Rat eterotopico addominale Cuore / Trapianti Single-polmone in una configurazione del volume-caricato

Riepilogo

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

Abstract

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

Introduzione

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati alloggiati e curati in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio nazionale e. Approvazione etica per questo protocollo è stato concesso dalla University of Comitato Animal Care della Columbia Britannica. Maschio, ratti Sprague-Dawley di peso compreso tra 300-450 g sono stati utilizzati per questo protocollo.

1. donatori Operazione

1. Hanno circa 100 ml di cardioplegia (RT) in vaso cilindrico collegato alla (IV) tubi catetere endovenoso lungo da un rubinetto a 3 vie. Utilizzare un supporto per elevare il matraccio a circa 80 centimetri al di sopra della superficie operativa, consente la distribuzione cardioplegia per gravità.
2. Per visualizzare in modo adeguato le strutture, utilizzare un paio di occhialini per la chirurgia o un microscopio da dissezione.
   NOTA: Al momento stiamo utilizzando un microscopio operatorio binocolo con 3.4 - 21.3X ingrandimento.
3. Posizionare il donatore in una camera anestetico e indurre l'anestesia con 4-5% isoflurano.
4. Trasferire il topo di una piattaforma operativa e mantenere l'anestesia da naso-cono con 1-2% isoflurano. Applicare veterinario unguento per gli occhi degli animali per prevenire la secchezza. Somministrare midazolam (2 mg / kg) intra-peritoneally con un ago da 25 G.
5. Utilizzando tagliatori chirurgici, radere il donatore da xiphisternum a mandibola. Radere una piccola regione inguinale sinistra (per il successivo accesso IV). Applicare un prodotto depilazione per le superfici operative, attendere circa 5 minuti, e rimuovere i capelli con un pezzo di garza.
6. Prep i siti chirurgici con una soluzione basata su clorexidina povidone-iodio o (usiamo solo clorexidina). Infiltrati i siti incisionali con 0,1-0,5% lidocaina per via sottocutanea.
7. Fissare gli arti anteriori e degli arti posteriori a sinistra per la piattaforma operativa con del nastro adesivo, lasciando il arti posteriori destro libero per il monitoraggio della profondità dell'anestesia e dei segni vitali.
8. Dopo aver verificato appropriato profondità dell'anestesia dal pedale pizzico, fare un'incisione nell'inguine piega a sinistra conun bisturi 22-blade. Per via smussa, esporre la vena femorale comune sinistra e ottenere l'accesso IV come segue:
   1. Ritrarre delicatamente il tessuto sovrastante la vena femorale, e cannulate la vena con un 24 G IV. Collegare il IV ad un breve tratto di tubo soluzione salina IV, e fissare il tubo in posizione con nastro adesivo.
      NOTA: La procedura per l'incannulamento venoso femorale nei ratti è descritto altrove da Jespersen e colleghi ^14.
   2. Collegare una siringa da 10 ml di soluzione salina-riempita al tubo IV, e delicatamente aspirare sangue per assicurare il corretto posizionamento del IV.
   3. Iniettare 300-500 UI di eparina non frazionata attraverso il tubo IV, e successivamente lavare il tubo con 3 - 5 ml di soluzione fisiologica.
9. Successivamente, tracheotomize il donatore come segue:
   1. Eseguire un'incisione mediana nei tessuti molli tra la tacca giugulare e della mandibola utilizzando un bisturi 22 pale. Penetrare la capsula della ghiandola tiroidea sulla linea mediana con Metzenforbici Baum, e separati i suoi lobi utilizzando scollamento.
   2. Utilizzando smussa, separare i muscoli cinghia del collo sulla linea mediana per esporre la superficie anteriore della trachea.
   3. Utilizzare una pinza curve per sezionare senza mezzi termini di un piano circonferenziale attorno alla trachea. Circondare la trachea con una cravatta di seta 4-0.
   4. Usando forbici iris, fare una incisione trasversale nella trachea anteriore, circa 5 millimetri inferiore alla cartilagine tiroidea. Introdurre delicatamente la cannula tracheale (a 14 G IV) e fissarlo con la cravatta di seta 4-0.
   5. Collegare la cannula tracheale di un ventilatore meccanico. Reindirizzare il flusso di ossigeno e isoflurano attraverso il circuito del ventilatore, e ventilare il donatore ad una velocità e il volume corrente previsto dal suo peso ^13.
10. Fare un'incisione sulla linea mediana del torace (con un bisturi 22-lama), estendendo l'incisione alla giugulare al di sotto del xipisternum.
11. Rimanendo sulla linea mediana, Eseguire una sternotomia mediana con un cutter osso. Ritrarre i bordi dello sterno con un divaricatore autoritenuta. Inserisci il pericardio e cavità pleuriche.
12. Eseguire un timectomia. E 'più facile per dividere prima senza mezzi termini il timo sulla linea mediana, e poi separarla dalle strutture circostanti utilizzando una combinazione di scollamento e tagliente.
    NOTA: L'origine delle arterie toraciche interne può essere ferito quando sezionare il timo dai bordi sternali superiori. Per prevenire il sanguinamento, clip emostatici possono essere applicate prima di rimuovere il timo in questi punti.
13. Utilizzando forbici Metzenbaum e / o di un forte Lauer, sezionare peri-cavale grasso dalla vena cava inferiore (IVC). Assicurarsi che la IVC è relativamente priva di grassi e tessuto connettivo dalla giunzione cavo-atriale superiormente, inferiormente al diaframma.
14. Utilizzando un forte Lauer, circonferenzialmente libera vena cava superiore (SVC) e circondare con una cravatta 4-0 seta.
15. Avanti, sezionare ilsinistra vena cava libera da strutture circostanti, e legare esso prossimale e distale con 4-0 cravatte di seta. Resecare la parte intervenendo di cava per esporre l'arteria succlavia sinistra.
16. Circonferenzialmente libera i vasi dell'arco aortico con un forte Lauer. Applicare clips chirurgiche prossimale e distale della arteria anonima, e dividerlo tra i clip. Lasciare l'arteria carotide comune sinistra e succlavia sinistra arteria un-ritagliato.
17. Successivamente, cannulate la SVC con un catetere 24 G IV. Fissare il catetere con la precedentemente posizionato 4-0 cravatta di seta.
18. Preparati per un raccolto trapianto ripiego, ma gentile.
19. Utilizzando forbici affilate, dividere la IVC appena superiore alla superficie diaframmatica. Divide la SVC superiore al suo sito incannulazione, assicurando che le strutture delle vie aeree nei dintorni non sono feriti.
20. Spegnere il ventilatore e staccare la cannula tracheale. Transetto la trachea prossimale.
21. Afferrare la trachea sezionato con una pinza, e togliere il cuoree polmoni en-bloc. Ciò richiederà una leggera trazione con dissezione tagliente come il trapianto cuore-polmone è stato rimosso. Separare la trachea dall'esofago sottostante. Evitare lesioni dell'aorta discendente, in modo che una porzione lunga di esso rimane intatto dopo la raccolta.

2. Preparazione del cuore-polmoni Graft

NOTA: mentre il completamento di questa parte della procedura, un assistente dovrebbe essere anestetizzare il roditore destinatario e la preparazione per trapianto impianto.

1. Posizionare il trapianto cuore-polmoni su garza chirurgica con la superficie anteriore del cuore rivolto verso il basso. Utilizzando dissezione tagliente, rimuovere eventuali residui di esofago, evitando lesioni alle vie respiratorie posteriori.
2. Individuare l'aorta toracica discendente e inserire una punta smussata cannula 16 G. Fissare la cannula in posizione con un pareggio 4-0 in seta.
3. Individuare i vasi dell'arco aortico, e applicare una clip chirurgico al succlavia sinistra. Lasciare la carotide sinistra un-tagliati per subsequent de-aerazione.
4. Somministrare la prima dose di cardioplegia collegando il tubo cardioplegia alla cannula aortica 16 G. L'arteria carotide deve essere occluso temporaneamente con una pinza per garantire un'adeguata fornitura di cardioplegia.
   NOTA: Un vantaggio di avere la cannula aortica allegato è che cardioplegia può essere somministrato in modo continuo e / o periodicamente, se lo desideri. Per il dosaggio intermittente, di solito consegniamo cardioplegia ogni 10 - 15 minuti in 5 ml boli over 30 - 45 sec.
5. Usando forbici Metzenbaum e / o un forte Lauer, sezionare grasso peri-aortico lontano dall'aorta. Assicurarsi che l'aorta è relativamente priva di grassi e tessuto connettivo della succlavia sinistra (arco distale) al suo sito cannulazione.
6. Avanti, esporre il bronco principale di sinistra con un forte Lauer, e legare è prossimale con un pareggio 4-0 in seta. Transetto il bronco distale sinistra per la legatura con forbici iris. Eseguire un pneumonectomy lasciato legando polmonare sinistraarteria e vena con 4-0 cravatte di seta. Transect distale alla legatura e rimuovere il polmone sinistro.
7. Come sopra, rimuovere tutte le altre lobi polmonari con l'eccezione del diritto lobi superiori e medie. Evitare ferendo la IVC nel processo di esecuzione lobectomie.
8. Collegare il tubo cardioplegia alla cannula aortica e amministrare cardioplegia continuo mentre il destinatario è in preparazione. Posizionare il trapianto cuore-polmone in un contenitore sterile (ad esempio, un becher).

3. Destinatario Operazione

1. Anestetizzare il destinatario secondo l'operazione donatore, sopra. Utilizzare veterinario pomata per proteggere gli occhi dell'animale da secchezza. Confermare anestesia spesso a pedale pizzico.
2. Posizionare l'animale come per l'operazione del donatore, questa volta lasciando la zampa anteriore destra libera di monitorare i segni vitali e profondità dell'anestesia.
3. Radere l'addome da xiphisternum a pene. Radere una piccola regione inguinale sinistra (per il successivo accesso IV). Applicare unaagente depilating le superfici operative, attendere circa 5 minuti, e rimuovere i capelli con un pezzo di garza.
4. Prep i siti chirurgici con povidone-iodio o soluzione basata clorexidina-. Infiltrati i siti incisionali con 0,1-0,5% lidocaina per via sottocutanea.
5. Tracheotomize e ventilare il destinatario come indicato sopra. In alternativa, mantenere il destinatario in anestesia naso-cono.
6. Introdurre un catetere nella vena femorale come descritto sopra. Iniettare 300-500 UI di eparina non frazionata attraverso il tubo IV, e successivamente lavare il tubo con 3 - 5 ml di soluzione fisiologica.
7. Eseguire una laparotomia facendo una incisione addominale mediana con un bisturi a lama da 22 xiphisternum a pene. Ritrarre la parete addominale con un divaricatore di auto-mantenimento. Avanti, ritrarre le viscere superiormente e per il lato sinistro del topo. Avvolgere in caldo, garza imbevuta di soluzione salina.
8. Esporre l'aorta addominale IVC e da forte dissezione attraverso la sovrastante regrasso tro-peritoneale.
9. Avere un morsetto nave curvo disponibili e pronti.
10. Circonferenzialmente liberare l'IVC e dell'aorta prossimale e distale e circondare con 4-0 cravatte di seta. Ci dovrebbe essere di circa 2-3 cm di spazio tra questi siti.
11. Applicare con cura il morsetto nave curvo, in modo che una porzione sufficiente sia IVC e dell'aorta sono esposti sopra le ganasce del morsetto.
12. Fare un'incisione nella parete anteriore della IVC con un ago 25 G collegato ad una siringa di soluzione salina 1 ml. Estendere l'incisione con le forbici Potts in base alla lunghezza del donatore IVC orifizio.
13. Rimuovere il trapianto cuore-polmone dal suo contenitore e scollegarlo dalla cardioplegia. Posizionare l'innesto nell'addome del destinatario in una posizione ottimale per eseguire l'anastomosi venosa.
    NOTA: L'innesto cuore-polmone alla fine sarà orientata leggermente obliquo, con la punta apice verso l'addome di sinistra quadrante inferiore.
14. Fissare il taccoe punta estremità della anastomosi con 9-0 sutura in nylon. Fare un nodo sicuro ad ogni estremità, lasciando l'ago di un lungo braccio di sutura, e una breve fine di sutura per essere legato a un secondo momento. Somministrare una dose di cardioplegia.
15. In modo esecuzione, completa la metà della linea di sutura e cravatta al braccio di sutura breve opposte. Somministrare una dose di cardioplegia.
16. Completa l'altra metà della linea di sutura e legarlo giù. L'anastomosi venosa è completo. Somministrare una dose di cardioplegia
17. Orientare il trapianto cuore-polmone con puntamento apice del cuore verso l'addome di sinistra quadrante inferiore. Assicurarsi che l'anastomosi venosa non sia piegato o attorcigliato.
18. Valutare la lunghezza dell'aorta donatore che sarà richiesto per raggiungere l'aorta destinatario, mantenendo sia IVC e anastomosi aortica in configurazioni tension-free e non-piegati.
19. Dividete l'aorta discendente (distale succlavia sinistra) con una forbici iris.
20. Fai incision nella parete anteriore dell'aorta destinatario con un ago da 25 G collegato ad una siringa di soluzione salina 1 ml. Estendere l'incisione con le forbici Potts in base alla lunghezza dell'orifizio aortico donatore.
21. Ancorare la punta (aspetto superiore) dell'aorta donatore al ricevente aorta usando una sutura 9-0 nylon. Quindi, passare l'ago al mediale dell'aorta e completare la metà delle anastomosi in esecuzione moda.
22. Al tallone del anastomosi aortica, invertire l'orientamento della linea di sutura (una transizione nella direzione di cucitura), e completare la metà laterale della anastomosi in esecuzione moda.
23. Rimuovere lentamente il catetere IV nel SVC, e legare l'SVC con una clip chirurgica.
24. De-air l'aorta individuando il non-ritagliato sinistra arteria carotide comune. Tenere aperta l'arteria, in posizione verticale che permetterà all'aria di essere liberamente evacuato.
25. Brevemente aprire le ganasce della pinza vaso curvo e consentire l'arteria carotide sanguinare (de-air) per 2-3 sec. Riapplicare il morsetto nave.
26. Applicare una clip chirurgica alla carotide. Rimuovere la fascetta vaso curvo.
27. Verificare la presenza di emorragie alle linee di sutura. Se presente, applicare lieve compressione con garza o riparazione con una lunghezza di 9-0 sutura di nylon (a seconda della gravità del sanguinamento).
28. Il cuore del donatore dovrebbe riprendere battendo in pochi minuti.
29. Prestare particolare attenzione ai segni vitali del destinatario, profondità dell'anestesia, e amministrare il volume rianimazione, se necessario.
30. A seconda dei punti finali sperimentali, o chiudere l'addome dell'animale e farlo recuperare da anestesia, o prepara l'animale per la valutazione cardiovascolare.
    NOTA: Gli esempi di valutazione del trapianto sono in misure in vivo di emodinamica in funzione del carico e indipendente dal carico, misure in vitro della funzione in Langendorff e modalità di lavoro, e il cuore (in chirurgia sopravvivenza) ecocardiografici o indagini di risonanza magnetica.
31. Alfine degli esperimenti terminali acuti, gli animali sono eutanasia per dissanguamento.

Risultati

La tecnica HAHLT sopra descritta è molto tecnico e richiede grande attenzione ai dettagli. Tabella 1 evidenzia alcuni dei fattori chiave associati con successo contro le procedure fallimentari, e può essere utilizzato come una guida per la risoluzione di problemi tecnici.

Dopo l'aorta destinatario è sbloccata, l'innesto arterie coronarie dovrebbero essere considerati a riempirsi di sangue ossigenato. Di conseguenza, il miocardio dovrebbe diventare rosa e ben irror...

Discussione

Il successo con la tecnica descritta qui basarsi su diversi fattori. Key tra i quali sarà garantire la stabilità di entrambi i donatori e riceventi, adottando meticolosa tecnica operatoria che è sicuro e associata con una minima perdita di sangue, garantendo completo arresto cardioplegico con raffreddamento trapianto uniforme, riducendo al minimo il tempo ischemico totale, e adeguatamente de-onda l'innesto. Come riconosciuto in precedenza, la complessità tecnica della tecnica è il suo limite principale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.