Rat Heterotopic abdominale Coeur / Transplantation pulmonaire simple dans une configuration de volume chargé

Résumé

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

Résumé

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

Introduction

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

Protocole

Tous les animaux ont été logés et soignés conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire national et. L'approbation éthique pour ce protocole a été accordée par l'Université du Comité de protection des animaux de la Colombie-Britannique. Mâles, les rats Sprague-Dawley pesant entre 300 à 450 g ont été utilisés pour ce protocole.

Opération 1. des donateurs

1. Avoir environ 100 ml de cardioplégie (RT) dans un ballon cylindrique reliée à longue intraveineuse (IV) tube de cathéter par un robinet à 3 voies. Utilisez un support pour élever le ballon à environ 80 cm au-dessus de la surface active, permettant la livraison de cardioplégie par gravité.
2. Pour visualiser correctement les structures, utiliser une paire de loupes chirurgicales ou d'un microscope à dissection.
   NOTE: Nous utilisons actuellement un microscope opératoire binoculaire avec 3.4 - 21.3X grossissement.
3. Placez le donateur dans une chambre d'anesthésie et induire une anesthésie avec 4 - 5% d'isoflurane.
4. Transférez le rat à une plate-forme d'exploitation et maintenir une anesthésie par le nez cône avec 1 - 2% d'isoflurane. Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse. Administrer midazolam (2 mg / kg) par voie intrapéritonéale avec une aiguille 25 G.
5. L'aide de tondeuses chirurgicales, de se raser le donneur de xiphisternum à la mandibule. Raser une petite région de l'aine gauche (pour un accès ultérieur de IV). Appliquez un agent d'épilation les surfaces actives, attendez environ 5 min, et enlever les poils avec un morceau de gaze.
6. Prep les sites chirurgicaux avec une solution à base de chlorhexidine povidone-iode ou (nous utilisons seulement la chlorhexidine). Infiltrez sites incisionnelles avec 0,1 à 0,5% de lidocaïne sous-cutanée.
7. Fixez les membres antérieurs et postérieurs gauche à la plate-forme d'exploitation avec du ruban adhésif, laissant le droit postérieur gratuit pour le suivi de profondeur de l'anesthésie et les signes vitaux.
8. Après avoir vérifié la profondeur de l'anesthésie appropriée par la pédale pincée, faire une incision dans l'aine pli gauche en utilisantun scalpel 22-lame. Par dissection, exposer la veine fémorale commune gauche et d'obtenir un accès IV comme suit:
   1. Rétracter délicatement le tissu recouvrant la veine fémorale, et cathétériser la veine avec un 24 G IV. Connectez le IV à une courte longueur de tubulure IV rempli de solution saline, et fixer le tube en place avec du ruban adhésif.
      NOTE: La procédure de cathétérisme veineux fémoral chez le rat est décrit ailleurs par Jespersen et ses collègues ^14.
   2. Raccorder une seringue de 10 ml rempli de solution saline pour le tuyau IV, et aspirer le sang doucement pour assurer un positionnement correct de l'IV.
   3. Injecter 300 à 500 UI d'héparine non fractionnée à travers le tuyau IV, et ensuite rincer le tube avec 3-5 ml d'une solution saline.
9. Ensuite, tracheotomize le donneur comme suit:
   1. Faire une incision médiane dans les tissus mous entre la veine jugulaire et la mandibule à l'aide d'un scalpel 22-lame. Pénétrer dans la capsule de la glande thyroïde dans la ligne médiane en utilisant Metzenciseaux Baum, et ses lobes distincts utilisant dissection.
   2. Utilisation de dissection émoussé, séparer les muscles de la sangle du cou sur la ligne médiane pour exposer la surface antérieure de la trachée.
   3. Utilisez une pince à disséquer courbes carrément un plan circonférentiel autour de la trachée. Entourez la trachée avec une cravate de soie 4-0.
   4. Utilisation de ciseaux à iris, faire une incision transversale dans la trachée-artère antérieure, inférieure à environ 5 mm du cartilage thyroïde. Introduire doucement la canule trachéale (un 14 G IV) et le fixer en place à l'aide de la cravate de soie 4-0.
   5. Raccorder la canule trachéale à un ventilateur mécanique. Rediriger le flux d'oxygène et de l'isoflurane à travers le circuit de ventilation, et ventiler le donateur à un rythme et le volume de marée prédit par son poids ^13.
10. Faire une incision sur la ligne médiane de la poitrine (en utilisant un scalpel à lame 22), prolongeant l'incision à l'encoche jugulaire au-dessous de la xipisternum.
11. Rester dans la ligne médiane, Effectuez une sternotomie médiane à l'aide d'un coupe-os. Rétracter les bords du sternum avec un écarteur autostatique. Entrez le péricarde et cavités pleurales.
12. Effectuez une thymectomie. Il est plus facile de diviser premier carrément le thymus dans la ligne médiane, puis séparer de structures environnantes utilisant une combinaison de dissection et nette.
    NOTE: L'origine des artères thoraciques internes peut être blessé en disséquant le thymus à partir des bords supérieurs du sternum. Pour prévenir les saignements, pinces hémostatiques peuvent être appliquées avant de retirer le thymus à ces points.
13. Avec des ciseaux de Metzenbaum et / ou une forte Lauer, disséquer péri-caval graisse loin de la veine cave inférieure (VCI). Assurez-vous que l'IVC est relativement exempt de graisse et du tissu conjonctif de la jonction de cavo-auriculaire supérieurement, au diaphragme en bas.
14. Utiliser une forte Lauer, la circonférence gratuitement la veine cave supérieure (SVC) et l'encercler avec une cravate de soie 4-0.
15. Ensuite, disséquer leveine cave laissé libre de structures environnantes, et ligaturer proximale et distale avec 4-0 cravates en soie. Réséquer la partie intermédiaire de cava pour exposer l'artère sous-clavière gauche.
16. Circonférence gratuitement les vaisseaux de l'arc aortique utilisant une forte Lauer. Appliquer agrafes chirurgicales proximale et distale de l'artère iliaque, et de le diviser entre les clips. Laissez l'artère carotide commune gauche et l'artère sous-clavière gauche non coupée.
17. Ensuite, canuler SVC avec un cathéter 24 G IV. Fixez le cathéter avec le 4-0 cravate de soie placé précédemment.
18. Préparez-vous à une récolte de greffe expédient, mais en douceur.
19. Avec des ciseaux pointus, diviser la VCI juste supérieure à la surface diaphragmatique. Divisez la SVC supérieure à son site de canulation, veiller à ce que les structures des voies respiratoires à proximité ne sont pas blessés.
20. Éteignez le ventilateur et débranchez la canule trachéale. Transect la trachée proximale.
21. Saisir la trachée sectionnée avec une pince, et retirer le coeuret les poumons en bloc. Cela nécessitera une légère traction avec dissection fine que la greffe cœur-poumon est enlevée. Séparer la trachée de l'oesophage sous-jacent. Éviter de blesser l'aorte descendante, de sorte qu'une longue portion de celui-ci reste intact après la récolte.

2. Préparation du Coeur-poumon Graft

REMARQUE: tout en complétant cette partie de la procédure, un assistant devrait être anesthésier le rongeur bénéficiaire et préparer implantation du greffon.

1. Passer la greffe cœur-poumon sur gaze chirurgicale avec la face antérieure du cœur vers le bas. Utilisation de dissection, enlever toute oesophage résiduelle, éviter les blessures aux voies aériennes postérieures.
2. Situer l'aorte thoracique descendante et insérer un 16 G bout arrondi canule. Fixez la canule en place avec une cravate de soie 4-0.
3. Repérez les navires de l'arc aortique, et appliquer une pince chirurgicale à l'artère sous-clavière gauche. Laissez l'artère carotide gauche non taillés pour la sousséquent de-diffusion.
4. Administrer la première dose de cardioplégie en raccordant la tubulure de cardioplégie à la canule aortique 16 G. L'artère carotide doit être obturée temporairement avec une pince pour assurer la livraison adéquate de cardioplégie.
   NOTE: Un avantage d'avoir la canule aortique attaché est que cardioplégie peut être administré en continu et / ou par intermittence comme souhaité. Pour le dosage intermittent, nous livrons généralement cardioplégie tous les 10 - 15 min dans 5 ml bolus sur 30 - 45 sec.
5. Avec des ciseaux de Metzenbaum et / ou une forte Lauer, disséquer la graisse péri-aortique loin de l'aorte. Assurez-vous que l'aorte est relativement exempt de graisse et de tissu conjonctif à partir de l'artère sous-clavière gauche (arche distale) de son site de canulation.
6. Ensuite, exposer la bronche souche gauche en utilisant une forte Lauer et ligaturer proximale avec une cravate de soie 4-0. Transect la bronche distale gauche à la ligature en utilisant l'iris ciseaux. Effectuez une pneumonectomie gauche en ligaturant pulmonaire gaucheartère et la veine avec 4-0 cravates en soie. Transect distale de la ligature et retirer le poumon gauche.
7. Comme ci-dessus, retirez tous les autres lobes pulmonaires à l'exception des lobes supérieur et moyen droite. Éviter de blesser l'IVC dans le processus d'exécution lobectomies.
8. Connectez le tube de cardioplégie à la canule aortique et administrer cardioplégie continue alors que le destinataire est en cours de préparation. Placez la greffe cœur-poumon dans un récipient stérile (par exemple, un bécher).

3. bénéficiaire d'exploitation

1. Anesthésier le destinataire que par l'opération de donateurs, ci-dessus. Utilisez vétérinaire pommade pour protéger les yeux de l'animal de la sécheresse. Confirmez anesthésie fréquemment par la pédale pincée.
2. Placez l'animal comme par l'opération des donateurs, laissant cette fois le droit des membres antérieurs libre de surveiller les signes vitaux et profondeur de l'anesthésie.
3. Raser l'abdomen de xiphisternum à pénis. Raser une petite région de l'aine gauche (pour un accès ultérieur de IV). Appliquer uneAgent d'épilation les surfaces actives, attendez environ 5 min, et enlever les poils avec un morceau de gaze.
4. Prep les sites chirurgicaux avec une povidone-iode ou une solution à base de chlorhexidine. Infiltrez sites incisionnelles avec 0,1 à 0,5% de lidocaïne sous-cutanée.
5. Tracheotomize et ventiler le destinataire comme indiqué ci-dessus. Alternativement, de maintenir le destinataire sous le nez cône anesthésie.
6. L'introduction d'un cathéter dans la veine fémorale comme décrit ci-dessus. Injecter 300 à 500 UI d'héparine non fractionnée à travers le tuyau IV, et ensuite rincer le tube avec 3-5 ml d'une solution saline.
7. Effectuez une laparotomie en faisant une incision abdominale médiane avec un scalpel 22-lame xiphisternum à pénis. Rétracter la paroi abdominale à l'aide d'un écarteur autostatique. Ensuite, retirer les entrailles en haut et à gauche du rat. Enveloppez-les dans un endroit chaud, de la gaze imbibée de solution saline.
8. Exposer l'aorte abdominale IVC et en disséquant fortement à travers la re sus-jacentetro-péritonéale graisse.
9. Avoir une pince de vaisseau courbe disponible et prêt.
10. Circonférence libérer la VCI et l'aorte proximale et distale et les encercler avec 4-0 cravates en soie. Il devrait y avoir environ 2 - 3 cm d'espace entre ces sites.
11. Appliquer soigneusement la pince de vaisseau courbe, veiller à ce qu'une part suffisante des deux IVC et l'aorte sont exposés ci-dessus les mâchoires de la pince.
12. Faire une incision dans la paroi antérieure de la veine cave inférieure avec une aiguille 25 G raccordée à une seringue de 1 ml rempli de solution saline. Elargir l'incision avec des ciseaux de Potts pour correspondre à la longueur du donneur IVC orifice.
13. Retirer la greffe cœur-poumon de son récipient et débrancher de cardioplégie. Placer le greffon dans l'abdomen du destinataire dans une position optimale pour effectuer l'anastomose veineuse.
    NOTE: La greffe cœur-poumon sera finalement orienté légèrement en oblique, avec le sommet pointant vers l'abdomen de quadrant inférieur gauche.
14. Fixez le talonet bouts de chaussures de l'anastomose avec 9-0 suture en nylon. Faire un nœud sécurisé à chaque extrémité, laissant l'aiguille fixée à un long bras de suture, et une courte fin de suture d'être lié à plus tard. Administrer une dose de cardioplégie.
15. En exécutant la mode, complète la moitié de la ligne de suture et une cravate au bras opposées de suture courte. Administrer une dose de cardioplégie.
16. Remplissez l'autre moitié de la ligne de suture et l'attacher vers le bas. L'anastomose veineuse est terminée. Administrer une dose de cardioplégie
17. Orientez la greffe cœur-poumon avec sommet pointant du cœur vers l'abdomen de quadrant inférieur gauche. Assurez-vous que l'anastomose veineuse ne soit pas plié ou tordu.
18. Évaluer la longueur de l'aorte des donateurs qui sera nécessaire pour atteindre l'aorte bénéficiaire, le maintien à la fois IVC et anastomoses aortiques dans des configurations sans tension et non vrillées.
19. Diviser l'aorte descendante (distal par rapport au artère sous-clavière gauche) avec une paire de ciseaux à iris.
20. Faire une incision, dans la paroi antérieure de l'aorte de destinataire avec une aiguille 25 G raccordée à une seringue de 1 ml rempli de solution saline. Elargir l'incision avec des ciseaux de Potts pour correspondre à la longueur de l'orifice aortique de donneur.
21. Ancrer la pointe (de face supérieure) de l'aorte donneur au receveur aorte en utilisant une suture 9-0 en nylon. Ensuite, passer l'aiguille à la face médiale de l'aorte et remplir la moitié de l'anastomose dans la gestion de la mode.
22. Au talon de l'anastomose aortique, inverser l'orientation de la ligne de suture (une transition dans le sens de la couture), et compléter la moitié latérale de l'anastomose dans la gestion de la mode.
23. Lentement retirer le cathéter IV dans le SVC, et ligaturer le SVC avec une pince chirurgicale.
24. De l'air de l'aorte en localisant l'artère carotide commune non écrêté gauche. Maintenez l'artère ouverte, dans une position verticale qui permet à l'air d'être évacué librement.
25. Brièvement ouvrir les mâchoires de la pince du vaisseau courbé et permettre à l'artère carotide à saigner (de-air) pour les 2 - 3 sec. Re-appliquer la pince de navire.
26. Appliquer une pince chirurgicale à l'artère carotide. Retirer la pince de vaisseau courbe.
27. Vérifiez saignements au niveau des lignes de suture. Le cas échéant, appliquer une compression douce avec de la gaze chirurgicale ou la réparation d'une longueur de 9-0 suture en nylon (selon la gravité de l'hémorragie).
28. Le cœur d'un donneur devrait reprendre en battant en quelques minutes.
29. Portez une attention particulière aux signes vitaux du destinataire, la profondeur de l'anesthésie, de réanimation et administrer le volume au besoin.
30. Selon les paramètres expérimentaux, soit fermer l'abdomen de l'animal et laissez-le se remettre de l'anesthésie, ou de préparer l'animal pour l'évaluation cardiovasculaire.
    NOTE: Exemples d'évaluation de greffe comprennent des mesures in vivo de l'hémodynamique fonction de la charge et indépendant de la charge, des mesures in vitro de la fonction dans Langendorff et les modes de travail, et cardiaques (en chirurgie de survie) ou échocardiographiques enquêtes IRM.
31. Aufin des expériences terminaux aiguës, les animaux sont euthanasiés par exsanguination.

Résultats

La technique de HAHLT décrit ci-dessus est très technique et nécessite une attention particulière aux détails. Tableau 1 met en évidence certains des principaux facteurs associés à la réussite par rapport procédures infructueuses, et peuvent être utilisées comme un guide pour le dépannage de difficultés techniques.

Après l'aorte du destinataire est desserré, les artères coronaires greffés doivent être considérées à se remplir de sang oxygéné. En c...

Discussion

Le succès de la technique décrite ici est fondée sur plusieurs facteurs. Clé d'entre eux sera d'assurer la stabilité des deux animaux donateurs et bénéficiaires, en adoptant la technique opératoire méticuleuse qui est sûr et associé avec un minimum de perte de sang, assurant un arrêt cardioplégique complète avec refroidissement de greffe uniforme, minimisant le temps ischémique totale, et suffisamment dé-aérer la greffe. Comme l'a reconnu ci-dessus, la complexité technique de la technique e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.