쥐 이소성 복부 심장 / 볼륨로드 구성에서 단일 폐 이식

요약

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

초록

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

서문

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

프로토콜

모든 동물은 보관과 전국 및 관리 및 실험 동물의 사용을위한 제도적 지침에 따라 마음에 든다고했다. 이 프로토콜에 대한 윤리 승인은 브리티시 컬럼비아의 동물 관리위원회의 대학에 의해 수여되었다. 300 사이 계량 남성, 흰쥐 - 450 g을이 프로토콜에 사용 하였다.

1. 기부자 운영

1. 3 방향 스톱 콕 장거리 정맥 내 (IV) 카테터 튜브에 연결된 원통형 플라스크에 심정지 (RT)의 약 100 mL의 유무. 중력에 의해 심정지 전달을 가능하게 약 80cm 수술 표면 위의 플라스크를 상승 스탠드를 사용합니다.
2. 적절하게 구조를 시각화하기 위해, 수술 돋보기 한 쌍 또는 해부 현미경 중 하나를 사용하십시오.
   참고 : 우리는 현재 3.4 쌍안경 운영 현미경을 사용 - 21.3X 배율.
3. 마취 실에서 기증자를 놓고 4 마취 유도 - 5 %의 이소 플루 란을.
4. 운영 플랫폼에 쥐를 전송하고 1 코 콘에 의해 마취 유지 - 2 % 이소 플루 란을. 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 적용합니다. 25 G 바늘과 미다 졸람 (2 ㎎ / ㎏) 내 복강을 관리합니다.
5. 수술 가위를 사용하여, 하악에 조류 늑골의 검상 돌기에서 기증자를 면도. (이후 IV 액세스) 왼쪽 사타구니의 작은 영역을 면도. 수술 표면에 제모 제를 적용, 약 5 분 정도 기다린 거즈 조각으로 머리를 제거합니다.
6. 포비돈 - 요오드 또는 chlorexidine 기반 솔루션과 수술 사이트를 (우리는 단지 클로르헥시딘 사용) 준비. 0.5 % 리도카인 피하 - 0.1와 절개 사이트를 침투.
7. 마취 깊이와 생체 신호의 모니터링을위한 무료 오른쪽 뒷다리를 떠나, 접착 테이프와 운영 플랫폼에 앞발과 왼쪽 뒷다리를 고정합니다.
8. 페달 핀치에 의해 적절한 마취 깊이를 확인한 후 사용 왼쪽 사타구니 주름에 절개를22 블레이드 메스. 무딘 절개하여 좌측 대퇴 정맥을 노출하고 다음과 같이 IV 액세스를 얻을 :
   1. 부드럽게 대퇴 정맥을 덮는 조직을 철회하고, 24 G 4과 정맥을 cannulate. 식염수 채워진 IV 튜브의 짧은 길이로 IV를 연결하고 접착 테이프로 장소에 튜브를 고정합니다.
      참고 : 쥐에 대퇴 정맥 삽관에 대한 절차는 제스 퍼슨 및 동료 ^(14)에 의해 다른 곳에서 설명되어 있습니다.
   2. IV의 정확한 위치를 확인하기 위해 혈액을 대기음 부드럽게 IV 튜브에 식염수로 채워진 10 ML의 주사기를 연결합니다.
   3. IV 튜브를 통해 미분 획 헤파린 500 IU, 이후 3 튜브를 세척 - - (300)를 주입 식염수 5 ㎖.
9. 다음 다음, 도너를 tracheotomize :
   1. 22 블레이드 메스를 사용하여 경정맥 노치과 하악골 사이의 부드러운 조직에서 중간 선 절개를합니다. 멧젠를 사용하여 중간 선에서 갑상선의 캡슐을 침투무딘 절개를 사용 바움 가위, 별도의 로브.
   2. 무딘 절개를 사용하여 기관의 전방 표면을 노출 정중선에 목의 근육 스트랩을 분리한다.
   3. 퉁명스럽게 기관 주위에 원주면을 해부 곡선 집게를 사용합니다. 4-0 실크 넥타이 기관을 둘러싸.
   4. 홍채 가위를 사용하여, 갑상선 연골에 약 5mm 열등, 전방 기관에 횡 절개를합니다. 조심스럽게 기관 캐뉼라 (14 G IV)를 소개하고 4-0 실크 넥타이를 사용하여 제자리에 고정합니다.
   5. 인공 호흡기에 기관 정맥을 연결합니다. 인공 호흡기 회로를 통해 산소와 이소 플루 란의 흐름을 리디렉션 및 속도와 무게 ^(13)에 의해 예측 호흡량에서 기증자를 환기 시키십시오.
10. xipisternum 아래에 경정맥 노치의 절개를 연장 (22 블레이드 메스를 사용하여) 가슴의 중간 선에 절개를합니다.
11. 중간 선에 머물고, 뼈 커터를 사용하여 중간 흉골 절개를 수행합니다. 자기 유지 권취으로 흉골의 가장자리 후퇴. 심낭 및 흉막 충치를 입력합니다.
12. 흉선을 수행합니다. 먼저 퉁명스럽게 중간 선에서 흉선을 분할하고 무딘과 날카로운 해부의 조합을 사용하여 주변의 구조에서 분리하는 가장 쉬운 방법입니다.
    참고 : 흉선 멀리 우수한 흉골 가장자리에서 해부시 내흉 동맥의 기원은 부상의 원인이 될 수 있습니다. 출혈을 방지하기 위해, 지혈 클립이 지점에서 흉선을 분리하기 전에 적용될 수있다.
13. Metzenbaum 가위를 사용 및 / 또는 날카로운 로어, 하대 정맥 (IVC)에서 멀리 지방 근교 대정맥 해부. IVC는 하방 다이어프램에, 우량 CAVO - 심방 접합에서 지방과 결합 조직의 상대적 없는지 확인합니다.
14. 날카로운 로어, 원주없는 상대 정맥 (SVC)를 사용하고 4-0 실크 넥타이를 둘러싸.
15. 다음에, 해부주변 구조에서 무료로 대정맥을 떠났고, 근위 및 원위 4-0 실크 넥타이와 그것을 결찰. 왼쪽 쇄골 하 동맥을 노출 맥의 중간 부분을 절제.
16. 원주 무료 날카로운 로어를 사용하여 대동맥 궁 혈관. 무명 동맥 근위부와 원위부 수술 클립을 적용하고, 클립 사이를 나눕니다. 왼쪽 경동맥과 좌측 쇄골 하 동맥 않은 클립을 남겨주세요.
17. 다음, 24 G IV 카테터 SVC를 cannulate. 이전에 배치 4-0 실크 넥타이와 카테터를 고정합니다.
18. 편법,하지만 부드러운 이식 수확을 준비합니다.
19. 날카로운 가위를 사용하여, 횡격막 표면에 IVC 그냥 우수한 나눕니다. 근처의기도 구조가 손상되지 않도록 보장의 삽관 사이트에 SVC 우수한 나눈다.
20. 인공 호흡기의 전원을 끄고 기관 정맥을 분리합니다. 근위 기관을 가로로 쪼개다.
21. 집게로 횡단 기관을 잡고 마음을 제거폐 KO-블록. 심장 - 폐 이식이 제거 될 때이 날카로운 해부와 부드러운 견인을 필요로 할 것이다. 기본 식도에서 기관을 분리합니다. 그것의 긴 부분은 수확 후 그대로 유지되도록, 하행 대동맥 부상을 피한다.

심장 - 폐 이식 2. 준비

참고 : 프로 시저의이 부분을 완료하는 동안, 조수는받는 사람 쥐를 마취 이식 주입을 준비해야한다.

1. 아래로 향하게 마음의 전방 표면과 수술 거즈에 심장 - 폐 이식을 놓습니다. 날카로운 해부를 사용하여 후방기도에 손상을 방지 남아있는 식도를 제거합니다.
2. 하행 흉부 대동맥을 찾아 16 G의 무딘 팁 캐뉼라를 삽입합니다. 4-0 실크 넥타이와 장소에 캐 뉼러를 고정합니다.
3. 대동맥 궁 혈관을 찾아 왼쪽 쇄골 하 동맥에 외과 용 클립을 적용합니다. 취소 잘린 왼쪽 경동맥을 남겨 서브에 대한필연 드 - 방송.
4. 16 G 대동맥 캐뉼라로 심정지 튜브를 접속함으로써 심정지의 제 투여를 관리. 경동맥은 일시적으로 심정지의 적절한 공급을 보장하기 위해 집게로 폐색해야합니다.
   주 : 부착 대동맥 캐뉼라를 갖는 이점에 원하는대로 심정지 연속적 및 / 또는 간헐적으로 투여 될 수 있다는 점이다. 45 초 - 30 5 ml의 환약 15 분 - 간헐적 투여를 들어, 우리는 일반적으로 심정지마다 10을 제공합니다.
5. Metzenbaum 가위를 사용 및 / 또는 날카로운 로어, 멀리 대동맥에서 요정 대동맥의 지방을 해부하다. 대동맥은 삽관 사이트에 왼쪽 쇄골 하 동맥 (말초 아치)에서 지방과 결합 조직의 상대적으로 자유로운 지 확인합니다.
6. 다음, 날카로운 로어를 사용하여 왼쪽 mainstem 기관지를 노출하고 4-0 실크 넥타이와 근위을 결찰. 홍채 가위를 사용하여 합자 왼쪽 기관지의 말단을 가로로 쪼개다. 왼쪽 폐를 결찰에 의해 왼쪽 폐 절제술을 수행4-0 실크 넥타이와 동맥과 정맥. 합자에 말단 횡단면과 왼쪽 폐를 제거합니다.
7. 상기와 같이, 오른쪽 상단 및 중간 엽을 제외하고 다른 모든 폐 엽을 제거합니다. 명중 폐엽을 수행하는 과정에서 부상 IVC 피한다.
8. 대동맥 정맥에 심정지 튜브를 연결하고받는 사람이 준비되는 동안 지속적으로 심정지를 관리 할 수​​ 있습니다. 멸균 용기 (예를 들어, 비커)에 심장 - 폐 이식을 놓습니다.

3.받는 사람 운영

1. 상기 도너 조작에 따라 수신자 마취. 건조에서 동물의 눈을 보호하기 위해 수의사 연고를 사용합니다. 페달 핀치에 의해 자주 마취를 확인합니다.
2. 활력 징후 및 마취 깊이를 모니터 무료 오른쪽 앞다리를 떠나, 기증자 작업에 따라이 시간을 동물을 배치합니다.
3. 조류 늑골의 검상 돌기에서 음경에 복부를 면도. (이후 IV 액세스) 왼쪽 사타구니의 작은 영역을 면도. 적용수술 표면에 에이전트를 제모, 약 5 분 정도 기다린 거즈 조각으로 머리를 제거합니다.
4. 포비돈 - 요오드 또는 chlorexidine 기반 솔루션과 수술 사이트를 준비. 0.5 % 리도카인 피하 - 0.1와 절개 사이트를 침투.
5. Tracheotomize 위의 지시에 따라 수신자를 환기 시키십시오. 또한, 코 콘 마취하에받는 사람을 유지한다.
6. 전술 한 바와 같이 대퇴 정맥에 카테터를 소개한다. IV 튜브를 통해 미분 획 헤파린 500 IU, 이후 3 튜브를 세척 - - (300)를 주입 식염수 5 ㎖.
7. 음경에 조류 늑골의 검상 돌기에서 22 블레이드 메스로 중간 선 복부 절개를하여 개복술을 수행합니다. 자체 유지 견인기를 사용하여 복벽을 후퇴. 다음으로, 우량와 쥐의 왼쪽에 창자를 철회. 따뜻한 식염수를 적신 거즈를 감싸.
8. 크게 상부 재를 통해 해부하여 IVC 및 복부 대동맥을 노출TRO-복막 지방.
9. 곡선 용기 클램프가 가능하고 준비합니다.
10. 원주 근위 및 원위 하대 정맥과 대동맥를 해제하고 4-0 실크 넥타이로 둘러싸. 이 사이트 사이의 공간의 3 CM - 약 2가 있어야합니다.
11. 조심스럽게 하대 정맥과 대동맥 모두의 충분한 부분이 클램프의 턱 위에 노출되는 것을 보장, 곡선 용기 클램프를 적용합니다.
12. 식염수로 채워진 1 ML의 주사기에 연결된 25 G 바늘 IVC의 앞쪽 벽에 절개를합니다. 기증자 IVC 구멍의 길이에 맞게 포츠 가위로 절개를 확장 할 수 있습니다.
13. 컨테이너에서 심장 - 폐 이식을 제거하고는 심정지에서 분리합니다. 정맥 문합을 수행 할 최적의 위치에받는 사람의 복부에 이식을 놓습니다.
    참고 : 심장 - 폐 이식이 궁극적으로 복부의 방향으로 정점을 가리키는, 약간 비스듬하게 지향한다 낮은 사분면을 떠났습니다.
14. 발 뒤꿈치를 고정발가락은 9-0 나일론 봉합사와 봉합의 끝납니다. 봉합의 긴 팔에 부착 된 바늘, 이후​​에 연결되는 봉합사의 짧은 끝을 떠나, 각 끝 부분에 안전한 매듭을 묶어. 심정지의 복용량을 관리합니다.
15. 패션을 실행에, 반대 짧은 봉합 팔에 봉합 라인과 넥타이의 완전한 절반. 심정지의 복용량을 관리합니다.
16. 봉합 라인의 나머지 절반을 완료하고 넥타이. 정맥 문합이 완료됩니다. 심정지의 복용량을 관리합니다
17. 동양은 복부의의를 향한 마음의 정점을 가리키는 심장 - 폐 이식은 하복부를 떠났다. 정맥 문합이 꼬거나 비틀어되지 않았는지 확인합니다.
18. 긴장 - 무료 및 취소 꼬여 구성에서 IVC와 대동맥 문합을 모두 유지,받는 사람 대동맥에 도달해야합니다 기증자의 대동맥의 길이를 평가합니다.
19. 홍채 가위 (왼쪽 쇄골 하 동맥 원위부) 하행 대동맥을 나눈다.
20. incisio 확인N 식염수로 채워진 1 ML의 주사기에 연결된 25 G 바늘받는 사람 대동맥의 앞쪽 벽에. 도너 대동맥 오리피스의 길이와 일치하도록 포츠 가위로 절개 확장.
21. 9-0 나일론 봉합사를 이용하여 대동맥받는 사람에게 기증자의 대동맥의 발가락 (우수한 측면을) 앵커. 이어서, 대동맥의 중간 형태에 바늘을 통과 패션에서 실행 문합의 절반을 완성.
22. 대동맥 문합 뒤꿈치에서 봉합 라인 (스티치의 방향 전환)의 방향을 반대로하고, 패션에서 실행 문합의 좌우 절반을 완료.
23. 천천히 SVC의 IV 카테터를 제거하고 수술 클립 SVC를 결찰.
24. 드 공기 않은 잘린 왼쪽 경동맥의 위치에 의해 대동맥. 공기가 자유롭게 대피 할 수 있도록 수직 위치에서 열기 동맥을 잡으십시오.
25. 간단히 D 곡선 용기 클램프의 턱을 열고 (경동맥은 피 할 수 있도록전자 공기) 2 - 3 초. 선박 클램프를 다시 적용 할 수 있습니다.
26. 경동맥을 외과 용 클립을 적용합니다. 곡선 용기 클램프를 제거합니다.
27. 봉합 라인에서 출혈이 있는지 확인합니다. 존재하는 경우, 9-0 나일론 봉합사 (출혈의 정도에 따라 다름)의 길이와 수술 거즈 또는 수리와 부드러운 압축을 적용합니다.
28. 기증자 심장 분 이내에 치고 다시 시작해야합니다.
29. 받는 사람의 생체 신호, 마취의 깊이에주의하고 필요에 따라 볼륨 소생술을 관리 할 수​​ 있습니다.
30. 중, 실험 엔드 포인트에 따라 동물의 복부를 닫고 마취에서 회복하자, 또는 심장 혈관 평가를 위해 동물을 준비합니다.
    참고 : 이식 평가의 예는 부하에 따라 부하 독립적 인 혈역학의 생체 측정, 시험 관내 랑겐 돌프 함수의 측정 및 작업 심장 모드, (생존 수술) 심 초음파 나 MRI 조사에 포함.
31. 에서급성 터미널 실험의 끝, 동물 방혈에 의해 안락사된다.

결과

위에서 설명한 HAHLT 기술은 고도의 기술과 세부 사항입니다. 표에 세심한주의를 필요로 한 하이라이트 실패 절차 대 성공과 관련된 중요한 요소의 일부, 그리고 기술적 인 문제를 해결하기위한 가이드로 사용할 수 있습니다.

받는 사람 대동맥이 클램핑 해제 한 후, 이식 관상 동맥은 산소가 혈액으로 채우기 위해 볼 수 있어야합니다. 따라서, 심근는 ...

토론

여기에 설명 된 기술과 성공은 여러 가지 요인에 입각한다. 그 중 주요 균일 이식 냉각 완전한 심정지 체포, 총 허혈 시간을 최소화을 보장, 안전하고 최소한의 혈액 손실과 관련된 세심한 수술 기법을 채택, 모두 기증자와받는 사람 동물의 안정성을 보장하고, 적절하게 탈 방송 이식을 할 것이다. 위의 인정으로, 기술의 기술적 인 복잡성은 최고 제한 사항입니다.

우리는 여?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.