ラット異腹部ボリュームにロードされた構成でのハート/シングル肺移植

要約

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

要約

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

概要

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

プロトコル

すべての動物を飼育し、実験動物の管理と使用のための国家と制度ガイドラインに従って世話しました。このプロトコルの倫理承認は、ブリティッシュコロンビア州の動物管理委員会の大学によって付与されました。 300との間体重の雄、SDラット - 450 gが、このプロトコルのために使用しました。

1.ドナー操作

1. 3方活栓によって、長い静脈内（IV）カテーテル管に接続された円筒形フラスコに心臓麻痺（RT）の約100ミリリットルを持っています。重力によって心停止提供を可能にする、約80センチメートル作用表面の上にフラスコを上昇させるために、スタンドを使用してください。
2. 適切な構造を可視化するために、外科手術用ルーペのペアまたは解剖顕微鏡のどちらかを使用します。
   注：我々は現在、3.4で双眼手術用顕微鏡を使用する - 21.3X倍率。
3. 麻酔室にドナーを置き、4で麻酔を誘導 - 5％イソフルラン。
4. オペレーティングプラットフォームにラットを移し、1とノーズコーンにより麻酔を維持 - 2％イソフルラン。乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を適用します。 25 G針でミダゾラム（2ミリグラム/ kg）を腹腔内に投与します。
5. 手術用バリカンを使用して、剣状突起から下顎にドナーを剃ります。 （その後のIVアクセスのための）左鼠径部の小さな領域を剃ります。作用面に脱毛剤を塗布、約5分間待機し、ガーゼで髪を削除します。
6. 準備ポビドンヨードまたはchlorexidineベースのソリューションで手術部位（我々は唯一のクロルヘキシジンを使用します）。 0.5％リドカイン皮下 - 0.1と切開部位に潜入。
7. 麻酔深度とバイタルサインのモニタリングのための無料の右後肢を残して、粘着テープを使用してオペレーティング·プラットフォームに前肢と左後肢を固定します。
8. ペダルピンチすることにより、適切な麻酔深度を確認した後、使用して、左鼠径部の折り目に切開を作ります22ブレードメス。鈍的切開によって、左大腿静脈を露出させ、次のように静脈アクセスを取得します。
   1. 静かに大腿静脈を覆う組織を撤回し、24のG IVで静脈にカニューレを挿入。生理食塩水で満たされたIVチューブの短い長さにIVを接続し、粘着テープで所定の位置にチューブを固定します。
      注：ラットにおける大腿静脈カニューレ挿入のための手順はイェスペルセンや同僚¹⁴によって他の箇所に記載されています。
   2. IVチューブに生理食塩水を充填した10mLのシリンジを接続し、静かにIVの正確な位置決めを確実にするために血液を吸引します。
   3. IVチューブを通して未分画ヘパリンの500 IU、その後3でチューブをフラッシュ - - 300を注入し、生理食塩水5mlの。
9. 次に、以下のようにドナーをtracheotomize：
   1. 22ブレードメスを用いて頸静脈ノッチと下顎の間の軟組織に正中切開を行います。 Metzenを使用して、正中線に甲状腺のカプセルに浸透バウムはさみ、および鈍的切開を使用して、そのローブを分離します。
   2. 鈍的切開を使用して、気管の前面を露出させるために正中線にネックストラップの筋肉を分離します。
   3. ぶっきらぼうに気管の周りに周面を分析するために、湾曲鉗子を使用してください。 4-0絹のネクタイと気管を取り囲みます。
   4. アイリスはさみを使用して、前方気管内に横切開を行い、甲状軟骨の約5ミリメートル劣ります。静かに気管カニューレ（14 G IV）を導入し、4-0絹のネクタイを使用して所定の位置に固定します。
   5. 人工呼吸器に気管カニューレを接続します。人工呼吸器回路を通る酸素およびイソフルランの流れをリダイレクトし、速度、重量¹³によって予測された一回換気量でドナーを換気。
10. 胸の正中線で切開を行います（22ブレードメスを用いて）、xipisternum以下に頸静ノッチで切開部を拡張します。
11. 正中線での滞在、骨のカッターを用いて胸骨正中切開を行います。自己保持リトラクターと胸骨のエッジを後退させます。心膜および胸膜腔を入力します。
12. 胸腺摘出を行います。それは最初ぶっきらぼうに正中線で胸腺を分割し、その後鈍、鋭い切開の組み合わせを使用して、周囲の構造から分離するのが最も簡単です。
    注：離れて優れた胸骨縁から胸腺を解剖時に内胸動脈の起源は、けがをする恐れがあります。出血を防ぐために、止血クリップは、これらの点で、胸腺を除去する前に適用してもよいです。
13. Metzenbaumはさみを使用して、および/またはシャープラウアー、下大静脈（IVC）から離れた脂肪ペリ大静脈解剖。 IVCは、下方ダイヤフラムに、上方カーボ心房接合部から脂肪と結合組織の比較的自由であることを確認してください。
14. シャープラウアーを使用して、円周方向に上大静脈（SVC）を解放し、4-0絹のネクタイとそれを取り囲みます。
15. 次に、解剖周囲の構造のない大静脈を離れ、近位および遠位4-0シルクネクタイとそれを連結します。左鎖骨下動脈を露出させるために静脈の介在部分を切除します。
16. 円周方向に鋭いラウアーを使用して、大動脈弓の血管を解放します。腕頭動脈の近位および遠位の外科手術用クリップを適用して、クリップの間にそれを分けます。左総頸動脈と左鎖骨下動脈の未クリップされたままにしておきます。
17. 次に、24 G IVカテーテルでSVCにカニューレを挿入。以前に配置された4-0絹のネクタイでカテーテルを固定します。
18. 好都合が、穏やかなグラフト収穫の準備をします。
19. 鋭いハサミを使用して、横隔膜面にだけ優れたIVCを分割。近くの気道構造が負傷されていないことを確認して、そのカニューレ挿入部位への優れたSVCを分割します。
20. 人工呼吸器の電源をオフにして、気管カニューレを外します。近位に気管を横断。
21. 鉗子で横に切開気管を持ち、心を削除肺エン圏。心肺移植片が除去されるように、これは鋭い解剖で穏やかなトラクションが必要になります。基本となる食道から気管を分離します。それの長い部分は収穫後そのまま残るように、下行大動脈を傷つけないように注意してください。

心肺移植片の調製

注：この手順のこの部分を完了しながら、アシスタントが受信者のげっ歯類を麻酔し、移植片移植の準備をする必要があります。

1. 下に向けて、心臓の前面に手術用ガーゼに心肺移植片を配置します。鋭い解剖を使用して、後部気道への損傷を回避すること、任意の残留食道を削除します。
2. 降順胸部大動脈の位置を確認し、16 Gの鈍先端のカニューレを挿入します。 4-0絹のネクタイで所定の位置にカニューレを固定します。
3. 大動脈弓の血管を見つけ、左鎖骨下動脈に外科用クリップを適用します。サブ国連クリップされ、左頸動脈を残しますシークエントの脱気。
4. 16 G大動脈カニューレに心臓麻痺チューブを接続することにより、心停止の最初の用量を投与。頸動脈は一時的に心臓麻痺の適切な供給を確保するために鉗子で閉塞されなければなりません。
   注：添付の大動脈カニューレを有することの利点は、所望のように心臓麻痺を連続的および/または断続的に投与され得ることです。 45秒 - 30以上の5ミリリットルのボーラスで15分 - 間欠投与のために、我々は、典型的には、すべての10心筋保護を提供します。
5. Metzenbaumはさみおよび/または鋭いラウアーを使用して、離れて大動脈から周囲の大動脈脂肪を分析。大動脈は、その挿管サイトに左鎖骨下動脈（遠位弓）からの脂肪および結合組織の比較的自由であることを確認してください。
6. 次に、鋭いラウアーを使用して、左主気管支を露出し、4-0絹のネクタイと近位にそれを連結。アイリスのはさみを使用して、合字の左気管支の先端を横断。左肺を連結することにより、左肺全摘術を行います4-0シルクネクタイと動脈と静脈。合字に遠位横断し、左肺を削除します。
7. 上記のように、右上と中央ローブの例外を除いて、他のすべての肺葉を削除します。 lobectomiesを行う過程でIVCを負傷しないようにします。
8. 大動脈カニューレに心臓麻痺チューブを接続し、受信者が用意されている間、連続心臓麻痺を管理します。滅菌容器（ 例えば、ビーカー）で心肺移植片を配置します。

3.受信者の操作

1. 上記、ドナー操作ごとに受信者を麻酔。乾燥状態から、動物の目を保護するために獣医軟膏を使用してください。ペダルピンチによって頻繁に麻酔を確認してください。
2. ドナー操作ごとに動物を置き、この時間はバイタルサインと麻酔深度を監視すること自由に右前肢を残します。
3. 剣状突起からペニスに腹部を剃ります。 （その後のIVアクセスのための）左鼠径部の小さな領域を剃ります。適用します作用面に薬剤を脱毛、約5分間待機し、ガーゼで髪を削除します。
4. 準備ポビドンヨードまたはchlorexidineベースのソリューションで手術部位。 0.5％リドカイン皮下 - 0.1と切開部位に潜入。
5. Tracheotomize上記指示されたように、受信者を換気。代わりに、ノーズコーン麻酔下での受信者を維持します。
6. 上述したように、大腿静脈にカテーテルを導入します。 IVチューブを通して未分画ヘパリンの500 IU、その後3でチューブをフラッシュ - - 300を注入し、生理食塩水5mlの。
7. 剣状突起から陰茎に22ブレードメスで腹部正中切開を行うことで、開腹術を行います。自己保持リトラクターを使用して腹壁を撤回。次に、上方およびラットの左側に腸を撤回。暖かい、生理食塩水に浸したガーゼでラップ。
8. 急激にその上の再を通して解剖によってIVCと腹部大動脈を露出させますTRO-腹膜脂肪。
9. 湾曲した血管のクランプが使用可能であり、準備ができています。
10. 円周方向に近位および遠位IVCと大動脈を解放し、4-0シルクネクタイとそれらを取り囲みます。これらのサイトとの間の空間の3センチメートル - 約2が必要です。
11. IVCと大動脈の両方の十分な部分がクランプのジョーの上に露出していることを確認して、湾曲した血管のクランプを慎重に適用されます。
12. 生理食塩水を満たした1ml注射器に接続された25 G針でIVCの前壁の切開を行います。ドナーIVCのオリフィスの長さに合わせて、ポッツはさみで切開を拡張します。
13. その容器から心肺移植片を取り外し、それは心停止から切断。静脈吻合を実行するために最適な位置に受信者の腹部に移植片を配置します。
    注：腹部年代に向けて頂点ポインティングが下腹部を左に心肺移植片は、最終的には、少し斜めに配向することになります。
14. かかとを固定とつま先は、9-0ナイロン縫合糸との吻合部の端部。縫合糸の長腕に取り付けられた針、およびそれ以降に接続するための縫合糸の短い方の端を残して、各端部に安全な結び目を作ります。心筋保護の用量を投与します。
15. ファッションを実行するには、反対側の短い縫合糸アームに縫合線とネクタイの完全半分。心筋保護の用量を投与します。
16. 縫合線の他の半分を完了し、それを結びます。静脈吻合が完了しました。心筋保護の用量を投与
17. オリエントは、腹部のに向かって心の頂点ポインティングと心肺移植片は、下腹部を残しました。静脈吻合がよじれやねじれがないことを確認してください。
18. テンションフリーと非ねじれた構成でIVCと大動脈吻合の両方を維持し、受信者の大動脈に到達するために必要とされるドナー大動脈の長さを評価します。
19. アイリスハサミで（左鎖骨下動脈の遠位）下行大動脈を分割します。
20. incisioを作りますnは生理食塩水を満たした1ml注射器に接続された25 G針でレシピエント大動脈の前壁で。ドナー大動脈オリフィスの長さに合わせて、ポッツはさみで切開を拡張します。
21. 9-0ナイロン縫合糸を使用して、大動脈受信者にドナー大動脈のつま先（優れた側面）をアンカー。そして、大動脈の内側面に針を渡すとファッションの実行中に、吻合部の2分の1を完了します。
22. 大動脈吻合のかかとでは、縫合線（ステッチの方向の遷移）の向きを逆にし、ファッションを実行するには吻合部の横方向の半分を完了します。
23. ゆっくりSVCにIVカテーテルを除去し、外科手術用クリップでSVCを連結。
24. 未クリップさ左総頸動脈を配置することにより脱空気大動脈。空気が自由に避難できるようになります直立姿勢で、オープン動脈を保持します。
25. 簡単に言えば、D（湾曲した血管クランプのジョーを開き、頸動脈が出血することができます電子空気）2 - 3秒。血管クランプを再適用します。
26. 頸動脈に外科用クリップを適用します。湾曲した血管のクランプを外します。
27. 縫合線での出血を確認してください。存在する場合、（出血の重症度に応じて）9-0ナイロン縫合糸の長さの外科ガーゼや修復に穏やかな圧縮を適用します。
28. ドナー心臓は、数分以内に暴行を再開する必要があります。
29. 受信者のバイタルサイン、麻酔の深さに細心の注意を払い、必要に応じてボリュームの蘇生を管理します。
30. 実験のエンドポイントに応じて、動物の腹部を閉じて、それが麻酔から回復させ、または心血管評価のために動物を準備するのどちらか。
    注：移植性評価の例としては、負荷に依存し、負荷に依存しない血行動態の in vivoでの対策、 インビトロランゲンドルフ関数の対策と作業心臓モード、（生存手術で）心エコーやMRIの調査に含まれています。
31. に急性端末実験の終わりに、動物を放血によって安楽死させます。

結果

上記のHAHLT技術は、高度な技術であり、詳細には細心の注意が必要です。 表1のハイライト失敗手順対成功に関連付けられており、技術的な問題のトラブルシューティングを行うためのガイドとして使用することができる重要な要因のいくつか。

受信者の大動脈がアンクランプされた後、グラフト冠状動脈は酸素を豊富に含んだ血液でいっぱいに見られるべ?...

ディスカッション

ここに記載の技術の成功は、いくつかの要因に基づいて予測されます。それらの中のキーは、両方のドナーとレシピエント動物の安定性を確保し、安全かつ最小限の血液損失に関連付けられている細心の手術技術を採用し、均一なグラフト冷却との完全な心停止停止を確保し、総虚血時間を最小限に抑え、かつ適切に移植片を脱気されます。上記認めたように、技術者の技術的な複雑さは、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.