Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Resumen

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Resumen

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introducción

Rastreo de ruta anatómica es una de las herramientas más comúnmente utilizadas para descifrar la relación entre el cerebro y el comportamiento ^1. El avance en las tecnologías de circuitos neuronales rastreo ha otorgado neurocientíficos con la capacidad de rastrear los circuitos neuronales de poblaciones de neuronas identificadas genéticamente en ratones ^2. A pesar de estos avances técnicos que sigue siendo un reto para desentrañar la formación de circuitos neuronales especialmente durante la maduración embrionaria. Esto es porque la mayoría de los métodos de rastreo desarrolladas hasta la fecha se basan en la inyección estereotáxica de trazadores transsynaptic o virus neurotróficos modificados genéticamente (Figura 1) ^2,3. Si bien estas técnicas de lograr la resolución espacial y temporal de la conectividad, varias limitaciones inherentes, tales como inyecciones de trazadores técnicamente desafiantes en el cerebro en desarrollo, la reproducibilidad de la sitio de la inyección, inflamación potencial en el sitio de la inyección y lo más importante citotoxicidad causada por los virus neurotróficos limitar su uso ^4.

Un método alternativo consiste en expresar los trazadores transsynaptic como transgenes en ratones genéticamente alterados. Recientemente hemos modificado esta técnica y ha desarrollado un sistema de rastreo transsynaptic genética binaria para mapear los circuitos neurales de una población neuronal identificado genéticamente ^5. Nuestra estrategia experimental se basa en dos nuevas cepas de ratón knock-in, que expresan ya sea la lectina de cebada trazador bidireccional (BL) ⁶ o el trazador retrógrado fragmento de la toxina tetánica C fusionado a GFP (GTT) ⁷ desde el locus ROSA 26 después mediada por Cre recombinación. Aquí hemos utilizado estas cepas de ratón para expresar selectivamente BL y GTT en las neuronas que producen kisspectina, un neuropéptido que está implicada en la regulación de la maduración del eje reproductivo ^8,9. Se demuestra que esta técnica es adecuado para visualizar el desarrollo y maduración del besocircuitos neuronales peptina durante el desarrollo embrionario del cerebro del ratón hembra ^5.

Estrategia de cría

El R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) y los R26-GFP-TTC (GTT) líneas trazadoras son ronda en cepas ⁵ que llevan alelos ROSA26 recombinantes. El R26-BIZ y los alelos R26-GTT son transcripcionalmente silencioso debido a la presencia de una fuerte señal de parada transcripcional, que está flanqueado por dos sitios loxP ^5. Expresión del transgén BIZ GTT y se activa por la eliminación mediada por Cre de la señal de parada transcripcional. Los alelos R26 y R26-BIZ-GTT se pueden utilizar independientemente con sólo cruzar con una línea piloto Cre. Para los animales de análisis de heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados. Littermates que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, deben ser utilizados como controles. Alternativamente, también es posible generar tRiple ronda en animales portadores de los alelos Cre, R26 y R26-BIZ-GTT, sin embargo esto requerirá una cruz adicional.

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Protocolo

NOTA: Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Hamburgo y la Universidad de Saarland.

1. Preparación y fijación de tejido embrionario

1. Organizar todos los equipos necesarios para diseccionar los embriones y preparar soluciones para la posterior fijación de los tejidos antes de sacrificar a los animales.
   NOTA: Siempre preparar una solución fresca 4% de paraformaldehído (PFA) (4% PFA en 0,1 M tampón fosfato salino (PBS), ajustar el pH a 7,4).
2. La eutanasia cronometrado ratón hembra embarazada con un procedimiento éticamente aprobado.
3. Transferir el ratón sobre una plataforma. Humedezca la cara ventral del abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión vertical con unas tijeras afiladas para exponer la cavidad abdominal.
4. Identificar la cadena embrionario y tire de ella con cuidado aplicando fórceps romos y colocarlo en helado de PBS.
5. Retire los embriones individuales dela cadena de embriones utilizando finas tijeras y pinzas. Quitar el tejido extra alrededor de los embriones y lávelos con helado de PBS.
6. Tomar una pequeña biopsia de cola (antes de transferir el embrión en PFA) y se incuba en tampón de lisis de la cola para la identificación de género y genotipado alelo trazador PCR.
7. Iniciar en el embrión en el lado más lateral y transferir cada embrión por separado en un tubo que contiene helado 4% PFA en el hielo en una coctelera.
8. Remojar los embriones a la edad de E13.5 o menos durante 1,5 h en hielo con agitación constante. Remojar los embriones en E14.5 E15.5 edad y durante 2,5 horas en hielo con agitación constante.
9. Por E16.5 embriones edad o más, decapitar y quitar la piel exterior antes de remojar la cabeza en una solución de PFA. Jefes de embriones E16.5 pueden ser remojados durante 4,5 horas en hielo con agitación constante.
10. Después de la fijación apropiada, lavar los embriones tres veces con PBS enfriado con hielo. La transferencia de los embriones en 30% de sacarosa en solución de PBS a 4 ° C hasta que se hundena la parte inferior.

2. Congelación

1. Organizar todos los materiales necesarios antes de iniciar el proceso de congelación: crio-moho, crio-guantes, pinzas entomología peso pluma, rotulador y compuestas temperatura óptima de corte (OCT)
2. Etiquetar el molde crio con un marcador permanente resistente al alcohol (mencionar la orientación del tejido, la fecha y genotipo). Preparar un granizado de hielo seco triturado y etanol al 100% en un cubo de hielo. Coloque un vaso de vidrio en el interior contiene isopentano. Espere 10 minutos para el isopentano se enfríe.
3. Mientras tanto eliminar el tejido de la solución de sacarosa, limpie el exceso de sacarosa en todo el tejido utilizando toallitas de laboratorio. Transferir el tejido en un crio-molde previamente etiquetado con suficiente octubre para cubrir el tejido. Evite las burbujas de aire en los PTU; especialmente alrededor del tejido.
4. Oriente el tejido en octubre utilizando pinzas entomología peso pluma para evitar daños en los tejidos. Iniciar la congelación mediante la transferencia de la crio-mold en el baño de isopentano enfriado previamente. No salpique isopentano en el octubre, ya que no se congele correctamente. Envuelva las muestras en papel de aluminio y guardar a -80 ° C.

3. cryosectioning

1. Cortar 14 m de serie de secciones delgadas en serie de cinco usando un criostato y recoger en portaobjetos de vidrio SuperFrost® Plus para inmunofluorescencia análisis (SI). Guarde las diapositivas a -80 ° C hasta su utilización.

4. trazador visualización utilizando el protocolo (TSA) tiramida amplificación de señal

1. Preparar los tampones y reactivos necesarios para la tinción. Siempre recién preparar el tampón Tris-NaCl-Tween (TNT) en el día de uso.
   1. Preparar tampón TNT utilizando 100 ml de M Tris-HCl 1 pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M y ddH ₂ O hasta un volumen final de 1 L. Añadir 500 l de Tween 20 utilizando una pipeta de 1 ml. Añadir el Tween 20 lentamente y lave la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para asegurarse de que todo está en Tween 20solución.
   2. Prepare Tris-NaCl-bloqueo (TNB) buffer usando 100 ml de M Tris-HCl 1 pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M y ddH ₂ O hasta un volumen final de 1 L. Añadir 5 g de reactivo de bloqueo (proporcionado con el kit) lentamente en pequeños incrementos a la memoria intermedia mientras se agitaba. Calentar la solución gradualmente a 55 ° C con agitación continua para disolver completamente el reactivo de bloqueo (esto no debería llevar más de 30 a 60 min). Para conseguir un calentamiento homogéneo utilizar un baño de agua a 55 ° C. La solución aparecerá lechoso. Llevar la solución a temperatura ambiente antes de usar. Alícuota y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   3. Reconstituir el reactivo tiramida biotina (suministrado con el kit) en Biología Molecular / grado HPLC DMSO. Dependiendo de qué kit se utiliza la cantidad apropiada de DMSO puede variar. La solución madre, a 4 ° C.
      NOTA: Las secciones de los animales heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados para el análisis de circuitos. Uso sreflexiones de los compañeros de camada que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, como controles negativos. Tratar portaobjetos controles negativos exactamente como diapositivas de animales dobles heterocigotos. Además, incluyen una corredera de control de un animal heterocigota doble, pero dejar de lado el reactivo TSA (control sin amplificar).
2. Con un bisturí afilado fresco eliminar el exceso de octubre en torno a los cortes de tejido y marca la frontera alrededor de las secciones con un lápiz PAP.
3. Secar los portaobjetos durante 2-3 min a temperatura ambiente (RT). Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. Incubar los portaobjetos a TA durante 30 min en 0,3% de H ₂ O ₂ solución en metanol enfriado con hielo para apagar la actividad de la peroxidasa endógena.
4. Lavar 3x con PBS durante 5 min cada uno a TA. Incubar durante 10 min en 0,5% de Triton X-100 en PBS para la permeabilización del tejido. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno.
5. Bloquear con TNB (solución de bloqueo, 200-300 l por diapositiva) para 30min a RT en una cámara humidificada. Asegúrese de que todas las secciones están completamente cubiertas por TNB. No deje que los portaobjetos se sequen entre los pasos.
6. Escurrir el exceso de tampón de bloqueo y aplicar el antisuero primario reconocer el trazador (1: 1000 de cabra anti-WGA para BL, 1: 15.000 de conejo anti-GFP para GTT) diluido en TNB durante 2 horas a RT o durante la noche a 4 ° C. Asegúrese de utilizar un volumen suficiente para cubrir completamente la sección de tejido (200-300 l por diapositiva).
   NOTA: Las diluciones de antisueros primarios recomendados aquí pueden tener que ser ajustada.
7. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación.
8. Se incuban las secciones con antisuero secundario biotinilado que reconocen el anfitrión de la primera antisuero (1: 500 caballo anti-IgG de cabra anti-WGA, 1: 5.000 de cabra anti-IgG de conejo anti-GFP en TNB durante 1 hora a temperatura ambiente).
9. Lavar 3 veces con TNT a TA durante 5 min cada uno con agitación. Incubar en 1: 100 de estreptavidina (SA) y conjugado con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP, wi proporcionadoth el kit) en TNB durante 30 min a RT en una cámara humidificada. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. Mientras tanto descongelar la TSA.
10. Diluir 1:50 en TSA TSA diluyente de amplificación (suministrado con el kit, que utilicen el kit TSA para la visualización de BL y el kit TSA + para GTT). Incubar las secciones de tejido en diluido TSA precisamente por 10 min a RT. Diluir TSA justo antes de su uso, idealmente durante la etapa de lavado anterior, no utilice ningún restante diluida reactivo TSA para futuros experimentos; prepare siempre fresco.
11. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. Incubar con 1: 500 Alexa Fluor® 546 de estreptavidina conjugada en TNB durante 30 min a RT. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación.
12. Incubar durante 10 min en solución bisbenzimide 5% en PBS a RT para la tinción nuclear. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. Montar con Fluromount G y realizar epifluorescencia o microscopía confocal.
    Solución de problemas: La eficacia de la transferencia de trazador dependerá del nivel de expresión del locus ROSA26 en las células productoras (determinado por la línea de conductor Cre utilizado) y en el circuito neural analizado (por ejemplo, número de neuronas que producen el trazador, la convergencia etc.). Por lo tanto las diluciones de antisueros primarios recomendados aquí pueden tener que ajustarse para evitar que la señal baja o exceso. Antecedentes siempre debe ser analizado utilizando portaobjetos de control apropiados (véase más arriba).

5. τlacZ tinción de secciones embrionarias

1. Preparar los tampones y reactivos necesarios para la tinción. Siempre recién preparar el tampón de LacZ C antes de su uso.
   1. Preparar 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) solución madre (40 mg / ml) mediante la adición de 40 g de X-gal a 1 ml 70% de dimetilformamida (DMF). Cubra con papel aluminio y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   2. Preparar nitro azul tetrazolio (NBT) stock solución (50 mg / ml) mediante la adición de 50 g de NBT a 1 ml 70% de DMF. Cubra con papel aluminio y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   3. Prepare LacZ fijador utilizando 80 l de glutaraldehído al 25%, 5 ml de PFA al 4%, 20 l de 1 M de MgCl _2, 100 l de EGTA 500 ​​mM, 1 ml de 1 M de tampón fosfato pH 7,4 y ddH ₂ O hasta una final volumen de 10 ml.
   4. Prepare LacZ tampón A utilizando 1 ml de 1 M de MgCl _2, 5 ml de EGTA 500 ​​mM, 50 ml de 1 M tampón fosfato pH 7,4 y ddH ₂ O hasta un volumen final de 500 ml.
   5. Preparar tampón B LacZ usando 1 ml de 1 M de MgCl _2, 5 ml de EGTA 500 ​​mM, 5 ml de 1% de desoxicolato de sodio, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de tampón de fosfato 1 M pH 7,4 y ddH ₂ O hasta un volumen final de 500 ml.
   6. Prepare el buffer de LacZ C mediante la adición de 10 l de solución de NBT y 12,5 l de X-gal solución madre a 1 ml de tampón LacZ B. Hacer fresco justo antes de su uso y cubrir con papel de aluminio.
2. Seque las diapositivas a TA al menos durante 10-15 minutos (mientras tanto preparar las diapositivas con un lápiz PAP).
3. Fije la sección con LacZ fijador durante 2 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda en el interior una sustancia química del humo del capó. Lavar 3 veces con PBS suplementado con 2 mM _MgCl2.
4. Enjuagar los portaobjetos con tampón LacZ A. Lave los portaobjetos con LacZ tampón A 3 veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Lavar 2 veces con tampón LacZ B durante 5 minutos cada uno. Incubar los portaobjetos en tampón LacZ C a 30-37 ° C durante 6 horas o toda la noche en una cámara húmeda.
   NOTA: Añadir suficiente volumen de tampón LacZ C; diapositivas no debe secarse durante la incubación.
5. Después de la incubación adecuada lavan los portaobjetos con PBS suplementado con 2 mM _MgCl2. Enjuague secciones brevemente con ddH ₂ O. Cubreobjetos con glicina gelatina de Mayer. Adecuado para un microscopio de luz equipado con un contraste de interferencia diferencial (DIC) de formación de imágenes set-up.

6. Gender y trazador Genotipado

1. Preparar la cola tampón de lisis usando 1 ml de M Tris-HCl pH 8,5 1, 100 l de EGTA 500 ​​mM, 200 l de 10% SDS, 400 l de NaCl 5 M y ddH ₂ O para hacer un volumen final de 10 ml.
2. Añadir 500 l de tampón de lisis de la cola a cada tubo Eppendorf que contiene una biopsia de la cola. Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 mg / ml. Incubar toda la noche en un agitador a 55 ° C.
3. Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 10 min a TA. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 500 l de isopropanol al sobrenadante. Mezclar durante al menos 5 min invirtiendo los tubos arriba y hacia abajo.
4. Girar en centrifugar a 17.000 xg durante 5 min a TA. Retirar el sobrenadante. Añadir 200 l de etanol al 70%. Agitar durante al menos 5 min.
5. Se centrifuga a 17.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con una Pipetman (no vierta apagado). Secar el precipitado en una cámara caliente (37 ° C) durante 15-30 min.
6. Resuspender pellet en 100 lde bajo TE pH 8,0 o agua usando puntas de ancho de ánima se filtró. Ponga en 55 ° C durante 1 hora y a 37 ° C durante la noche para disolución adecuada. Almacenar a 4 ° C.
7. Utilice 1 l de ADN para la reacción de PCR (mezcla de reacción 50 l que contiene 1 l de ADN de la cola, 2,5 l DMSO, 22:00 de cada cebador, 25 M de cada dNTP, y betaína 1M). Cebadores de PCR para genotipificación y la identificación de género se enumeran en la tabla de Materiales.

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Resultados

Esta sección muestra los resultados representativos que se pueden obtener a trabajar con el R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) y la R26-GTT (G FP-TT C) alelos. Aquí se utiliza el R26-BIZ y los alelos R26-GTT para analizar la maduración de los circuitos neuronales que regulan el eje reproductivo. La reproducción en los vertebrados está controlado por un pequeño grupo de neuronas en el hipotálamo, que secretan la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Kisspepti...

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Discusión

Expresando trazadores transsynaptic como transgenes para rastrear los circuitos neurales de poblaciones neuronales definidas genéticamente tiene varias ventajas en comparación con la inyección estereotáxica de trazadores o virus neurotopic. En primer lugar, el trazador se produce como una proteína endógena y por lo tanto no provoca ninguna respuesta inmune y una vía neural selectiva puede ser analizada en diferentes animales con alta reproducibilidad. En segundo lugar, porque este es un método no invasivo que se...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC