショ糖溶液中で脳をインキュベートする。
   2. ブレードが覆われるまで14日目に、30％のショ糖液でビブラトームのリザーバを埋める。 1メートルに速度を設定しますメートル/秒0.95ミリメートルの振幅である。
   3. 余分な水分を除去し、冠状に切断し、カミソリの刃を使用して、小脳を除去しキムワイプで脳ブロット。
   4. しっかりと瞬間接着剤を使用したビブラトームプラットフォームに全脳をマウントし、それが2-4分間に設定することができます。リザーバ内に付着した脳を持つプラットフォームを挿入し、脳のトップに刃を調整します。
   5. ビブラトームを使用して、3回目の脳の後にブレードを変更するには、覚えて、室温で150ミクロン厚の切片に脳スライス。
   6. 小さ ​​な傾いてブラシを使用して、リザーバーからのセクションをピックアップし、のddH ₂ Oで行われた0.3％ゼラチンを含むペトリ皿にそれらを浸すのセクションでは、ペトリ皿に残っている各スライド上の0.3％のゼラチンの0.5ミリリットルを追加し、スーパーフロスト+スライドを広げて、コーティングするためにブラシを使用している間。
   7. 静かにペトリ皿から浸さセクションをピックアップし、ゼラチン化スライド上に配置します。による脳切片の向き唯一の彼らの側にしていないのトップスにそれらに触れる。
   8. 約10分後、コート組織の前に30％のスクロースを含むセクションが完全に乾く。その後、空気は、3日間のスライドラックに暗い場所で準備スライドを乾燥させます。
   9. 市販の希釈して10倍ののddH ₂ Oを使用して1倍するソリューションの開発7-10分のためのソリューションの開発にスライドを浸す。のddH ₂ Oにスライドを3回すすぎ
3. 脱水
   1. 蒸留のddH ₂ Oを使用して20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、および95％エタノール溶液を調製し
   2. 10分ごとに、ますます高いエタノール溶液にスライドを浸す。
   3. 各回10分間、100％エタノール溶液で3回スライドを浸し。
   4. 彼らはカバースリップしているまで、最終溶液中のセクションを保ち、5分ごとに100％のキシレンに3回連続してスライドを浸す。
   5. DPXの寛大な量（キシレン中のジ-n-ブチルフタレート）マウンティング培地（ABを配置プラスチック転送ピペットを使用して、各スライドのうち1〜1.5ミリリットル）。慎重に泡を避けるために、カバースリップを配置。
   6. エアドライカバーが滑っ脳セクションを水平に3日間。

2.ダブルコルチン染色

1. 深く（ステップ1.1.1を参照）、動物を麻酔。
2. リン酸緩衝液¹²で行われた、新たに調製した4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。
3. ロッキングシェーカー上で一晩4℃で4％パラホルムアルデヒドの45ミリリットル中の脳（1.1.2を参照）、店舗を抽出します。
4. 30％のショ糖溶液に脳を移し、4℃で48時間、完全な脱水を待つ。ショ糖から脳を取り出し、ドライアイス上に置き、銅ブロックの上に直接配置します。
5. 最適な切削温度（OCT）化合物でブロックを記入し、ランドマークとして嗅球を用いて脳の向きをマーク。
6. クライオスタットを用いて、-20ºCで70ミクロン厚の切片を切り出し、それらを配置凍結保護物質溶液（0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液中の25％エチレングリコール、25％グリセロール、pH7.4）で-20℃で使用するまで続ける。
7. 50％の凍結保護剤および50％メタノールの溶液を作る。この溶液に、0.5％過酸化水素水（体積/体積）を加える。室温で30分間浮遊切片をインキュベートする。
8. 組織学的オーブンに入れて、30〜40分間、TBSで37ºC（トリス緩衝食塩水）でウォームセクション。
9. 免疫染色の前に室温で45分間、0.3％トリトンおよび3％の正常ウマ血清を持つセクションをインキュベートする。 0.3％トリトンと1％正常ウマ血清をTBSで500：1に希釈DCX抗体の3ミリリットル溶液中で一晩4ºCでのセクションをインキュベートします。
10. 次の日は、セクションをTBSで3回連続して（10分ずつ）洗浄します。
11. 室温で2時間：（TBS中200 1）ビオチン化ウマ抗ヤギを持つセクションをインキュベートします。セクションをTBSで3回連続して（10分ずつ）洗浄します。
12. Tをインキュベート室温で1.5時間：ABC Liteの（千1）と裾。
13. 1 Mトリス塩酸（pH7.6）で15mlに溶解DAB（3,3 "-Diaminobenzidine）の溶液に10mgの1錠30％のH ₂ O ₂の5μLを加える。 5分間この溶液に、すぐにセクションをインキュベートする。
14. 氷冷TBSで室温でTBSで1回洗浄した三回、それらを洗浄することにより反応を停止。
15. キシレンで透明なエタノール溶液（50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、5分毎）を用いた一連の切片を脱水した後、ステップ1.3のようDPXを用いてスリップをカバーする。

3.可視化

1. セクションの完全な乾燥の後、鋭利な刃で、スライドの上に過剰DPXを削除し、顕微鏡の走査ステージ上に置きます。システムは、走査ステージ、ジョイスティック、およびカラー12ビットのカメラを備えた顕微鏡で構成されている。
2. プログラムを起動します。新しいデータファイルを開きます。
3. 場所任意の場所でマウスポインタでクリックすることで、画面上の基準点。これは、プログラムウィンドウのツールパネルからすべてのアイコンがアクティブになります。
4. ツールバーの「ジョイスティック無料」アイコンをクリックし、第一項の海馬の歯状回を見つけるためにジョイスティックを使用しています。
5. プログラムウィンドウの「ツール」タブで、「シリアル課長」を選択します。ウィンドウの左下隅の「新規セクション」アイコンをクリックします。これは「シリアルセクションの設定」ウィンドウが開きます。
6. 連続切片Setupウィンドウを選択してから、海馬領域を含むセクションの合計数を入力します。評価間隔を選択します。 （DCXのための70ミクロンとゴルジ染色切片のために150μm）の厚さをカットセクションを入力します。
7. ツールバーの「フリーハンド輪郭描画」アイコンをクリックして歯状回領域トレースを開始。歯状回顆粒細胞層の概要を説明します。
8. 「倍率」メニューから「100X」を選択します。セクションのイマージョンオイルの滴を追加し、100Xに目標を切り替えます。この目的の下で歯状回顆粒細胞体と樹状突起の位置を確認します。
9. 選択したニューロンに焦点を当て、ツールバーの「ニューロントレース」アイコンをクリックしてください。歯状回顆粒細胞体の周囲をトレースします。トレースが終了したら、右の「完了セルボディ」をクリックして選択します。
10. x、y、z方向に手動で樹状突起のトレースを開始し、ジョイスティック及びz運動ノブを使用して、各ブランチに従う。分岐または三分岐ノードでは、右クリックすると、ドロップダウンメニューからそれぞれのオプションを選択します。これらのノードから発生する枝のそれぞれをトレースします。各ブランチの終わりに右クリックし、ドロップダウンメニューから「エンディング」を選択します。
11. ソフトウェアのウィンドウに矢印キーのアイコンを使用すると、ランダムに別の歯状回顆粒細胞を選択し、DESCRと同じ手順に従ってくださいステップ3.9から3.10にアイベッド。全体のトレースを保存します。
12. ニューロンのトレースソフトウェアを起動します。
13. 実験群の最初のマウスからの第NRXデータファイルを開きます。実験群の第二のマウスのNRXファイルを追加します。このグループからすべてのNRXファイルが追加されるまで継続する。
14. 分析]タブの下で、「ファンインダイアグラム」を選択します。これはファンイン分析ウィンドウが開きます。マーク「樹状突起」をチェックして、マウスのこのグループ（ 図1）のための樹状突起の長さと分岐パターンを示しているディスプレイをクリックします。

4. EDFI

注：この方法は、迅速に各フィールドのz軸を介して多数の画像を記録し、z軸全体のすべての集中画素を含む二次元画像を生成することを可能にする。その結果、収集した画像からのすべての集中画素を含む合成画像になります。

1. デジタルカムにマイクロスコープを接続時代。顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置して、10倍の対物レンズに切り替える。関心のある領域にステージを移動します。
2. ビデオキャプチャプログラムを起動します。
3. 録音ボタンを押します。とすぐに録音ボタンを押している、4秒の合計セクションの上から下に移動するために、マクロフォーカスノブを使用しています。結果のビデオファイルを保存します。
4. ファイルを開き、圧縮されていないファイル形式で保存することで、非圧縮フォーマットにAVIビデオファイルを変換するImageJのフリーウェアを使用してください。
5. 画像解析プログラムを起動し、AVIファイルを開きます。 「プロセス」メニューに移動し、「フィールドの拡張深さ」をクリックしてください。対応するビデオファイルを選択します。 「出力」オプションでは、「コンポジットベスト焦点画像の生成」を選択します。
6. 「フォーカス解析」オプションでは、「正規化照明」と「最大局所コントラスト」オプションを選択します。その後、「Creを選択「食べた。結果の画像は、z軸（ 図2）を通してすべてのフォーカスピクセルを表す。
7. 結果の画像を保存します。

5.極めて高解像度の画像を生成

注：この方法では、ユーザーは自動的に自動化された方法で、高倍率·高解像度画像から低倍率で非常に高解像度の画像を生成することを可能にする。

1. 顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置します。顕微鏡デジタルカメラに接続されている。関心のある領域にステージを移動します。
2. 画像取得プログラムを起動します。
3. 関心領域の画像は、少なくとも10％のオーバーラップを有することを確認して（xは3116 4076）10倍対物レンズを使用し、高解像度を取得し、保存する。
4. イメージをステッチするイメージコンポジット·エディタを実行します。
5. メニューをファイルに移動し、「新しいパノラマ」をクリックしてください。画像はSTされているフォルダを選択します論理和。同じ領域を押して「OK」に属している画像を選択します。
6. ボタンを押して「ディスクに書き出し」とイメージを保存します。この画像は、分析および/ ​​または実演（ 図3）のために使用することができる関心領域の非常に高解像度の画像を表す。

結果

現存及び新生歯状回顆粒細胞から生じる樹枝状分岐の程度は、ゴルジコックスまたはDCX染色（ 図1）のいずれかを使用して、野生型マウスにおいて分析した。 DCX陽性細胞の樹状突起セグメントは、13-36ミクロンの長いことが判明した。樹状長さの正規分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定を用いて試験した（D = 0.1217のp <0.01、Liliefors pは<0.001; 図4および図5?...

ディスカッション

ここでは、2つの方法がRTIとEDFIと組み合わせて、従来の染色法を用いて、成熟した、新たに生まれたニューロンにおける樹状突起樹枝状分岐の程度を定量化するために記載された。ニューロンの高解像度画像の取得は、神経変性障害の有害な影響を試験するための非常に有用な方法を提供し、ひいては、海馬神経細胞を標的とする治療戦略を評価するための手段を提供する。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00