Крыса Гетеротопическая животе Сердце / Трансплантация одного легкого в объеме загружены Configuration

Резюме

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

Аннотация

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

Введение

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

протокол

Все животные были размещены и уход в соответствии с национальными и институциональные рекомендации по уходу и использованию лабораторных животных. Утверждение этики для этого протокола был предоставлен университетом комитета по уходу за животными Британской Колумбии. Мужской, Спрэг Dawley крыс весом от 300 - 450 г были использованы для этого протокола.

Операция 1. Донор

1. У примерно в 100 мл кардиоплегии (RT) в цилиндрической колбе, подключенного к длительного внутривенного (IV) трубки катетера с помощью 3-ходовым запорным краном. Используйте подставку, чтобы поднять колбу примерно 80 см выше поверхности оперативного, позволяет доставку КАРДИОПЛЕГИИ под действием силы тяжести.
2. Для визуализации структур адекватно использовать либо пару хирургических луп или рассекает микроскоп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы в настоящее время используют бинокулярного микроскопа с операционной 3.4 - 21.3X увеличения.
3. Поместите донора в анестезиологической камеры и вызывают анестезию 4 - 5% изофлуран.
4. Перевести крысу операционной платформы и поддержания анестезии по носового конуса с 1 - 2% изофлуран. Применить ветеринар мазь для глаз животного, чтобы предотвратить сухость. Администрирование мидазолам (2 мг / кг) внутрибрюшинно с иглой 25 G.
5. Использование хирургических ножницы, брить донора от мечевидного отростка до нижней челюсти. Бритье небольшую область в левой паховой области (для последующего доступа IV). Нанесите средство для удаления волос на рабочих поверхностей, подождите примерно 5 мин, и удалить волосы с куском марли.
6. Приготовительный хирургические участки с раствором повидон-йод или chlorexidine основе (мы используем только хлоргексидин). Проникнуть инцизионная сайты с 0,1 - 0,5% лидокаина подкожно.
7. Закрепите передние конечности и левой задней конечности операционной платформе с клейкой лентой, оставляя правую задней конечности бесплатно для мониторинга глубины анестезии и жизненно важных.
8. После обеспечения надлежащего глубину анестезирующего по педали крайнем случае, сделать надрез в левой паховой складки с помощью22-лезвие скальпеля. По тупым, выставить левую общую бедренную вену и получить доступ IV следующим образом:
   1. Аккуратно убрать ткань, лежащую в бедренную вену, и иглу в вену с 24 G IV. Подключите IV в короткой длины соленой заполненные трубки IV, и закрепите трубку в месте с клейкой лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура бедренной венозной катетеризации у крыс описана в других по Jespersen и коллег ^14.
   2. Подключите солевой заполненные 10 мл шприц с трубкой IV, и мягко аспирации крови, чтобы обеспечить правильное позиционирование IV.
   3. Вводите 300 - 500 МЕ нефракционированного гепарина через трубопровод IV, а затем промойте трубки с 3 - 5 мл физиологического раствора.
9. Далее, tracheotomize донора следующим образом:
   1. Сделайте срединный разрез в мягких тканях между яремной вырезки и нижней челюсти с использованием 22-лезвие скальпеля. Проникнуть капсулу щитовидной железы в средней линии, используя МетценBaum ножницы, и отдельные его доли, использующие тупым.
   2. Использование тупым, отделить ремень мышцы шеи по средней линии, чтобы разоблачить передней поверхности трахеи.
   3. Используйте изогнутые щипцы прямо рассекать по окружности плоскости вокруг трахеи. Обхватите трахеи с 4-0 шелковый галстук.
   4. Использование диафрагмы ножницами, сделать поперечный разрез в передней трахеи, примерно 5 мм ниже щитовидного хряща. Аккуратно ввести трахеи канюли (14 г IV) и закрепите его на месте с помощью 4-0 шелковый галстук.
   5. Подключите трахеи канюли с механической ИВЛ. Перенаправление потока кислорода и изофлураном через цепь вентилятора, и проветрите донора в размере и дыхательного объема прогнозируемого своим весом ^13.
10. Сделайте надрез по средней линии груди (с использованием 22-лезвие скальпеля), расширяя разрез на яремной выемкой ниже в xipisternum.
11. Пребывание в средней линии, Выполните средний стернотомию используя резак кости. Уберите края грудины с самоудерживающийся втягивающим. Введите перикарда и плевральной полости.
12. Выполните тимэктомия. Проще всего сначала тупо разделить тимус в средней линии, а затем отделить его от окружающих структур, используя комбинацию тупым и острым рассечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: происхождение внутренних грудных артерий может быть ранен, когда рассекает тимуса от вышестоящих грудных ребер. Чтобы предотвратить кровотечение, кровоостанавливающие зажимы могут быть применены перед удалением тимуса в этих точках.
13. Использование Metzenbaum ножницы и / или резкое Лауэр, рассекают пригородных вены жира от нижней полой вены (НПВ). Убедитесь, что ИВЦ является относительно свободной от жира и соединительной ткани от каво-предсердий перехода сверху, с диафрагмой книзу.
14. Используя острый Лауэр, по окружности бесплатно верхней полой вены (ВПВ) и окружить его с 4-0 шелковый галстук.
15. Далее, рассекатьосталось полой вены свободной от окружающих структур, и перевязывать его проксимально и дистально с 4-0 шелковых галстуков. Резецировать вмешиваясь часть вены, чтобы выставить левую подключичную артерию.
16. По окружности бесплатно дуги аорты суда, использующие резкое Лауэр. Применить проксимальных и дистальных хирургические зажимы в безымянной артерии, и разделить его между клипами. Оставьте левую общую сонную артерию и левой подключичной артерии ООН-обрезанную.
17. Далее, иглу ВПВ с катетером 24 G IV. Закрепите катетер с ранее размещенных 4-0 шелковый галстук.
18. Подготовка к целесообразной, но нежным урожая трансплантата.
19. Использование острыми ножницами, разделить IVC просто превосходит поверхности диафрагмы. Разделите SVC превосходит его катетеризации сайте, гарантируя, что около структуры дыхательных путей не пострадал.
20. Выключите вентилятор и отсоедините трахеи канюли. Трансекте трахеи проксимально.
21. Возьмитесь за перерезают трахеи пинцетом и удалить сердцеи легкие блочный. Это потребует нежное сцепление с резким вскрытия, как трансплантат сердца легких удаляется. Отделите трахею от основной пищевода. Не повредить нисходящей аорты, так что длинные часть его остается неизменным после сбора урожая.

2. Подготовка сердце-легкие трансплантат

ПРИМЕЧАНИЕ: время завершения этой части процедуры, помощник должен быть обезболивающее грызунов получателя и готовится к имплантации трансплантата.

1. Поместите трансплантат сердца легких на хирургическое марли с передней поверхности сердца, обращенной вниз. Использование острый рассечение, удалить остатки пищевод, избегая травм задних дыхательных путей.
2. Найдите нисходящей грудной аорты и вставьте 16 G тупым наконечником канюли. Закрепите канюли в месте с 4-0 шелковый галстук.
3. Найдите дуги аорты сосудов, и применить хирургическое клип на левой подключичной артерии. Оставьте левую сонную артерию ООН отсечение субсеквенция де-проветривание.
4. Администрирование первая доза кардиоплегии при подключении труб кардиоплегии в аорты канюли 16 G. Сонной артерии должны быть временно окклюзии щипцами, чтобы обеспечить адекватную доставку кардиоплегии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: польза от аорты канюли прилагается, что кардиоплегию можно вводить непрерывно и / или периодически, как желательно. Для прерывистого дозирования, мы обычно доставить КАРДИОПЛЕГИИ каждый 10 - 15 мин в 5 мл болюсов в течение 30 - 45 сек.
5. Использование Metzenbaum ножницы и / или резкое Лауэр, рассекают пери-аортальный жир от аорты. Убедитесь, что аорта относительно свободной от жира и соединительной ткани от левой подключичной артерии (дистальный) арки к ее катетеризации сайта.
6. Далее, выставить левую mainstem бронхов, используя острый Лауэр, и перевязывать его проксимально с 4-0 шелковый галстук. Трансекте левого бронха дистальнее лигатуры, используя диафрагмы ножницы. Выполните левый пневмонэктомии путем лигирования левой легочнойартерии и вены с 4-0 шелковых галстуков. Трансекте дистальнее лигатуры и удалить левое легкое.
7. Как указано выше, удалить все другие долей легких, за исключением правых верхних и средних долей. Избегайте ранив IVC в процессе выполнения lobectomies.
8. Подключите шланг к кардиоплегии аорты канюли и управлять непрерывный кардиоплегии в то время как получатель готовится. Поместите трансплантат сердца легких в стерильный контейнер (например, стакана).

3. Получатель Эксплуатация

1. Обезболить получатель, как в работе доноров, выше. Используйте ветеринар мазь для защиты глаз животного от сухости. Подтвердите анестезии часто по педали крайнем случае.
2. Поместите животное, как в работе доноров, на этот раз оставляя правую переднюю конечность свободное контролировать жизненно важные признаки и глубины анестезии.
3. Бритье живот от мечевидного отростка к пенису. Бритье небольшую область в левой паховой области (для последующего доступа IV). Применитьэпиляции агента в рабочих поверхностей, подождите примерно 5 мин, и удалить волосы с куском марли.
4. Приготовительный хирургические участки с повидон-йодом или chlorexidine-решения. Проникнуть инцизионная сайты с 0,1 - 0,5% лидокаина подкожно.
5. Tracheotomize и проветрите получателя, как указано выше. Кроме того, поддерживать емкость под нос конуса анестезии.
6. Ввести катетер в бедренную вену, как описано выше. Вводите 300 - 500 МЕ нефракционированного гепарина через трубопровод IV, а затем промойте трубки с 3 - 5 мл физиологического раствора.
7. Выполните лапаротомии путем срединный разрез брюшной с 22 лезвиями скальпеля от мечевидного отростка к пенису. Уберите брюшной стенки с использованием самоудерживающийся втягивающим. Далее, убрать кишечника сверху и слева крысы. Оберните их в теплой соленой, пропитанной марли.
8. Expose аорты IVC и брюшной резким рассекает через вышележащие ReТро-перитонеального жира.
9. Есть изогнутый зажим судно доступны и готовы.
10. По окружности освободить IVC и аорты проксимально и дистально и окружить их с 4-0 шелковых галстуков. Там должно быть примерно 2 - 3 см пространства между этими сайтами.
11. Осторожно применять изогнутые зажим сосудов, обеспечивая достаточную часть как IVC и аорты подвергаются выше челюстей зажима.
12. Сделать разрез в передней стенке нижней полой вены с иглой 25 G, подключенного к физиологическим заполненные 1 мл шприца. Расширьте разрез с ножницами Поттс, чтобы соответствовать длине донора IVC отверстия.
13. Удалить трансплантат сердца легких из контейнера и отключите его от кардиоплегии. Поместите трансплантата в животе получателя в оптимальном положении для выполнения венозный анастомоз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: трансплантата сердце-легкое, в конечном счете быть ориентированы наклонно немного, с вершины указывая на живот годов в левом нижнем квадранте.
14. Безопасный каблуки ног заканчивается анастомоза с 9-0 нейлона шва. Tie безопасное узел на каждом конце, в результате чего иглу, прикрепленную к длинного плеча шва, а короткий конец нити, чтобы быть привязаны к позже. Администрирование дозу кардиоплегии.
15. В управлении моде, полная половина линии шва и галстук на противоположной короткой шва руку. Администрирование дозу кардиоплегии.
16. Заполните вторую половину шва и связать его вниз. Венозный анастомоз завершена. Администрирование дозу кардиоплегии
17. Восточный трансплантата сердце-легкое с верхушки указывая сердца к живота годов в левом нижнем квадранте. Убедитесь, что венозная анастомоза не перекручен или витой.
18. Оценить длину донорской аорты, которые будут необходимы для достижения аорты получатель, поддерживая как IVC и аорты анастомозов в натяжных свободной и снимите с изломом конфигураций.
19. Разделите нисходящую аорту (дистальнее левой подключичной артерии) с ножницами ириса.
20. Сделать incisioн в передней стенке аорты реципиента с иглой 25 G, подключенного к физиологическим заполненные 1 мл шприца. Расширьте разрез с ножницами Поттс, чтобы соответствовать длине донора аорты отверстия.
21. Закрепите палец (выше аспект) донора аорты получателю аорты с помощью 9-0 нейлона шов в. Затем пропустите иглу в медиальной части аорты и завершить половину анастомоза в управлении моду.
22. В пятой аорты анастомоза, обратный ориентацию линии шва (перехода в направлении строчки), и завершить боковую половину анастомоза в управлении моду.
23. Медленно снимите IV катетер в ВПВ, и перевязывать ВПВ с хирургической клипа.
24. Де-воздух аорты путем размещения не-обрезается левой общей сонной артерии. Удерживая артерию открытой, в вертикальном положении, что позволит воздуху свободно эвакуировать.
25. Кратко открыть челюсти изогнутой зажима сосуда и позволяют сонной артерии кровотечение (dе-воздух) для 2 - 3 сек. Re-применять зажим сосудов.
26. Нанесите хирургического клип на сонной артерии. Снимите изогнутый зажим сосудов.
27. Проверьте кровотечение шовных линий. Если присутствует, нежный сжатие с хирургической марли или ремонта длиной 9-0 нейлоновой нити (в зависимости от интенсивности кровотечения).
28. Донорское сердце должно возобновить избиения в течение нескольких минут.
29. Обратите пристальное внимание на жизненно важных получателя, глубины анестезии, и управлять громкости реанимации мере необходимости.
30. В зависимости от экспериментальных конечных точек, либо закрыть живот животного, и пусть он оправиться от наркоза, или подготовить животное для сердечно-сосудистой оценке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры оценки трансплантата включают в естественных мер в зависимости от нагрузки и нагрузки зависит гемодинамики, меры в пробирке функции в Langendorff и режимы работы сердца, и (в хирургии выживания) эхокардиографии или МРТ исследования.
31. Наконец острых терминальных экспериментов, животные эвтаназии кровопусканием.

Результаты

Техника HAHLT описано выше, сугубо технический и требует пристального внимания к деталям. Таблица 1 приведены некоторые из ключевых факторов, связанных с успешным по сравнению с неудачных процедур, и могут быть использованы в качестве руководства для устранения неполадок с техн...

Обсуждение

Успех с методикой, описанной здесь будет основываться на нескольких факторах. Ключевой среди них будет обеспечение стабильности как доноров, так и получателей животных, приняв тщательного технику операции, что является безопасным и ассоциируется с минимальной кровопотерей, обеспечи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.