Rat heterotópico abdominal coração / pulmão Transplante Single-carregado em uma configuração-Volume

Resumo

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

Resumo

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

Introdução

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

Protocolo

Todos os animais foram alojados e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e Nacional. Aprovação ética para este protocolo foi concedido pela Universidade do Comitê Animal Care da British Columbia. Macho, ratos Sprague-Dawley machos pesando entre 300-450 g foram usados ​​para este protocolo.

1. Doador de Operação

1. Possui cerca de 100 ml de solução cardioplégica (RT) em um balão cilíndrico ligado ao longo intravenosa (IV) por um tubo de cateter torneira de 3 vias. Use um suporte para elevar o balão a cerca de 80 centímetros acima da superfície de trabalho, permitindo a entrega cardioplegia por gravidade.
2. Para visualizar estruturas adequadamente, use um par de lupas cirúrgicas ou um microscópio de dissecação.
   NOTA: Atualmente usamos um microscópio cirúrgico binocular com 3.4 - ampliação 21.3X.
3. Coloque o doador em uma câmara de anestésico e induzir a anestesia com 4-5% de isoflurano.
4. Transferir o rato a uma plataforma de operação e manutenção da anestesia através do nariz-cone com 1-2% de isoflurano. Aplicar veterinário pomada para os olhos do animal para prevenir o ressecamento. Administrar o midazolam (2 mg / kg), intraperitonealmente com uma agulha G 25.
5. Usando cortadores cirúrgicos, raspar o doador do processo xifóide do esterno a mandíbula. Raspar uma pequena região da virilha esquerda (para acesso subsequente IV). Aplicar um agente para depilar as superfícies operativas, esperar cerca de 5 min, e remover o cabelo com um pedaço de gaze.
6. Prepare os locais cirúrgicos com uma solução baseada em clorexidina iodopovidona ou (nós usamos somente clorexidina). Infiltrar nos sites incisional com 0,1-0,5% de lidocaína por via subcutânea.
7. Obtenha os membros dianteiros e membro esquerdo para a plataforma operacional com fita adesiva, deixando o membro posterior direito livre para monitoramento de profundidade anestésica e os sinais vitais.
8. Depois de assegurar a profundidade da anestesia adequada por pedal pitada, fazer uma incisão no sulco virilha esquerda usandoum bisturi 22-lâmina. Por dissecção romba, expor a veia femoral comum esquerda e obter acesso IV como se segue:
   1. Suavemente retrair o tecido que cobre o veia femoral, e canular a veia com um 24 g IV. Conecte o IV para um curto período de IV tubulação cheio de solução salina, e fixar o tubo no lugar com fita adesiva.
      NOTA: O procedimento de punção venosa femoral em ratos é descrito em outros lugares por Jespersen e colegas ^14.
   2. Ligar uma seringa de 10 ml cheio de solução salina para a tubagem IV, e suavemente aspirar sangue para garantir o posicionamento correcto do IV.
   3. Injectar 300-500 UI de heparina não fraccionada através da tubagem IV, e, subsequentemente, lavar a tubagem com 3-5 ml de solução salina.
9. Em seguida, o doador tracheotomize como se segue:
   1. Adicione uma incisão na linha média em tecidos moles entre o entalhe jugular e da mandíbula, utilizando um bisturi 22-lâmina. Penetrar a cápsula da glândula tireóide na linha média usando Metzentesoura Baum, e separados seus lóbulos usando dissecção romba.
   2. Utilizando uma dissecção romba, separar os músculos do pescoço cinta na linha média para expor a superfície anterior da traqueia.
   3. Use uma pinça curva sem rodeios para dissecar um plano circunferencial em torno da traquéia. Cercar a traqueia com um laço de seda 4-0.
   4. Usando uma tesoura de íris, fazer uma incisão transversal na traquéia anterior, aproximadamente 5 mm inferior à cartilagem tireóide. Suavemente introduzir a cânula traqueal (a 14 G IV) e fixá-lo no lugar usando o laço de seda 4-0.
   5. Conecte a cânula traqueal a um ventilador mecânico. Redirecionar o fluxo de oxigênio e isoflurano através do circuito do ventilador, e ventilar o doador a um ritmo e volume corrente previsto pelo seu peso ^13.
10. Realizar uma incisão na linha média do tórax (usando um bisturi 22-lâmina), estendendo-se a incisão na incisura jugular para um valor inferior a xipisternum.
11. Mantendo-se na linha média, Executar uma esternotomia mediana usando um cortador de osso. Retrair as bordas do esterno com uma válvula de auto-retenção. Digite o pericárdio e cavidade pleural.
12. Executar uma thymectomy. É mais fácil de dividir primeiro sem rodeios o timo na linha mediana, e então separá-lo de estruturas adjacentes usando uma combinação de dissecção brusca e precisa.
    NOTA: A origem das artérias torácicas internas pode ser lesado quando dissecando o timo longe das bordas do esterno superiores. Para prevenir o sangramento, clipes hemostáticos pode ser aplicado antes de retirar o timo nesses pontos.
13. Com uma tesoura Metzenbaum e / ou um Lauer afiada, dissecar peri-cava gordura longe da veia cava inferior (VCI). Certifique-se de que a VCI é relativamente livre de gordura e tecido conjuntivo a partir da junção cavo-atrial superiormente, para o diafragma inferiormente.
14. Usando um Lauer afiada, livre circunferencial da veia cava superior (SVC) e cercar-lo com um laço de seda 4-0.
15. Em seguida, dissecar odeixou veia cava livre de estruturas adjacentes, e ligar-lo proximal e distal com 4-0 gravatas de seda. Ressecar a parte interveniente da cava para expor a artéria subclávia esquerda.
16. Circunferencial livre os vasos do arco aórtico usando um Lauer afiado. Aplicar clips cirúrgicos proximal e distal à artéria inominada, e dividi-lo entre os clipes. Deixe a artéria carótida comum esquerda e un-cortado artéria subclávia esquerda.
17. Em seguida, canular a SVC com um cateter 24 G IV. Fixe o cateter com o anteriormente colocado 4-0 gravata de seda.
18. Prepare-se para uma colheita do enxerto expediente, mas suave.
19. Usando uma tesoura afiada, dividir o IVC apenas superior à superfície diafragmática. Divida o SVC superior ao seu sítio de punção, assegurando que as estruturas das vias aéreas próximas não estão feridos.
20. Desligue o ventilador e retire a cânula traqueal. Transecto a traqueia proximal.
21. Segure a traquéia seccionado com uma pinça, e remover o coraçãoe pulmões em blocos. Isso vai exigir tração suave com dissecção afiada como o enxerto de coração-pulmão é removido. Separa-se a traqueia a partir do esófago subjacente. Evitar ferir a aorta descendente, de modo que uma grande parte dele permanece intacto após a colheita.

2. Preparação do Coração-pulmão Graft

NOTA: ao completar esta parte do procedimento, o assistente, deve ser anestesiar o roedor destinatário e se preparando para a implantação do enxerto.

1. Inserir o enxerto de coração-pulmão de gaze cirúrgica com a superfície anterior do coração voltado para baixo. Usando dissecção afiada, remover qualquer esôfago residual, evitando prejuízo para as vias respiratórias posteriores.
2. Localize a aorta torácica descendente e inserir um 16 G de ponta romba cânula. Segurar a cânula no lugar com uma gravata de seda 4-0.
3. Localize os vasos do arco aórtico, e aplicar um grampo cirúrgico da artéria subclávia esquerda. Deixe a artéria carótida esquerda un-cortado para a subsequent de-aeração.
4. Administrar a primeira dose de cardioplegia, ligando o tubo de cardioplegia à cânula aórtica 16 L. A artéria carótida deve ser temporariamente fechada com uma pinça para garantir a entrega adequada de cardioplegia.
   NOTA: Uma vantagem de ter a cânula aórtica ligada é que cardioplegia pode ser administrada de forma contínua e / ou intermitente, como desejado. Para dosagem intermitente, que normalmente entregar cardioplegia cada 10 - 15 minutos em 5 ml bolus sobre 30 - 45 seg.
5. Com uma tesoura Metzenbaum e / ou um Lauer afiada, dissecar a gordura peri-aórtico longe da aorta. Certifique-se de que a aorta é relativamente livre de gordura e tecido conjuntivo a partir da artéria subclávia esquerda (arco distal) ao seu sítio de punção.
6. Em seguida, expor o brônquio fonte esquerdo usando um Lauer afiada, e ligar-lo proximamente com um laço de seda 4-0. Transecto a distal brônquio esquerdo para a ligadura da íris usando uma tesoura. Executar uma pneumonectomia esquerda ligando o pulmonar esquerdaartéria e veia com 4-0 gravatas de seda. Transecto distal à ligadura e remover o pulmão esquerdo.
7. Como acima, remover todos os outros lobos pulmonares com exceção dos lobos superior e médio direito. Evitar ferir o IVC no processo de realização de lobectomia.
8. Ligue a tubagem de cardioplegia à cânula aórtica e administrar cardioplegia contínua, enquanto o destinatário está sendo preparado. Inserir o enxerto de coração-pulmão, num recipiente estéril (por exemplo, um copo).

3. Destinatário Operação

1. Anestesiar destinatário de acordo com a operação de dador, acima. Use veterinário pomada para proteger os olhos do animal de secura. Confirme anestesia com freqüência por pedal pitada.
2. Posicione o animal de acordo com a operação doador, desta vez deixando o membro anterior direito livre para monitorar os sinais vitais e profundidade anestésica.
3. Raspar o abdômen do processo xifóide do esterno ao pênis. Raspar uma pequena região da virilha esquerda (para acesso subsequente IV). Aplique umaagente para depilar as superfícies operativas, esperar cerca de 5 min, e remover o cabelo com um pedaço de gaze.
4. Prepare os locais cirúrgicos com um iodopovidona ou solução baseada clorexidina. Infiltrar nos sites incisional com 0,1-0,5% de lidocaína por via subcutânea.
5. Tracheotomize e ventilar o destinatário como indicado acima. Como alternativa, manter o destinatário sob anestesia nariz-cone.
6. Introduzir um cateter na veia femoral como descrito acima. Injectar 300-500 UI de heparina não fraccionada através da tubagem IV, e, subsequentemente, lavar a tubagem com 3-5 ml de solução salina.
7. Executar uma laparotomia fazendo uma incisão na linha média abdominal com um bisturi 22-blade de processo xifóide do esterno ao pênis. Retrair a parede abdominal utilizando um afastador auto-retenção. Em seguida, retirar as entranhas superiormente e para o lado esquerdo do rato. Envolvê-los em, gaze embebida com solução salina quente.
8. Expor a aorta abdominal IVC e por acentuadamente dissecando através da re sobrepostagordura tro-peritoneal.
9. Ter uma braçadeira navio curvo disponível e pronto.
10. Circunferencial libertar a VCI e aorta proximal e distal e cercar-los com laços de seda 4-0. Não deve ser de aproximadamente 2-3 cm de espaço entre estes sítios.
11. Cuidadosamente aplicar o grampo vaso curvo, assegurando que uma porção suficiente de ambos VCI e aorta são expostos por cima das maxilas da peça de aperto.
12. Realizar uma incisão na parede anterior da VCI com uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 ml cheio de solução salina. Estender a incisão com tesoura de Potts para corresponder ao comprimento do dador VCI orifício.
13. Remova o enxerto de coração-pulmão de seu recipiente e desconecte-o cardioplegia. Coloque o enxerto no abdômen do destinatário em uma posição ideal para realizar a anastomose venosa.
    NOTA: O enxerto de coração-pulmão acabará por ser orientada ligeiramente oblíqua, com o ápice apontando para as abdômen do quadrante inferior esquerdo.
14. Prenda o calcanhare dedo do pé termina da anastomose com 9-0 nylon de sutura. Dê um nó segura em cada extremidade, deixando a agulha ligada a um braço longo do fio de sutura e uma extremidade curta do fio de sutura para ser ligada a mais tarde. Administrar uma dose de cardioplegia.
15. Na gestão de moda, completa a metade da linha de sutura e gravata para o braço adversária sutura curto. Administrar uma dose de cardioplegia.
16. Complete a outra metade da linha de sutura e amarrá-lo para baixo. A anastomose venosa é completa. Administrar uma dose de cardioplegia
17. Orient o enxerto de coração-pulmão com apontando o ápice do coração em direção aos abdômen do quadrante inferior esquerdo. Certifique-se de que a anastomose venosa não está dobrada ou torcida.
18. Avaliar o comprimento da aorta do doador, que será necessária para alcançar a aorta do receptor, mantendo tanto IVC e anastomose da aorta em configurações livre de tensão e desdobrado.
19. Divida a aorta descendente (distal à artéria subclávia esquerda) com uma tesoura de íris.
20. Realizar uma incision na parede anterior da aorta do receptor com uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 ml cheio de solução salina. Estender a incisão com tesoura de Potts para corresponder ao comprimento do orifício aórtico dador.
21. Ancorar o dedo do pé (aspecto superior) da aorta dador até ao receptor aorta utilizando uma sutura 9-0 nylon. Em seguida, passe a agulha para a face medial da aorta e completar metade da anastomose na execução de moda.
22. No calcanhar da anastomose da aorta, inverter a orientação da linha de sutura (uma transição na direcção de costura), e concluir a metade lateral da anastomose no funcionamento da forma.
23. Lentamente remover o cateter IV na SVC, e ligar o SVC com um grampo cirúrgico.
24. De-ar da aorta, localizando a artéria carótida comum esquerda un-cortado. Segurar a artéria aberta, em posição vertical, que vai permitir que o ar a ser evacuado livremente.
25. Resumidamente abrir as maxilas do grampo vaso curvo e permitir que a artéria carótida para sangrar (de-air) para 2-3 sec. Reaplicar o grampo navio.
26. Aplique um grampo cirúrgico à artéria carótida. Remover o grampo vaso curvo.
27. Verifique se há sangramento nas linhas de sutura. Se estiver presente, aplicar compressão suave com gaze cirúrgica ou de reparação com um comprimento de 9-0 sutura de nylon (dependendo da gravidade do sangramento).
28. O coração do doador deve retomar batendo em poucos minutos.
29. Preste atenção aos sinais vitais do destinatário, profundidade da anestesia, reanimação e administrar o volume conforme necessário.
30. Dependendo dos endpoints experimentais, quer fechar abdômen do animal e deixá-lo recuperar da anestesia, ou preparar o animal para avaliação cardiovascular.
    NOTA: Exemplos de avaliação de enxerto incluem em medidas in vivo de hemodinâmica dependente da carga e independente de carga, in vitro medidas de função em Langendorff e modos coração de trabalho, e (em cirurgia sobrevivência) ecocardiográficos ou inquéritos de ressonância magnética.
31. Nofinal de experiências agudas de terminais, os animais são sacrificados por exsanguinação.

Resultados

A técnica HAHLT descrito acima é altamente técnica e requer muita atenção aos detalhes. Tabela 1 destaca alguns dos principais fatores associados ao sucesso contra procedimentos mal sucedidos, e pode ser usado como um guia para a resolução de problemas dificuldades técnicas.

Após a aorta do receptor está desapertada, as artérias coronárias de enxerto deve ser visto a encher com sangue oxigenado. Assim, o miocárdio deve tornar-se rosa e bem perfundido. Em experim...

Discussão

O sucesso com a técnica descrita aqui vai ser em função de diversos factores. O principal entre eles será assegurar a estabilidade de ambos os animais doadores e receptores, adotando a técnica operatória meticulosa que é seguro e associado com a perda de sangue mínima, garantindo parada cardioplégica completo com arrefecimento uniforme enxerto, minimizando o tempo de isquemia total, e de forma adequada de-arejar o enxerto. Como reconheceu acima, a complexidade técnica da técnica é a sua limitação chefe.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.