Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Résumé

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Résumé

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introduction

Chemin tracé anatomique est l'un des outils les plus couramment utilisés pour déchiffrer la relation entre le cerveau et le comportement ^1. Progrès dans les technologies de circuits neuronaux traçage a accordé neuroscientifiques avec la capacité de retracer les circuits neuronaux de populations de neurones génétiquement identifiés chez la souris ^deux. En dépit de ces progrès techniques, il reste difficile de démêler la formation des circuits neuronaux en particulier pendant la maturation embryonnaire. Ce est parce que la plupart des méthodes de traçage développées à ce jour sont basées sur l'injection de traceurs transsynaptique stéréotaxique ou des virus neurotropes génétiquement modifiés (Figure 1) ^2,3. Bien que ces techniques d'atteindre la résolution spatiale et temporelle de la connectivité, plusieurs limitations inhérentes telles que les injections traçantes techniquement difficiles dans le cerveau en développement, la reproductibilité du point d'injection, inflammation au potentiel du point d'injection et le plus imporcytotoxicité tantly causée par des virus neurotropes limiter leur utilisation ^4.

Une méthode alternative consiste à exprimer que les traceurs transsynaptique transgènes dans des souris génétiquement modifiées. Nous avons récemment modifié cette technique et développé un système binaire de transsynaptique génétique traçage de cartographier les circuits neuronaux de toute population neuronale génétiquement identifié ^cinq. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux nouvelles souches de souris knock-in, qui expriment soit la bidirectionnel traceur orge lectine (BL) ⁶ ou le traceur rétrograde toxine tétanique fragment C fusionnée à la GFP (GTT) ⁷ à partir du locus ROSA 26 après à médiation par Cre recombinaison. Ici, nous avons utilisé ces souches de souris pour exprimer sélectivement et BL GTT dans les neurones qui produisent kisspeptin, un neuropeptide qui est impliquée dans la régulation de la maturation de l'axe de reproduction ^8,9. Nous démontrons que cette technique est apte à visualiser le développement et la maturation des bisoucircuits neuronaux peptine pendant le développement embryonnaire du cerveau de la souris femelle ^5.

Stratégie d'élevage

Le R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) et les R26-GFP-TTC (GTT) lignes de traçage sont knock-in ⁵ souches qui portent allèles ROSA26 recombinantes. La R26-BIZ et les allèles R26-GTT sont transcriptionnellement silencieux en raison de la présence d'un signal d'arrêt de transcription fort, qui est flanquée par deux sites loxP ^5. L'expression du transgène et BIZ GTT est activé par l'élimination médiée par Cre du signal d'arrêt de la transcription. Les allèles R26 et R26-BIZ-GTT peuvent être utilisés indépendamment par simple croisement avec une ligne de pilote Cre. Pour les animaux d'analyse hétérozygotes pour les allèles Cre et R26 respectifs peuvent être utilisés. Chiens d'un souche portant un allèle Cre ou une R26, respectivement, devraient être utilisés comme témoins. En variante, il est également possible de générer des triple knock-in animaux porteurs des allèles Cre, R26 et R26-BIZ-GTT, mais cela nécessitera une croix supplémentaire.

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Protocole

NOTE: Éthique Déclaration: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux de l'Université de Hambourg et l'Université de la Sarre.

1. Préparation et fixation du tissu embryonnaire

1. Disposer tout l'équipement nécessaire pour disséquer les embryons et préparer des solutions pour la fixation ultérieure du tissu avant de sacrifier les animaux.
   REMARQUE: Toujours préparer une nouvelle paraformaldéhyde 4% (PFA) solution (PFA 4% dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS), ajuster le pH à 7,4).
2. Euthanasier chronométré souris femelle enceinte avec une procédure éthique approuvé.
3. Transférer la souris sur une plate-forme. Mouiller la face ventrale de l'abdomen avec 70% d'éthanol et faire une incision verticale à l'aide des ciseaux bien aiguisés pour exposer la cavité abdominale.
4. Identifier la chaîne embryonnaire et tirez-le soigneusement à l'aide de pince émoussée et le placer dans PBS glacé.
5. Retirez les embryons individuels dela chaîne embryonnaire avec des ciseaux et des pinces fines. Retirer le tissu supplémentaire autour des embryons et les laver dans PBS glacé.
6. Prenez une petite queue biopsie (avant de transférer l'embryon dans PFA) et incuber dans la queue du tampon de lyse pour l'identification de genre et le traceur allèle génotypage PCR.
7. À partir de l'embryon au côté le plus latérale et transférer chaque embryon séparément dans un tube contenant glacée PFA 4% sur de la glace sur un agitateur.
8. Faire tremper les embryons à l'âge de E13.5 ou moins pendant 1,5 heure sur la glace avec une agitation constante. Faire tremper les embryons à E14,5 d'âge et E15.5 pendant 2,5 heures sur la glace avec une agitation constante.
9. Pour E16,5 embryons d'âge ou plus, décapiter et enlever la peau extérieure avant de tremper la tête dans une solution PFA. Chefs d'embryons E16,5 peuvent être trempées pendant 4,5 heures sur la glace avec une agitation constante.
10. Après fixation échéant, laver les embryons trois fois avec PBS glacé. Transférer les embryons dans 30% de saccharose dans une solution PBS à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils coulentvers le bas.

2. congélation

1. Disposer tous les matériaux nécessaires avant de commencer le processus de congélation: cryo-moules, cryo-gants, pinces plume d'entomologie, stylo marqueur et composés de température de coupe optimale (OCT)
2. Etiqueter le cryo-moule avec un marqueur résistant à l'alcool permanent (mentionner l'orientation du tissu, la date et le génotype). Préparer une bouillie de glace sèche pilée et 100% d'éthanol dans un seau à glace. Placez un récipient en verre à l'intérieur contenant isopentane. Attendez 10 min pour le isopentane refroidir.
3. Pendant ce temps retirer le tissu de la solution de saccharose, essuyer l'excès de saccharose dans le tissu en utilisant des lingettes de laboratoire. Transférer le tissu dans un cryo-moule pré-étiquetés avec suffisamment octobre pour couvrir le tissu. Éviter les bulles d'air dans les PTOM; en particulier autour du tissu.
4. Orientez le tissu dans l'OCT aide d'une pince d'entomologie plume pour éviter des dommages aux tissus. Un début de congélation en transférant la cryo-moled dans le bain isopentane pré-refroidi. Ne pas éclabousser isopentane dans les PTOM comme il ne gèlera pas correctement. Envelopper les échantillons dans du papier d'aluminium et conserver à -80 ° C.

3. Cryosectioning

1. Couper 14 sections um série minces en série »de cinq utilisant un cryostat et de recueillir sur des lames de verre SuperFrost® Plus pour immunofluorescence (IF) analyse. Conserver les diapositives à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.

4. Tracer la visualisation Utilisation du (TSA) Protocole tyramide amplification du signal

1. Préparer les tampons et les réactifs nécessaires pour la coloration. Toujours fraîchement préparer le tampon Tris-NaCl-Tween (TNT), le jour de l'utilisation.
   1. Préparer du tampon TNT en utilisant 100 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M et ddH ₂ O jusqu'à un volume final de 1 L. Ajouter 500 pi de Tween 20 en utilisant une pipette de 1 ml. Ajoutez le Tween 20 lentement et rincer la pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour se assurer que tous Tween 20 est ensolution.
   2. Préparez Tris-NaCl-blocage (TNB) tampon en utilisant 100 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M et ddH ₂ O jusqu'à un volume final de 1 L. Ajouter 5 g de réactif de blocage (fourni avec le kit) lentement par petits incréments à la mémoire tampon, tout en agitant. Chauffer la solution progressivement à 55 ° C avec agitation continue pour dissoudre complètement le réactif de blocage (cela ne devrait pas prendre plus de 30 à 60 min). Pour obtenir un chauffage homogène utiliser un bain d'eau à 55 ° C. La solution apparaît laiteux. Porter la solution à la température ambiante avant l'utilisation. Aliquoter et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
   3. Reconstituer la biotine réactif tyramide (fourni avec le kit) dans Molecular Biology / HPLC DMSO. En fonction du kit est utilisé, la quantité appropriée de DMSO peut varier. Conserver la solution d'achat d'actions à 4 ° C.
      NOTE: Les sections des animaux hétérozygotes pour les allèles CRE et R26 respectifs peuvent être utilisés pour l'analyse des circuits. Utilisation sréflexions à partir de la même portée transportant une Cre ou un allèle R26, respectivement, comme témoins négatifs. Traiter lames de contrôle négatives exactement comme diapositives provenant d'animaux doubles hétérozygotes. En outre, inclure une lame de contrôle d'un animal à double hétérozygote mais laisse de côté le réactif TSA (contrôle non amplifiée).
2. Avec un scalpel frais forte enlever l'excès octobre entourant les coupes de tissu et marquer la frontière autour de sections avec un stylo de PAP.
3. Sécher les diapositives pendant 2-3 min à température ambiante (RT). Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. Incuber les lames à la température ambiante pendant 30 minutes dans 0,3% de H ₂ O ₂ solution dans du methanol glacé à étancher activité de peroxydase endogène.
4. Laver 3x avec du PBS pendant 5 min chacun à RT. Incuber pendant 10 minutes dans 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant perméabilisation des tissus. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun.
5. Bloc avec TNB (solution de blocage, 200-300 pi par diapo) pour 30min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Assurez-vous que toutes les sections sont complètement couverts par TNB. Ne laissez pas les diapositives sécher entre les étapes.
6. Égoutter l'excès de tampon de blocage et d'appliquer l'antisérum primaire reconnaissant le traceur (1: 1000 de chèvre anti-WGA pour BL, 1: 15,000 de lapin anti-GFP pour GTT) dilué dans TNB pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Veillez à utiliser un volume suffisant pour couvrir complètement la section de tissu (200-300 pi par diapositive).
   NOTE: Les dilutions d'antisérums primaires recommandés ici peuvent être ajustés.
7. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation.
8. Incuber les sections avec un antisérum biotinylé secondaire reconnaissant l'hôte du premier antisérum (1: 500 cheval anti-IgG de chèvre anti-WGA, 1: 5000 de chèvre anti-IgG de lapin anti-GFP dans TNB pendant 1 heure à température ambiante).
9. Laver 3x avec TNT à température ambiante pendant 5 min chacun avec agitation. Incuber dans 1: 100 streptavidine (SA) conjugué à la peroxydase de raifort (SA-HRP, à condition with le kit) dans TNB pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. Pendant ce temps dégeler la TSA.
10. Diluer TSA 01h50 dans le CST amplification diluant (fourni avec le kit; utiliser le kit TSA pour la visualisation de BL et le kit TSA + pour GTT). Incuber les coupes de tissus dans dilué TSA précisément pour 10 min à température ambiante. Diluer TSA juste avant l'utilisation, idéalement au cours de l'étape de lavage précédente, ne pas utiliser de réactif dilué TSA restant pour de futures expériences; toujours se préparer frais.
11. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. Incuber à 1: 500 Alexa Fluor® 546 de la streptavidine conjugué à TNB pendant 30 min à température ambiante. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation.
12. Incuber pendant 10 min dans une solution bisbenzimide 5% dans du PBS à température ambiante pendant une coloration nucléaire. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. Montez avec Fluromount G et effectuer épifluorescence ou microscopie confocale.
    Dépannage: Efficacité de transfert de traceur dépendra du niveau du locus ROSA26 dans les cellules productrices (déterminée par la ligne du pilote Cre utilisé) d'expression et sur ​​le circuit neuronal analysé (par exemple nombre de neurones produisant le traceur, la convergence etc.). Par conséquent, les dilutions de antisérums primaires recommandés ici peuvent être ajustés pour empêcher signal basse ou d'excès. Le fond doit toujours être analysé en utilisant des lames de contrôle appropriées (voir ci-dessus).

5. τlacZ coloration pour les sections embryonnaires

1. Préparer les tampons et les réactifs nécessaires pour la coloration. Toujours fraîchement préparer le tampon LacZ C avant utilisation.
   1. Préparation de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) de solution stock (40 mg / ml) en ajoutant 40 g de X-gal à 1 ml de 70% de diméthylformamide (DMF). Couvrir de papier d'aluminium et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
   2. Préparer nitro bleu de tétrazolium (NBT) stock solution (50 mg / ml) en ajoutant 50 g de NBT à 1 ml de 70% de DMF. Couvrir de papier d'aluminium et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
   3. Préparez LacZ fixateur en utilisant 80 ul de glutaraldéhyde à 25%, 5 ml de PFA 4%, 20 pl de 1 M de _MgCl2, 100 ul de 500 mM d'EGTA, 1 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH ₂ O jusqu'à une finale volume de 10 ml.
   4. Préparez LacZ en utilisant le tampon A 1 ml de 1 M de _MgCl2, 5 ml de 500 mM d'EGTA, 50 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH ₂ O jusqu'à un volume final de 500 ml.
   5. Préparer LacZ tampon B en utilisant 1 ml de 1 M de _MgCl2, 5 ml d'mM d'EGTA 500, 5 ml de 1% de désoxycholate de sodium, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH ₂ O jusqu'à un volume final de 500 ml.
   6. Préparer LacZ tampon C en ajoutant 10 pi de NBT solution stock et 12,5 pi de X-gal solution stock à 1 ml de tampon B. Faire LacZ frais juste avant utilisation et couvrir de papier d'aluminium.
2. Sécher les lames à la température ambiante au moins pendant 10-15 min (temps préparer les diapositives avec un stylo PAP).
3. Fixer la section avec LacZ fixateur pendant 2 min à température ambiante dans une chambre humidifiée à l'intérieur un produit chimique hotte aspirante. Laver 3 fois avec du PBS supplémenté avec 2 mM de _MgCl2.
4. Rincer les lames avec LacZ tampon A. laver les lames avec LacZ tampon A 3 fois pendant 10 min chacune à la température ambiante. Laver deux fois avec LacZ tampon B pendant 5 minutes chacun. Incuber les lames dans LacZ tampon C à 30-37 ° C pendant 6 heures ou toute la nuit dans une chambre humidifiée.
   NOTE: Ajouter un volume suffisant de LacZ tampon C; diapositives ne doivent pas sécher pendant l'incubation.
5. Après une incubation appropriée laver les lames avec du PBS additionné MgCl2 ₂ mM. Rincer les sections brièvement avec ddH ₂ O. Lamelle avec la glycine de la gélatine de Mayer. Convient pour un microscope optique équipé d'un contraste d'interférence différentiel (DIC) imagerie set-up.

6. Gender et Tracer génotypage

1. Préparer du tampon de lyse de queue en utilisant 1 ml de 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul d'mM d'EGTA 500, 200 ul de SDS à 10%, 400 ul de NaCl 5 M et ddH ₂ O pour obtenir un volume final de 10 ml.
2. Ajouter 500 pi de tampon de lyse queue à chaque tube Eppendorf contenant une biopsie de la queue. Ajouter la proteinase K à une concentration finale de 100 mg / ml. Incuber une nuit sur un agitateur à 55 ° C.
3. Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation. Ajouter 500 ul d'isopropanol au surnageant. Mélanger pendant au moins 5 minutes en inversant les tubes de haut en bas.
4. Spin dans la centrifugeuse à 17 000 g pendant 5 min à température ambiante. Verser le surnageant. Ajouter 200 ul d'éthanol à 70%. Agiter pendant au moins 5 min.
5. Centrifuger à 17 000 g pendant 5 min. Retirer le surnageant avec un Pipetman (ne pas verser off). Sécher la pastille dans une chambre chaude (37 ° C) pendant 15 à 30 min.
6. Resuspendre le culot dans 100 pifaible pH 8,0 TE ou de l'eau à l'aide des conseils de gros calibre filtré. Mettre en 55 ° C pendant 1 h et à 37 ° C pendant la nuit pour une bonne dissolution. Conserver à 4 ° C.
7. Utiliser une pi d'ADN pour la réaction PCR (mélange réactionnel de 50 pi contenant 1 pi de l'ADN de queue, 2,5 pi de DMSO, 22 heures de chaque amorce, 25 uM de chaque dNTP et 1 M de bétaïne). Amorces de PCR pour le génotypage et l'identification de genre sont énumérés dans le tableau des matériaux.

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Résultats

Cette section montre des résultats représentatifs qui peuvent être obtenus en collaboration avec le R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) et la R26-GTT (G FP TT C) allèles. Ici, nous utilisons la R26-BIZ et les allèles R26-GTT pour analyser la maturation des circuits neuronaux qui régissent l'axe de la reproduction. Reproduction chez les vertébrés est centralisé par un petit sous-ensemble de neurones dans l'hypothalamus, qui sécrètent l'hormone...

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Discussion

Exprimant traceurs transsynaptique comme transgènes pour tracer les circuits neuronaux de populations neuronales génétiquement définies présente plusieurs avantages par rapport à l'injection stéréotaxique de traceurs ou des virus neurotopic. Tout d'abord, le traceur est produit comme une protéine endogène et donc ne provoque pas de réponse immunitaire et une voie neuronale sélective peut être analysé en différents animaux avec une reproductibilité élevée. Deuxièmement, parce que ce est un proc...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC