Rata heterotópico abdominal Corazón / Trasplante de un solo pulmón en una configuración de volumen cargado

Resumen

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

Resumen

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

Introducción

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

Protocolo

Todos los animales fueron alojados y atendidos de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y Nacional. Ética aprobación de este protocolo fue concedido por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de la Columbia Británica. Hombre, ratas Sprague-Dawley que pesaban entre 300-450 g se utilizaron para este protocolo.

1. Donante Operación

1. Tienen aproximadamente 100 ml de cardioplegia (RT) en un matraz cilíndrico conectado a (IV) tubo de catéter intravenoso de largo por una llave de paso de 3 vías. Utilice un soporte para elevar el frasco aproximadamente 80 cm por encima de la superficie operativa, permitiendo la entrega cardioplejia por gravedad.
2. Para visualizar adecuadamente las estructuras, utilizar un par de lupas quirúrgicas o un microscopio de disección.
   NOTA: Actualmente usamos un microscopio quirúrgico binocular con 3,4 - magnificación 21.3X.
3. Coloque el donante en una cámara anestésica e inducir la anestesia con 4-5% isoflurano.
4. Traslado a la rata a una plataforma operativa y mantener la anestesia por la nariz de cono con 1 - 2% de isoflurano. Aplique un ungüento veterinario para los ojos del animal para evitar la sequedad. Administrar midazolam (2 mg / kg) por vía intraperitoneal con una aguja 25 G.
5. El uso de máquinas de cortar quirúrgicas, afeitarse el donante de xiphisternum de mandíbula. Shave una pequeña región de la ingle izquierda (para el acceso posterior IV). Aplicar un agente de depilación a las superficies operativas, espere aproximadamente 5 minutos, y quitar el pelo con un pedazo de gasa.
6. Prepara los sitios quirúrgicos con una solución a base de clorhexidina o povidona yodada (sólo usamos clorhexidina). Infíltrate en los sitios de incisión con 0,1 a 0,5% por vía subcutánea de lidocaína.
7. Asegure las extremidades anteriores y miembro posterior izquierdo de la plataforma operativa con cinta adhesiva, dejando la extremidad posterior derecha libre para monitorización de la profundidad anestésica y los signos vitales.
8. Después de asegurarse de la profundidad anestésica adecuada por pizca pedal, hacer una incisión en el pliegue de la ingle izquierda usandoun bisturí 22-cuchilla. Por disección roma, exponer la vena femoral común izquierda y obtener acceso IV de la siguiente manera:
   1. Retractar suavemente el tejido que recubre la vena femoral y canular la vena con un 24 G IV. Conecte el IV a un tramo corto de tubo IV lleno de solución salina, y asegurar el tubo en su lugar con cinta adhesiva.
      NOTA: El procedimiento para la canulación venosa femoral en ratas se describe en otro lugar por Jespersen y sus colegas ^14.
   2. Conectar una jeringa de 10 ml lleno de solución salina al tubo IV, y suavemente aspirar sangre para asegurar el correcto posicionamiento de la IV.
   3. Inyectar 300 a 500 UI de heparina no fraccionada a través del tubo IV, y lavar posteriormente el tubo con de 3 - 5 ml de solución salina.
9. A continuación, tracheotomize el donante como sigue:
   1. Hacer una incisión en los tejidos blandos entre la escotadura yugular y la mandíbula utilizando un bisturí 22-hoja. Penetrar la cápsula de la glándula tiroides en la línea media usando Metzentijeras Baum, y separados de sus lóbulos mediante disección roma.
   2. Utilizando disección roma, separar los músculos de la correa del cuello en la línea media para exponer la superficie anterior de la tráquea.
   3. Utilice unas pinzas curvas para diseccionar sin rodeos un plano circunferencial alrededor de la tráquea. Rodear la tráquea con una corbata de seda 4-0.
   4. Usando tijeras iris, hacer una incisión transversal en la tráquea anterior, aproximadamente 5 mm por debajo del cartílago tiroides. Introducir suavemente la cánula traqueal (un 14 G IV) y fijarlo en su lugar con el empate 4-0 seda.
   5. Conectar la cánula traqueal a un ventilador mecánico. Redirigir el flujo de oxígeno e isoflurano a través del circuito del ventilador, y ventilar el donante a una velocidad y volumen tidal predicho por su peso ^13.
10. Hacer una incisión en la línea media del pecho (utilizando un bisturí de hoja 22), que se extiende de la incisión en la muesca yugular a por debajo de la xipisternum.
11. Alojarse en la línea media, Realice una esternotomía media con un cortador de hueso. Retraer los bordes del esternón con un retractor de auto-retención. Introduzca el pericardio y cavidades pleurales.
12. Realice una timectomía. Es más fácil de dividir primero sin rodeos el timo en la línea media, y luego separarla de las estructuras circundantes utilizando una combinación de disección roma y cortante.
    NOTA: El origen de las arterias torácicas internas puede ser herido cuando diseccionando el timo de los bordes esternales superiores. Para prevenir el sangrado, clips hemostáticos se pueden aplicar antes de retirar el timo en estos puntos.
13. Con unas tijeras de Metzenbaum y / o un fuerte Lauer, diseccionar peri-cava grasa lejos de la vena cava inferior (VCI). Asegúrese de que el IVC está relativamente libre de grasa y tejido conectivo de la unión cavo fibrilación superiormente, al diafragma inferiormente.
14. Usando un fuerte Lauer, circunferencialmente libre de la vena cava superior (VCS) y rodear con un empate 4-0 seda.
15. A continuación, diseccionar ella izquierda de la vena cava, sin estructuras circundantes, y ligarlo proximal y distal con 4-0 corbatas de seda. Resecar la porción intermedia de cava para exponer la arteria subclavia izquierda.
16. Circunferencialmente gratis los vasos del cayado aórtico mediante un fuerte Lauer. Aplicar clips quirúrgicos proximal y distal a la arteria innominada, y dividirlo entre los clips. Deja la arteria carótida común izquierda y un-recortado la arteria subclavia izquierda.
17. A continuación, canular la vena cava superior con un catéter de 24 G IV. Asegure el catéter con el colocado previamente 4-0 corbata de seda.
18. Prepárese para una cosecha conveniente, pero suave injerto.
19. Con unas tijeras afiladas, divida el IVC simplemente superior a la superficie diafragmática. Divida la SVC superior a su sitio de canulación, asegurando que las estructuras de las vías respiratorias cercanos no están heridos.
20. Apague el ventilador y desconecte la cánula traqueal. Seccionar la tráquea proximal.
21. Sujete la tráquea seccionado con unas pinzas, y quitar el corazóny los pulmones en bloque. Esto requerirá una tracción suave con disección aguda como se retira el injerto de corazón-pulmón. Separar la tráquea desde el esófago subyacente. Evite lesionarse la aorta descendente, por lo que una buena parte de ella se mantiene intacta después de la cosecha.

2. Preparación del corazón-pulmón Graft

NOTA: al completar esta parte del procedimiento, un asistente debe ser anestesiar el roedor destinatario y la preparación para la implantación del injerto.

1. Coloque el injerto de corazón-pulmón en gasa quirúrgica con la superficie anterior del corazón hacia abajo. El uso de la disección aguda, eliminar cualquier esófago residual, evitando daños a las vías respiratorias posteriores.
2. Localice la aorta torácica descendente e insertar una cánula de punta roma 16 G. Fije la cánula en su lugar con un empate 4-0 seda.
3. Localice los vasos del cayado aórtico, y aplicar un clip quirúrgico a la arteria subclavia izquierda. Deja la arteria carótida izquierda un-recortado para subsecuente de-emisión.
4. Administrar la primera dosis de cardioplegia mediante la conexión de la tubería de cardioplegia a la cánula aórtica 16 G. La arteria carótida debe ser ocluida temporalmente con fórceps para asegurar la entrega adecuada de cardioplejía.
   NOTA: Una de las ventajas de tener la cánula aórtica adjunta es que cardioplejia se puede administrar de forma continua y / o de forma intermitente si lo deseas. Para la dosificación intermitente, que normalmente entregamos cardioplejia cada 10 - 15 min en 5 ml bolos sobre 30 - 45 seg.
5. Con unas tijeras de Metzenbaum y / o un fuerte Lauer, diseccionar la grasa peri-aórtica lejos de la aorta. Asegúrese de que la aorta es relativamente libre de grasa y tejido conectivo de la arteria subclavia izquierda (arco distal) a su sitio de canulación.
6. A continuación, exponer el bronquio principal izquierdo usando un fuerte Lauer, y ligarlo proximal con una corbata de seda 4-0. Seccionar el bronquio izquierdo distal a la ligadura usando tijeras iris. Realice una neumonectomía izquierda ligando el pulmonar izquierdaarteria y vena con 4-0 corbatas de seda. Seccionar distal a la ligadura y quitar el pulmón izquierdo.
7. Como anteriormente, eliminar todos los otros lóbulos pulmonares con la excepción de los lóbulos superior y medio derechos. Evite lesionar el IVC en el proceso de realizar lobectomías.
8. Conectar el tubo de cardioplegia a la cánula aórtica y administrar cardioplegia continua mientras se prepara el destinatario. Coloque el injerto de corazón-pulmón en un recipiente estéril (por ejemplo, un vaso de precipitados).

3. Receptor Operación

1. Anestesiar el receptor como por el funcionamiento de los donantes, arriba. Use ungüento veterinario para proteger los ojos del animal de la sequedad. Confirme la anestesia frecuentemente por pizca pedal.
2. Coloque el animal como por la operación de los donantes, esta vez dejando la extremidad anterior derecha libre para monitorear los signos vitales y la profundidad anestésica.
3. Afeitarse el abdomen de xiphisternum al pene. Shave una pequeña región de la ingle izquierda (para el acceso posterior IV). Aplique unaagente de depilación a las superficies operativas, espere aproximadamente 5 minutos, y quitar el pelo con un pedazo de gasa.
4. Prepara los sitios quirúrgicos con povidona yodada o solución a base de clorhexidina. Infíltrate en los sitios de incisión con 0,1 a 0,5% por vía subcutánea de lidocaína.
5. Tracheotomize y ventilar el receptor como se indicó anteriormente. Alternativamente, mantener el receptor bajo anestesia nariz de cono.
6. Introducir un catéter en la vena femoral como se describe anteriormente. Inyectar 300 a 500 UI de heparina no fraccionada a través del tubo IV, y lavar posteriormente el tubo con de 3 - 5 ml de solución salina.
7. Realice una laparotomía haciendo una incisión abdominal en la línea media con un bisturí 22 palas de xiphisternum al pene. Retirar la pared abdominal utilizando un retractor auto-retención. A continuación, retraer los intestinos superior y al lado izquierdo de la rata. Envuelva en caliente gasa empapada en solución salina.
8. Exponer la aorta abdominal por IVC y bruscamente la disección a través de la suprayacente regrasa-tro peritoneal.
9. Tener una pinza vaso curvado disponible y listo.
10. Circunferencialmente liberar el IVC y la aorta proximal y distal y rodearlos con 4-0 corbatas de seda. No debe ser de aproximadamente 2-3 cm de espacio entre estos sitios.
11. Aplicar cuidadosamente la abrazadera curvada recipiente, asegurándose de que una porción suficiente de ambos IVC y la aorta están expuestas por encima de las mandíbulas de la pinza.
12. Hacer una incisión en la pared anterior de la IVC con una aguja 25 G conectada a una jeringa de 1 ml lleno de solución salina. Extender la incisión con tijeras Potts para que coincida con la longitud de la donante IVC orificio.
13. Retire el injerto de corazón-pulmón de su contenedor y desconéctelo de cardioplejía. Coloque el injerto en el abdomen del receptor en una posición óptima para realizar la anastomosis venosa.
    NOTA: El injerto de corazón-pulmón en última instancia, estar orientada ligeramente oblicua, con el vértice apuntando hacia la década de abdomen dejó cuadrante inferior.
14. Asegure el talóny dedo del pie, extremos de la anastomosis con sutura de nylon 9-0. Haga un nudo seguro en cada extremo, dejando la aguja unida a un brazo largo de la sutura, y un extremo corto de la sutura que estar atado a más tarde. Administrar una dosis de cardioplejía.
15. En el funcionamiento de la moda, completa la mitad de la línea de sutura y corbata para el brazo de sutura corto opuestas. Administrar una dosis de cardioplejía.
16. Complete la otra mitad de la línea de sutura y atarlo. La anastomosis venosa es completa. Administrar una dosis de cardioplejía
17. Oriente el injerto de corazón-pulmón con vértice apuntando del corazón hacia los del abdomen dejó cuadrante inferior. Asegúrese de que la anastomosis venosa no está doblado o retorcido.
18. Evaluar la longitud de la aorta del donante que se requiere para llegar a la aorta destinatario, manteniendo tanto IVC y anastomosis aórtica en configuraciones libres de tensión y un-retorcidas.
19. Divida la aorta descendente (distal a la arteria subclavia izquierda) con una tijera iris.
20. Hacer una incision en la pared anterior de la aorta destinatario con una aguja 25 G conectada a una jeringa de 1 ml lleno de solución salina. Extender la incisión con tijeras Potts para que coincida con la longitud del orificio aórtico donante.
21. Anclar el dedo del pie (cara superior) de la aorta donante al receptor aorta utilizando una sutura de nylon 9-0. A continuación, pasar la aguja con el aspecto medial de la aorta y completar la mitad de la anastomosis en el funcionamiento de la moda.
22. En el talón de la anastomosis aórtica, invertir la orientación de la línea de sutura (una transición en la dirección de la costura), y completar el medio lateral de la anastomosis en el funcionamiento de la moda.
23. Retire lentamente el catéter IV en la vena cava superior, y ligar la vena cava superior con una pinza quirúrgica.
24. De aire la aorta mediante la localización de la arteria carótida común-un recortado izquierda. Mantener abierta la arteria, en una posición vertical que permitirá que el aire sea evacuado libremente.
25. Abrir brevemente las mandíbulas de la pinza vaso curvo y permite la arteria carótida a sangrar (de-aire) por 2 - 3 seg. Vuelva a aplicar la pinza buque.
26. Aplicar un clip quirúrgico a la arteria carótida. Retire la abrazadera vaso curvo.
27. Compruebe si hay sangrado en las líneas de sutura. Si está presente, aplicar compresión suave con una gasa o la reparación quirúrgica con una longitud de sutura de nylon 9-0 (dependiendo de la gravedad de la hemorragia).
28. El corazón del donante debe reanudar superando en cuestión de minutos.
29. Preste mucha atención a los signos vitales del beneficiario, la profundidad de la anestesia, y administrar el volumen de reanimación, según sea necesario.
30. Dependiendo de los criterios de valoración experimentales, ya sea cerrar abdomen del animal y dejar que se recupere de la anestesia, o preparar el animal para la evaluación cardiovascular.
    NOTA: Los ejemplos de evaluación de injerto incluyen en las medidas in vivo de la hemodinámica dependiente de la carga y la independiente de la carga, las medidas in vitro de la función en Langendorff y modos de trabajo del corazón y (en la cirugía de la supervivencia) ecocardiográficos o investigaciones de resonancia magnética.
31. En elfinal de los experimentos terminales agudas, los animales son sacrificados por desangramiento.

Resultados

La técnica HAHLT descrito anteriormente es muy técnico y requiere mucha atención a los detalles. Tabla 1 se destacan algunos de los principales factores asociados con éxito frente a los procedimientos fallidos, y pueden ser utilizados como una guía para la solución de problemas dificultades técnicas.

Después se suelta la aorta destinatario, las arterias coronarias del injerto deben ser vistos a llenarse de sangre oxigenada. En consecuencia, el miocardio se convierta ...

Discusión

El éxito con la técnica descrita aquí se basa en varios factores. Clave entre ellos será garantizar la estabilidad tanto de los animales donantes y receptores, la adopción de la técnica quirúrgica meticulosa que es seguro y asociado con mínima pérdida de sangre, lo que garantiza la detención cardioplégica completo con un enfriamiento uniforme del injerto, lo que minimiza el tiempo de isquemia total y adecuadamente de-a transmitirse el injerto. Como ha reconocido anteriormente, la complejidad técnica de la t?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.