Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Resumo

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Resumo

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introdução

Rastreamento de trajeto anatômico é uma das ferramentas mais utilizadas para decifrar a relação entre cérebro e comportamento ^1. Avanço nas tecnologias de rastreamento de circuitos neurais concedeu neurocientistas com a capacidade de rastrear circuitos neurais a partir de populações de neurônios geneticamente identificadas em camundongos ^2. Apesar desses avanços técnicos que continua sendo um desafio para desvendar a formação de circuitos neurais especialmente durante a maturação embrionária. Isto é porque a maioria dos métodos de rastreio desenvolvidos até à data baseiam-se a injecção estereotáxica de marcadores transsináptica ou vírus neurotrópico geneticamente modificados (Figura 1) ^2,3. Embora essas técnicas obter uma resolução espacial e temporal da conectividade, várias limitações inerentes, tais como injecções traçadores tecnicamente difíceis para o desenvolvimento do cérebro, a reprodutibilidade do local da injecção, inflamação potencial no local da injecção e mais importantly citotoxicidade causada por vírus neurotrópicas limitar a sua utilização ^4.

Um método alternativo é a de expressar os transgenes marcadores transsináptica como em murganhos geneticamente modificados. Temos recentemente modificado esta técnica e desenvolveu um sistema binário transsináptica genética rastreamento para mapear os circuitos neurais de qualquer população neuronal geneticamente identificado ^5. A nossa estratégia experimental baseia-se em duas novas estirpes knock-no rato, que expressam a lectina ou bidirecional cevada traçador (BL) ⁶ ou o traçador retrógrado fragmento C da toxina do tétano fundido a GFP (GTT) a partir da ⁷ ROSA 26 lócus após mediada por Cre recombinação. Aqui usamos estas linhagens de camundongos para expressar seletivamente BL e GTT em neurônios que produzem kisspeptin, um neuropeptídeo que está implicado na regulação da maturação do eixo reprodutivo ^8,9. Nós demonstramos que esta técnica é adequado para a visualização do desenvolvimento e maturação de ósculocircuitos neurais peptina durante o desenvolvimento embrionário do cérebro do rato fêmea ^5.

Estratégia para a criação

O os R26-GFP-TTC (GTT) linhas traçadores R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e são knock-in cepas ⁵ que carregam alelos ROSA26 recombinantes. O R26-BIZ e os alelos R26-GTT são transcricionalmente silencioso devido à presença de um sinal de paragem da transcrição forte, que é flanqueado por dois sítios loxP ^5. A expressão do transgene e BIZ GTT é activado por remoção mediada por Cre do sinal de paragem da transcrição. Os alelos-R26 e R26-BIZ GTT pode ser usado de forma independente através da simples cruzamento com uma linha de condutor Cre. Para os animais de análise heterozigótica para os respectivos alelos Cre e R26 pode ser usado. Da mesma ninhada que transportam uma Cre ou um alelo R26, respectivamente, devem ser utilizadas como controlos. Em alternativa, também é possível gerar triple knock-nos animais com os alelos Cre, R26 e R26-BIZ-GTT, porém isso vai exigir uma cruz adicional.

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Protocolo

NOTA: Ética Declaração: os procedimentos de indivíduos animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar dos animais, da Universidade de Hamburgo e da Universidade de Saarland.

1. Preparação e fixação de tecido embrionário

1. Organizar todos os equipamentos necessários para dissecar os embriões e preparar soluções para posterior fixação do tecido antes de sacrificar os animais.
   NOTA: Sempre preparar uma nova solução de 4% de paraformaldeído (PFA) (PFA a 4% em 0,1 M de solução salina de fosfato tamponada (PBS), pH ajustado a 7,4).
2. Eutanásia cronometrado rato fêmea grávida de um procedimento eticamente aprovado.
3. Transferir o rato sobre uma plataforma. Molhe o lado ventral do abdômen com etanol 70% e fazer uma incisão vertical usando uma tesoura afiada para expor a cavidade abdominal.
4. Identificar a cadeia embrionário e retire-o com cuidado, usando uma pinça sem corte e colocá-lo em PBS gelado.
5. Remover os embriões individuaisa cadeia embrionárias usando uma tesoura fina e fórceps. Remover tecido extra em torno dos embriões e lave-os em PBS gelado.
6. Pegue uma pequena biópsia de cauda (antes da transferência do embrião para PFA) e incubar-lo em tampão de lise da cauda para a identificação de gênero e alelo tracer genotipagem PCR.
7. Iniciar a partir do embrião no lado mais lateral e transferir cada embrião separadamente para um tubo arrefecido com gelo contendo PFA a 4% em gelo num agitador.
8. Embeber os embriões com a idade de E13.5 ou menos durante 1,5 horas em gelo com agitação constante. Mergulhe os embriões na E14.5 idade e E15.5 durante 2,5 horas em gelo com agitação constante.
9. Para E16.5 embriões idade ou mais, decapitar e remova a pele exterior antes de mergulhar a cabeça em solução PFA. Chefes de embriões E16.5 pode ser embebido durante 4,5 horas em gelo com agitação constante.
10. Após a fixação adequada, lavar os embriões três vezes com PBS gelado. Transferir os embriões em sacarose a 30% em solução de PBS a 4 ° C até se afundempara a parte inferior.

2. Congelamento

1. Organizar todos os materiais necessários antes de iniciar o processo de congelamento: crio-mofo, crio-luvas, pinças pluma entomologia, caneta marcador e corte ideal compostos temperatura (OCT)
2. Rotular o crio-molde com um marcador permanente resistente ao álcool (mencionar a orientação do tecido, da data e do genótipo). Prepare uma lama de gelo seco moído e 100% de etanol em um balde de gelo. Coloque um copo de vidro no interior contendo isopentano. Aguarde 10 minutos para o isopentano para esfriar.
3. Enquanto isso, remover o tecido a partir da solução de sacarose, limpe o excesso de sacarose em torno do tecido usando lenços de laboratório. Transferir o tecido em um pré-rotulados crio-molde com suficiente OCT para cobrir o tecido. Evite as bolhas de ar no PTU; especialmente em torno do tecido.
4. Orientar o tecido em outubro com a pinça entomologia pluma para evitar danos aos tecidos. Comece congelamento transferindo o crio-mold para o banho isopentano pré-resfriada. Não salpique isopentano na outubro, pois não irá congelar corretamente. Enrole as amostras em folha de alumínio e armazenar a -80 ° C.

3. cryosectioning

1. Cortar 14 mm cortes seriados finos em série de cinco usando um criostato e recolher em lâminas de vidro SuperFrost® Plus para análise de imunofluorescência (IF). Armazenar as lâminas a -80 ° C até ser utilizado.

4. Usando a visualização Tracer (TSA) Protocolo Tyramide Signal Amplification

1. Prepare os tampões e reagentes necessários para a coloração. Sempre recentemente preparar o tampão Tris-NaCl-Tween (TNT) no dia da utilização.
   1. Preparar tampão TNT usando 100 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M e _ddH2O até ao volume final de 1 L. Adicionar 500 ul de Tween 20 utilizando uma pipeta de 1 ml. Adicionar lentamente o Tween 20 e lave a pipeta para cima e para baixo várias vezes para assegurar que todo o Tween 20 é emsolução.
   2. Prepare Tris-NaCl-tampão de bloqueio (TNB) usando 100 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M e _ddH2O até ao volume final de 1 L. Adicionar 5 g de reagente bloqueador (fornecida com o Kit) lentamente em pequenos incrementos para o buffer enquanto se agitava. Aquece-se a solução gradualmente até 55 ° C com agitação contínua, para dissolver completamente o reagente de bloqueio (o que não deveria demorar mais de 30-60 minutos). Para atingir o aquecimento homogéneo utilizar um banho de água a 55 ° C. A solução aparece leitoso. Levar a solução à temperatura ambiente antes de usar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
   3. Reconstituir biotina reagente de tiramida (fornecido com o kit) em Biologia Molecular / DMSO de grau HPLC. Consoante o kit é utilizado a quantidade apropriada de DMSO pode variar. Guardar a solução estoque a 4 ° C.
      NOTA: Os cortes de animais heterozigotos para os respectivos alelos Cre e R26 pode ser usado para análise de circuitos. Use sexões de ninhada que transportam uma Cre ou um alelo R26, respectivamente, como controles negativos. Trate lâminas de controlo negativas exatamente como slides de animais heterozigotos duplas. Além disso, incluem uma lâmina de controlo de um animal heterozigoto duplo, mas deixar de fora o reagente TSA (controlo sem amplificação).
2. Usando um bisturi afiado fresco remover o excesso de outubro em torno das secções de tecido e marcar o limite em torno das secções com uma caneta PAP.
3. Secam-se as lâminas durante 2-3 minutos à temperatura ambiente (TA). Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min em 0,3% _de H ₂ O ₂ em solução de metanol arrefecido em gelo para extinguir a actividade da peroxidase endógena.
4. Lavar 3x com PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. Incubar durante 10 min em 0,5% de Triton X-100 em PBS durante a permeabilização dos tecidos. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada.
5. Bloco com TNB (solução de bloqueio, 200-300 mL por lâmina) para 30min à temperatura ambiente numa câmara humidificada. Certifique-se de todas as seções são completamente cobertas por TNB. Não deixe que as lâminas secar entre as etapas.
6. Drenar o excesso de tampão de bloqueio e aplicar o anti-soro primário que reconhece o marcador (1: 1000 de cabra anti-WGA por BL, 1: 15.000 de coelho anti-GFP para GTT) diluído em TNB durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de usar um volume suficiente para cobrir totalmente a secção de tecido (200-300 mL por lâmina).
   NOTA: As diluições anti-soros primários recomendadas aqui pode ter de ser ajustada.
7. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação.
8. Incubar as secções com soro secundário biotinilado reconhecem o anfitrião do primeiro anti-soro (1: 500 cavalo IgG anti-cabra para anti-WGA, 1: 5.000 de cabra anti-IgG de coelho para o anti-GFP em TNB durante 1 hora a RT).
9. Lavar 3x com TNT à temperatura ambiente durante 5 min cada, com agitação. Incubar em 1: 100 estreptavidina (SA) conjugado a peroxidase de rábano (SA-HRP, wi fornecidath o kit) em TNB durante 30 min à temperatura ambiente numa câmara humidificada. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada. Enquanto isso descongelar a TSA.
10. Diluir 1:50 em TSA TSA diluente amplificação (fornecido com o kit, use o kit TSA para a visualização de BL e o kit de TSA + por GTT). Incubam-se as secções de tecido em TSA diluído para precisamente 10 min à temperatura ambiente. Diluir TSA imediatamente antes da utilização, de preferência durante a etapa de lavagem anterior, não use qualquer restante reagente TSA diluída para experiências futuras; elaborar sempre fresco.
11. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação. Incubar com 1: 500 de Alexa Fluor ® 546 em TNB estreptavidina conjugada durante 30 min à TA. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação.
12. Incubar durante 10 min em solução de bisbenzimida 5% em PBS à temperatura ambiente durante a coloração nuclear. Lavar as lâminas em RT 3x com TNT para 5 min cada um com agitação. Montar com Fluromount G e realizar epifluorescência ou microscopia confocal.
    Solução de problemas: A eficácia da transferência do marcador vai depender do nível do locus ROSA26 nas células produtoras (determinado pelo controlador de linha de Cre utilizado) e expressão do circuito neural analisados ​​(por exemplo, número de neurónios que produzem o marcador, de convergência, etc.). Por conseguinte, as diluições de anti-soros primários recomendadas aqui podem ter de ser ajustados para impedir sinal baixo ou em excesso. Fundo devem ser sempre analisados ​​utilizando lâminas de controlo adequados (veja acima).

5. τlacZ Coloração para Seções embrionárias

1. Prepare os tampões e reagentes necessários para a coloração. Sempre recém preparar o LacZ tampão C antes do uso.
   1. Prepare 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) de solução-mãe (40 mg / ml) por adição de 40 g de X-gal a 1 ml de 70% de dimetilformamida (DMF). Cubra com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
   2. Prepare nitro blue tetrazolium (NBT) stock solução (50 mg / ml) por adição de 50 g de NBT a 1 ml de 70% de DMF. Cubra com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
   3. Prepare LacZ fixador utilizando 80 ul de 25% de glutaraldeído, 5 ml de 4% de PFA, 20 ul de 1 M de _MgCl2, 100 ul de 500 mM de EGTA, 1 ml de 1 M de tampão fosfato pH 7,4 e _ddH2O até ao final, volume de 10 ml.
   4. Prepare LacZ tampão A com 1 ml de 1 M de _MgCl2, 5 ml de 500 mM de EGTA, 50 ml de 1 M de tampão de fosfato de pH 7,4 e _ddH2O até um volume final de 500 ml.
   5. Preparar tampão de LacZ B com 1 ml de solução 1 M de _MgCl2, 5 ml de 500 mM de EGTA, 5 ml de 1% de desoxicolato de sódio, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de tampão de fosfato 1 M a pH 7,4 e _ddH2O até um volume final de 500 ml.
   6. Preparar tampão de LacZ C por adição de 10 ul de solução de estoque de NBT e 12,5 ml de solução de estoque de X-gal a 1 ml de tampão B. LacZ fazem fresco imediatamente antes da utilização e cobrir com folha de alumínio.
2. Seque as lâminas a RT pelo menos por 10-15 min (entretanto preparar os slides com uma caneta PAP).
3. Fixar a secção com LacZ fixador durante 2 min à temperatura ambiente numa câmara humidificada fumos dentro de um capuz-química. Lavar 3 vezes com PBS suplementado com 2 mM de _MgCl2.
4. Lavar as lâminas com tampão LacZ A. Lavar as lâminas com LacZ tampão A 3 vezes por 10 min cada, a RT. Lavar duas vezes com tampão de LacZ B durante 5 minutos cada. Incubar as lâminas em tampão LacZ C a 30-37 ° C durante 6 horas ou durante a noite numa câmara humidificada.
   NOTA: Adicionar um volume suficiente de tampão LacZ C; slides não devem secar durante a incubação.
5. Após incubação adequada lavar as lâminas com PBS suplementado com 2 mM de _MgCl2. Enxágüe seções brevemente com DDH ₂ O. Lamela com glicina gelatina de Mayer. Apropriado para um microscópio de luz equipado com um contraste de interferência diferencial (DIC) de imagem set-up.

6. Gender e Tracer Genotipagem

1. Preparar tampão de lise cauda usando 1 ml de 1 M de Tris-HCl pH 8,5, 100 uL de EGTA 500 ​​mM, 200 ul de SDS a 10%, 400 ul de NaCl 5 M e _ddH2O para obter um volume final de 10 ml.
2. Adicionar 500 ul de tampão de lise cauda para cada tubo Eppendorf contendo uma biopsia da cauda. Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100 mg / ml. Incubar durante a noite num agitador a 55 ° C.
3. Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 10 min à TA. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga. Adicionar 500 mL de isopropanol ao sobrenadante. Misturar durante pelo menos 5 min invertendo os tubos para cima e para baixo.
4. Girar numa centrífuga a 17.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante. Adicionar 200 ul de etanol a 70%. Agita-se durante pelo menos 5 min.
5. Centrifuga-se a 17000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma Pipetman (não deitar fora). Seca-se o granulado em uma câmara quente (37 ° C) durante 15-30 min.
6. Ressuspender o sedimento em 100 ulde baixo TE pH 8,0 ou água usando dicas wide-bore filtrados. Colocar em 55 ° C durante 1 hora e a 37 ° C durante a noite para dissolução adequada. Armazenar a 4 ° C.
7. Use 1 ul de DNA para a reacção de PCR (mistura de reacção de 50 ul contendo 1 uL de ADN da cauda, ​​de 2,5 mL de DMSO, a 10 pM de cada iniciador, 25 uM de cada dNTP, e 1M de betaína). Iniciadores de PCR para genotipagem e identificação de gênero estão listados na tabela de Materiais.

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Resultados

Esta seção apresenta os resultados representativos que podem ser obtidos a trabalhar com o R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e o R26-GTT (G FP- TT C) alelos. Aqui usamos o R26-BIZ e os alelos R26-GTT para analisar a maturação dos circuitos neurais que regulam o eixo reprodutivo. Reprodução em vertebrados está centralmente controlada por um pequeno subconjunto de neurônios no hipotálamo, que secretam hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). Kisspept...

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Discussão

Expressando traçadores transsináptica como transgenes para rastrear os circuitos neurais das populações neuronais geneticamente definidos tem várias vantagens em comparação com a injeção estereotáxica de marcadores ou vírus neurotopic. Em primeiro lugar, o marcador é produzido como uma proteína endógena e, por conseguinte, não provocam qualquer resposta imune e uma via neural selectiva pode ser analisada em diferentes animais com elevada reprodutibilidade. Em segundo lugar, porque este é um método não-...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC