배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

요약

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

초록

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

서문

해부학 경로 추적은 뇌와 행동 ^한 관계를 해독하는데 가장 일반적으로 사용되는 도구 중 하나이다. 신경 회로 추적 기술의 발전은 마우스 ² 유전자 확인 된 신경 세포 집단에서 신경 회로를 추적 할 수있는 기능 신경 과학자을 수여했다. 이러한 기술적 인 발전에도 불구하고 그것은 특히 배아 성숙 중에 신경 회로의 형성을 해명 도전 남아있다. 현재까지 개발 된 추적 방법 중 대부분 transsynaptic 트레이서 정위 주사 또는 신경성 유전자 변형 바이러스 (도 1) ^2,3- 기반으로하기 때문이다. 이러한 기술은 연결 공간 및 시간 해상도, 이러한 현상 뇌, 주사 부위에서 대부분의 impor 주사 부위의 재현성, 잠재적으로 염증 기술적 도전 탐침 주사와 같은 몇몇의 본질적인 한계를 달성하면서신경성 바이러스로 인한 tantly 세포 독성은 ⁴ 개 ^사용을 제한한다.

다른 방법은 유전자 변형 생쥐에서 유전자와 transsynaptic 추적자을 표현하는 것입니다. 우리는 최근에이 기술을 수정 및 유전자 확인 된 신경 세포 인구 ^5의 신경 회로를 매핑하는 이진 유전 transsynaptic 추적 시스템을 개발했다. Cre 호텔 - 중재 후 우리의 실험 전략은 양방향 추적 보리 렉틴 (BL) ⁶ ROSA (26) 현장에서 GFP (GTT) ^(7)에 융합 역행 추적 파상풍 독소 조각 C를 표현하는 두 개의 새로운 녹아웃 마우스 균주를 기반으로 재조합. 여기에서 우리는 선택적으로 kisspeptin을 생산 신경 세포 BL과 GTT, 생식 축 ^8,9의 성숙을 조절에 관여하는 신경 펩타이드을 표현하는이 마우스 균주를 사용했다. 우리는이 기술 키스의 개발 및 성숙을 시각화하기에 적합 함을 입증여성 마우스의 뇌 ^(5)의 배아 개발하는 동안 peptin 신경 회로.

번식 전략

R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) 및 R26-GFP-TTC (GTT) 추적 선 노크 재조합 ROSA26 대립 유전자를 전달 계통 ^5이다. R26-BIZ 및 R26-GTT의 대립으로 인해 두에 loxP 사이트 ^(5)에 의해 측면 강한 전사 정지 신호의 존재에 전사적으로 침묵. BIZ과 GTT 유전자의 발현은 전사 정지 신호의 Cre 호텔 - 매개 제거에 의해 활성화된다. BIZ-R26 및 R26-GTT 대립 단순히 치운다 드라이버 라인과 교차하여 독립적으로 사용될 수있다. 각각의 Cre 호텔 및 R26 대립 유전자에 대한 분석 동물 이형을 사용할 수있다. 하나 또는 하나 Cre 호텔 R26 대립 유전자를 운반 한배 새끼는 각각 대조군으로 사용되어야한다. 대안 적으로, t를 생성 할 수도있다노크에 riple Cre 호텔, R26-BIZ 및 R26-GTT 대립 유전자를 운반하는 동물, 그러나 이것은 하나의 추가 크로스가 필요합니다.

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프로토콜

참고 : 윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 함부르크 대학과 자를란 트 대학의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다.

1. 준비 및 배아 조직의 고정

1. 배아를 해부하고, 동물을 희생하기 전에 조직의 후속 고정을위한 솔루션을 준비하는 데 필요한 모든 장비를 정렬합니다.
   주의 : 항상 (pH 7.4까지 조정을 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 4 % PFA) 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 하였다.
2. 윤리적으로 승인 절차 시간이 초과 임신 여성 마우스를 안락사.
3. 플랫폼에 마우스를 전송합니다. 70 % 에탄올로 복부의 복부 측면을 적시고 복강을 노출 예리한 가위를 사용하여 수직 절개.
4. 배아 체인을 확인하고 신중하게 사용 무딘 집게를 잡아 당깁니다과 얼음처럼 차가운 PBS에 배치합니다.
5. 에서 개별 배아를 제거미세 가위와 집게를 사용하여 배아 체인. 배아 주위에 여분의 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어.
6. (PFA로 배아를 전송하기 전에) 작은 꼬리 생검을 가지고 성별 식별 및 추적 대립 유전자의 유전자형 PCR 용 꼬리 용해 버퍼에 품어.
7. 대부분의 측면에서 배아에서 시작 진탕 얼음 빙냉 4 % PFA를 포함하는 튜브에 각각 별도로 배아 옮긴다.
8. 일정한 진탕 E13.5의 연령이나 얼음에 1.5 시간 동안 젊은에서 배아를 만끽. 일정한 흔들림 얼음에 2.5 시간 동안 나이 E14.5 및 E15.5에서 배아를 만끽.
9. 배아 나이 E16.5 이상은, 목을 벨 및 PFA 용액에 머리를 담근 전에 외피를 제거합니다. E16.5 배아의 머리는 일정 흔들림 얼음에 4.5 시간 동안 담가 할 수 있습니다.
10. 적절한 고정 후, 얼음처럼 차가운 PBS와 배아를 세 번 씻는다. 그들이 가라 앉을 때까지 4 ° C에서 PBS 용액에 30 % 자당에 배아를 전송바닥에.

2. 동결

1. 냉동 프로세스를 시작하기 전에 필요한 모든 자료 정렬 : 극저온 금형, 극저온 장갑, 페더급 곤충학 집게, 마커 펜과 최적의 절단 온도 화합물을 OCT ()
2. 영구 알콜 성 마커 극저온 금형 레이블 (조직, 날짜와 유전자형의 방향을 언급). 얼음 양동이에 짓 눌린 드라이 아이스 100 % 에탄올의 비자금을 준비합니다. 이소 펜탄을 포함하는 내부 유리 비커를 놓습니다. 이소 펜탄가 식을 때까지 10 분 동안 기다립니다.
3. 한편, 자당 용액으로부터 조직을 제거 실험실 물티슈를 사용하여 조직의 주위에 여분의 크로스를 닦아. 조직을 덮을 경우 OCT 미리 라벨링 크라이 금형에 조직을 전송. OCT에서 공기 방울을 피; 특히 조직의 주위에.
4. 조직의 손상을 방지하기 위해 페더급 곤충학의 집게를 사용하여 OCT에서 조직의 방향을. 극저온 몰 전송함으로써 시작 동결예비 냉각 욕에 펜탄 D. 제대로 고정되지 않으므로 OCT를에 이소 펜탄을 기울여야합니다. -80 ° C에서 알루미늄 호일과 가게에서 샘플을 감 쌉니다.

3. 냉동 절편

1. 저온 유지 장치를 사용하여 다섯 시리즈의 14 μm의 얇은 시리얼 섹션을 잘라 면역 (IF) 분석을 위해 SuperFrost® 플러스 유리 슬라이드에 수집합니다. 사용 할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.

Tyramide 신호 증폭 (TSA) 프로토콜을 사용하여 4. 추적기 시각화

1. 염색에 필요한 버퍼 및 시약을 준비합니다. 항상 갓 이용의 날에 트리스의 NaCl-트윈 (TNT) 버퍼를 준비합니다.
   1. 1 L.의 최종 부피까지 1 ml의 피펫을 사용하여 트윈 20의 500 μl를 추가 한 M 트리스 - 염산의 pH가 7.5, 5 M의 NaCl 30 ml의 DDH ₂ O를 100 ml의를 사용하여 TNT 버퍼를 준비합니다. 천천히 트윈 20을 추가하고 모든 트윈 (20)에 있는지 확인하도록 여러 번 아래 피펫을 세척솔루션입니다.
   2. 트리스 - 염화나트륨 블로킹 업 한 L.의 최종 부피의 pH 7.5, 5 M NaCl을 30 ml의 DDH ₂ O 1 M 트리스 - 염산 100 ㎖를 사용하여 (TNB) 버퍼 것은 차단 시약 5g 추가 준비 (구비 천천히 버퍼에 조금씩 키트) 교반하면서. (이 30 ~ 60 분보다 오래 걸릴 안) 완전히 차단 시약을 용해 연속 교반하면서 55 ° C로 점차 솔루션을 가열. 균일 한 가열을 55 ℃에서 수조를 사용하여 달성했다. 이 솔루션은 우유를 나타납니다. 사용하기 전에 실온에 대한 해결책을 가져와. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 분취 가기.
   3. 분자 생물학 / HPLC 등급의 DMSO에 (키트와 함께 제공) 비오틴 tyramide 시약을 복원합니다. 이는 따라 키트 DMSO의 적당량 다를 수 사용된다. 4 ° C에서 원액을 저장합니다.
      주 : 각 Cre 호텔 및 R26 대립 유전자 이형 동물 섹션은 회로 분석에 사용될 수있다. 사용의ections 음성 대조군을 각각 하나 Cre 호텔 또는 1 R26 대립 유전자를 운반하는 한배에서. 정확히 두 번 이형 동물의 슬라이드처럼 음성 대조군 슬라이드를 취급합니다. 또한, 이중 이형 동물로부터 하나의 제어를 포함하지만 슬라이드 TSA 시약 (비 증폭 제어) 뺀다.
2. 날카로운 신선한 메스는 조직 섹션을 둘러싼 초과 OCT를 제거하고 PAP 펜으로 절 주위에 경계를 표시 사용.
3. 실온에서 2 ~ 3 분 (RT)에 대한 슬라이드를 건조시킵니다. 5 분마다 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 급냉 0.3 %에서 30 분 동안 빙냉 메탄올 중의 H ₂ O ₂ 용액을 RT에서 슬라이드를 배양한다.
4. 5 분 PBS로 세척 배 RT 각. 조직 투과성으로 대한 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100에서 10 분 동안 품어. 5 분마다 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오.
5. TNB와 블록 (30)에 대해 (슬라이드 당 200 ~ 300 μL 차단 솔루션)가습 실에서 실온에서 분. 모든 섹션이 완전히 TNB에 포함되어 있는지 확인합니다. 슬라이드 단계 사이에 건조시키지 마십시오.
6. 초과 차단 버퍼를 배출하고 추적 인식 차 항혈청 적용 RT 또는 밤새 4 ℃에서 2 시간 동안 TNB에 희석 (1 : GTT 15,000 토끼 방지 GFP : BL 1,000 염소 항 - WGA 1). 완전히 조직 절편 (슬라이드 당 200 ~ 300 μL)를 충당하기에 충분한 볼륨을 사용하십시오.
   참고 : 여기에 추천 차 항혈청 희석 조정해야 할 수 있습니다.
7. 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오.
8. (: 반 WGA 500 말 방지 염소 IgG를, 1 : 실온에서 1 시간 동안 TNB에 방지 GFP 5,000 염소 항 - 토끼 IgG의 1) 첫 번째 항혈청의 호스트를 인식 바이오틴 차 항혈청과 섹션을 품어.
9. 5 분 교반 각각 실온에서 TNT 씻을 배. 100 스트렙 타비 딘 (SA) 컨쥬 게이트 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (SA-HRP 제공 위스콘신 : 1을 품어가습 챔버 내에서 30 분 동안 실온에서 TNB의 키트) 토륨. 5 분마다 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. 한편 TSA를 해동.
10. (키트와 함께 제공, BL의 시각화 및 GTT에 대한 TSA + 키트 TSA 키트를 사용) TSA 증폭 희석제에 TSA 1:50 희석. RT에서 정확하게 10 분 동안 희석 TSA의 조직 섹션을 품어. 미래 실험 나머지 희석 TSA 시약을 사용하지 않는 이상적 이전 세정 단계 동안, 사용 직전에 희석 TSA; 항상 신선한 준비합니다.
11. 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. 실온에서 30 분 동안 TNB 500 알렉사 Fluor® 546 스트렙 타비 딘 복합체 : 1 품​​어. 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오.
12. 핵 염색 RT에서 PBS에 5 % bisbenzimide 용액에서 10 분 동안 품어. 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. Fluromount G로 마운트하고 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 수행합니다.
    문제 해결 : 트레이서 전송의 효능 (사용 Cre 호텔 드라이버 라인으로 결정) 생산 세포에 ROSA26 궤적의 발현 량에 의존하고, 신경 회로 (트레이서, 수렴 등의 제조 뉴런의 예 번호)를 분석 할 것이다. 따라서 여기에 추천 차 항혈청 희석이 부족하거나 과도한 신호를 방지하기 위해 조정해야 할 수 있습니다. 배경은 항상 적절한 제어 슬라이드 (위 참조)를 사용하여 분석해야한다.

배아 섹션 5. τlacZ 염색

1. 염색에 필요한 버퍼 및 시약을 준비합니다. 항상 신선하게 사용하기 전에 LacZ를 버퍼 C를 준비합니다.
   1. 1 ㎖의 70 % 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 X-gal을 40 g을 첨가하여, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 - β-D-갈 락토 (X-GAL) 스톡 용액 (40 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장소와 커버.
   2. 준비 니트로 블루 테트라 졸리움 (NBT) 성1 ㎖의 70 % DMF에 NBT의 50g을 첨가하여 옥랑 수용액 (50 ㎎ / ㎖). 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장소와 커버.
   3. LacZ의 25 % 글루 타르 알데히드의 80 μL, 4 % 5 ㎖ PFA, 1 M의 20 μl를 이용하여의 MgCl _2, 500 mM의 EGTA 100 ㎕, 마지막에 1 M 인산 완충액 pH 7.4 ml의 DDH ₂ O 닫 정착액 준비 10 ㎖의 부피.
   4. LacZ를 500 mM의 EGTA 5 ㎖, 500 ml의 최종 부피 50 ㎖의 DDH 포스페이트 완충액 pH 7.4 중 1 M, ₂ O, 1 M의 MgCl _2의 1 ml를 사용하여 버퍼 준비한다.
   5. 1 ml의 1 M 중의 MgCl _2, 500 mM의 EGTA 5 ㎖, 5 ml의 1 % 소듐 데 옥시 콜레이트, 10 % NP-40을 100 ㎖, 50 일 M 인산염 완충액 pH 7.4 ml의 DDH ₂ O를 사용 LacZ의 버퍼 B를 준비 500 ml의 최종 부피까지.
   6. NBT 원액 10 μL와 LacZ를 버퍼 B. 1 ㎖에 X-여자 원액의 12.5 μL 사용 직전에 신선한 확인하고 알루미늄 호일로 커버를 추가하여 LacZ를 버퍼 C를 준비합니다.
2. (한편 PAP 펜으로 슬라이드를 준비) 적어도 10 ~ 15 분 동안 실온에서 슬라이드를 건조시킵니다.
3. LacZ를 가진 부분은 화학 퓸 후드 안쪽 습윤 챔버에서 상온에서 2 분간 정착액 수정. PBS로 3 회 씻어 2 mM의의 MgCl ₂ 보충.
4. LacZ를 가진 슬라이드 RT에서 10 분마다 3 회 씻어 버퍼 LacZ를 버퍼 A.와 슬라이드를 헹군다. 5 분마다 LacZ를 버퍼 B와 과정을 2 회 반복한다. 가습 실에서 6 시간 또는 하룻​​밤 30 ~ 37 ° C에서 LacZ를 버퍼 C에서 슬라이드를 품어.
   참고 : LacZ를 버퍼 C의 충분한 양을 추가; 슬라이드는 배양 중에 건조하지 않아야합니다.
5. 적절한 배양 후 PBS로 슬라이드를 2 mM의의 MgCl ₂ 보충 씻는다. 간단히 DDH ₂ O.로 섹션을 씻어 메이어의 글리신 젤라틴 커버 슬립. 미분 간섭 대비 (DIC) 촬상 셋업 장착 광학 현미경에 적합.

6. Gend어 및 트레이서 유전자형

1. 1 M 트리스 - 염산의 pH가 8.5, 500 mM의 EGTA 100 ㎕를 1 ml에 사용 꼬리 용해 버퍼를 준비, 10 % SDS 200 μl의 5 M의 NaCl과 DDH ₂ O의 400 μl를 10 ml의 최종 볼륨을 확인합니다.
2. 꼬리 생검을 포함하는 각 에펜 도르프 튜브에 꼬리 용해 버퍼 500 μl를 추가합니다. 100 mg / ml의 최종 농도로 단백질 분해 효소 K를 추가한다. 55 ° C에서 진탕 기에서 밤새 품어.
3. 실온에서 10 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기 샘플. 새로운 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 상층 액에 이소프로판올 500 μl를 추가합니다. 상하 반전 튜브하여 적어도 5 분 동안 혼합한다.
4. 실온에서 5 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리기에 스핀. 상층 액을 붓고. 70 % 에탄올 200 μl를 추가합니다. 적어도 5 분 동안 흔들어.
5. 5 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. Pipetman (부어하지 않음)과 상층 액을 제거합니다. 15 ~ 30 분 동안 따뜻한 챔버 (37 ° C)에서 펠렛을 건조.
6. 100 μL에 재현 탁 펠릿와이드 보어 필터링 정보를 사용하여 낮은 TE 산도 8.0 또는 물. 적절한 용해 밤새 C 1 시간 동안 37 °에서 55 ° C에 넣습니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
7. PCR 반응 (꼬리 DNA 1 μL, 각각의 프라이머의 2.5 μL DMSO 오후 10, 25 각각의 dNTP의 μM 및 1M 베타를 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물)에 대한 DNA 1 μl를 사용합니다. 유전자형과 성 식별을위한 PCR 프라이머는 재료 표에 나열되어 있습니다.

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결과

이 섹션에서는 R26-BIZ (B L- I RES-τlac의 Z)과 R26-GTT (G FP-TT C) 대립 유전자와 협력을 얻을 수있다 대표적인 결과를 보여줍니다. 여기에서 우리는 생식 축 조절 신경 회로의 성숙을 분석 R26-BIZ 및 R26-GTT 대립 유전자를 사용합니다. 척추 동물의 복제를 중앙에서 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에)을 분비하는 시상 하부의 신경 세포의 작은 부분 집합에 의해 제어된?...

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토론

유 전적으로 정의 뉴런 집단의 신경 회로를 추적 트랜스 transsynaptic 트레이서로 표현하면 트레이서 neurotopic 바이러스 또는 정위 주사에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 먼저, 추적기 내인성 단백질로서 생산하고, 따라서 임의의 면역 반응을 유도하지 않으며 선택적 신경 통로 재현성을 다른 동물에서 분석 될 수있다. 이 비 침습적 방법이기 때문에 둘째, 자궁 내, 예를 들어, 정위 주사 쉽?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC