מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Summary

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Abstract

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introduction

מעקב נתיב האנטומי הוא אחד הכלים הנפוצים ביותר בשימוש לפענח את הקשר בין המוח והתנהגות ^1. קידום בטכנולוגיות מעגל התחקות עצביות העניק מדעני מוח עם היכולת לעקוב אחר מעגלים עצביים מאוכלוסיות נוירון זיהו גנטי בעכברים ^2. למרות התקדמות הטכנולוגית אלה נותרים מאתגרים לפענח את היווצרותם של מעגלים עצביים במיוחד בתקופת התבגרות עוברית. סיבה לכך הוא שרוב שיטות המעקב שפותחו עד היום מבוססים על הזרקת stereotaxic של קליעים נותבים transsynaptic או וירוסי neurotropic מהונדסים גנטי (איור 1) ^2,3. בעוד טכניקות אלה להשיג רזולוציה מרחב ובזמן של קישוריות, כמה מגבלות מובנות כגון זריקות נותב מאתגרות מבחינה טכנית למוח המתפתח, שחזור של אתר הזרקה, דלקת פוטנציאלית במקום ההזרקה וimpor ביותרcytotoxicity tantly נגרמת על ידי וירוסי neurotropic להגביל את השימוש בם ^4.

שיטה חלופית היא להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes בעכברים שעברו מוטציה גנטית. יש לנו לאחרונה שונו בטכניקה זו ופיתחתי מערכת בינארית transsynaptic גנטי התחקות למפות את המעגלים העצביים של כל אוכלוסייה עצבית מזוהה גנטי ^5. האסטרטגיה הניסיונית שלנו מבוססת על שני זנים חדשים לדפוק בעכבר, המבטאים גם לקטינים שעורה נותב דו-כיווני (BL) ⁶ או בר רעלנים נותב מדרדר C התמזג GFP (GTT) ⁷ מלוקוס ROSA 26 לאחר Cre תיווך רקומבינציה. כאן אנו משמשים זני עכבר אלו כדי להביע את BL וGTT בתאי עצב המייצרים kisspeptin, neuropeptide שמעורב בויסות ההתבגרות של ציר הרבייה ^8,9 באופן סלקטיבי. אנו מראים כי טכניקה זו היא מתאימה כדי לחזות את ההתפתחות והתבגרות של נשיקהמעגלים עצביים peptin במהלך התפתחות עוברית של מוח העכבר נקבת ^5.

אסטרטגית רבייה

R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) והקווים נותב R26-GFP-TTC (GTT) הם לדפוק בזנים ⁵ שנושאים אללים ROSA26 רקומביננטי. R26-BIZ ואללים R26-GTT הם תעתיק שקטים בשל נוכחותם של איתות חזקה תעתיק תחנה, שמעוטרת בשני אתרי loxP ^5. ביטוי של transgene BIZ וGTT מופעל על ידי ההסרה בתיווך Cre של אות תחנת תעתיק. ניתן להשתמש אללים R26-BIZ וR26-GTT באופן עצמאי על ידי פשוט חצייה עם קו נהג Cre. להטרוזיגוטיים בעלי חיים ניתוח לאללים Cre וR26 המתאימים ניתן להשתמש. המלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, צריכה לשמש כקבוצת ביקורת. לחלופין, אפשר גם ליצור triple לדפוק בבעלי חיים שנשאו את אללים Cre, R26-BIZ וR26-GTT, אולם זה יחייב צלב אחד נוסף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: אתיקה הצהרה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של אוניברסיטת המבורג ובאוניברסיטת Saarland.

1. הכנה וקיבוע של רקמה העוברית

1. מסדרים את כל הציוד הדרוש ללנתח את העוברים ולהכין פתרונות לקיבעון הבא של הרקמה לפני להקריב בעלי החיים.
   הערה: תמיד להכין פתרון paraformaldehyde 4% טריים (PFA) (4% PFA ב 0.1 M מלוח פוספט (PBS), להתאים את ה- pH 7.4).
2. להרדים נקבת עכבר בהריון בעיתוי בנוהל שאושר מבחינה אתית.
3. העבר את העכבר על גבי פלטפורמה. להרטיב את הצד הגחוני של הבטן עם 70% אתנול ו לעשות חתך אנכי באמצעות מספריים חדים לחשוף את חלל הבטן.
4. זהה את השרשרת העוברית ולמשוך אותו החוצה מלקחיים בוטים באמצעות זהירות ולמקם אותו לתוך PBS קר כקרח.
5. הסר את העוברים הבודדים מהשרשרת העוברית באמצעות מספריים ומלקחיים בסדר. הסרה של רקמה נוספת סביב העוברים ולשטוף אותם בPBS קר כקרח.
6. לקחת ביופסיה זנב קטנה (לפני העברת העובר לPFA) ודגירה אותו במאגר תמוגה זנב לזיהוי המין וgenotyping אלל נותב PCR.
7. תתחיל מהעובר בצד לרוחב ביותר ולהעביר כל עובר בנפרד לתוך צינור המכיל 4% PFA קר כקרח על קרח על שייקר.
8. משרים את העוברים בגיל צעיר יותר E13.5 או עבור 1.5 שעות על קרח עם רעד קבוע. משרים את העוברים בE14.5 הגיל וE15.5 תמורת 2.5 שעות על קרח עם רעד קבוע.
9. לE16.5 גיל עוברים או יותר, לערוף ולהסיר את העור החיצוני לפני השריית הראש בפתרון PFA. ראשי עוברי E16.5 יכולים להיות טבולים תמורת 4.5 שעות על קרח עם רעד קבוע.
10. לאחר הקיבוע מתאים, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. מעביר את העוברים לתוך סוכרוז 30% בפתרון PBS על 4 מעלות צלזיוס עד שהם שוקעיםלתחתית.

2. הקפאה

1. לסדר את כל החומרים הדרושים לפני שמתחיל את תהליך ההקפאה: cryo-עובש, cryo-כפפות, מלקחיים אנטומולוגיה במשקל הנוצה, בטוש ומתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר)
2. תווית cryo-העובש עם סמן אלכוהול עמיד קבוע (להזכיר את הכיוון של רקמות, תאריך וגנוטיפ). הכן רפש של קרח יבש כתוש ו 100% אתנול בדלי קרח. מניחים כוס זכוכית בתוך המכיל איזופנטאן. חכה 10 דקות לאיזופנטאן להתקרר.
3. בינתיים להסיר את הרקמה מפתרון סוכרוז, נגב את סוכרוז העודף סביב הרקמות באמצעות מגבוני מעבדה. העברת הרקמה לתוך cryo-עובש שכותרתו מראש עם אוקטובר מספיק כדי לכסות את הרקמה. הימנע מכל בועות אוויר ב- OCT; במיוחד סביב הרקמה.
4. כוון את הרקמה ב אוקטובר באמצעות מלקחיים אנטומולוגיה במשקל נוצה, כדי למנוע נזק לרקמות. התחל הקפאה על ידי העברת cryo-molד לאמבטיה איזופנטאן מקורר מראש. לא להתיז איזופנטאן ל- OCT כפי שהוא לא להקפיא כראוי. עטוף את הדגימות ברדיד אלומיניום ולאחסן ב -80 ° C.

3. Cryosectioning

1. לחתוך 14 מיקרומטר חלקים סידוריים דקים בסדרה "חמש באמצעות cryostat ולאסוף בשקופיות זכוכית SuperFrost® פלוס עבור immunofluorescence ניתוח (IF). אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד מנוצל.

4. הדמיה Tracer שימוש בפרוטוקול Tyramide איתותים ההגברה (TSA)

1. הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ טריס-NaCl-Tween (TNT) ביום השימוש.
   1. הכן חיץ TNT באמצעות 100 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 7.5, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH ₂ O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 500 μl של Tween 20 בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. הוסף את Tween 20 לאט ולשטוף את פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לוודא שכל Tween 20 הוא בפתרון.
   2. הכן טריס-NaCl-חסימת חיץ (TNB) באמצעות של 1 M טריס-HCl 100 מיליליטר 7.5 pH, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH ₂ O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 5 גרם חסימה מגיב (מסופק עם ערכה) לאט במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון בהדרגה ל -55 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף לפזר מגיב חסימה לחלוטין (זה לא צריך לקחת יותר מ30-60 דקות). כדי להשיג חימום אחיד להשתמש אמבט מים ב 55 ° C. הפתרון יופיע חלבי. להביא את הפתרון לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
   3. מחדש מגיב ביוטין tyramide (מצורף לערכה) בכיתה HPLC-ביולוגיה מולקולרית / DMSO. תלוי איזה ערכה משמשת את הכמות המתאימה של DMSO עשויה להשתנות. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: סעיפים מבעלי חיים הטרוזיגוטיים לאללים Cre וR26 המתאימים יכולים לשמש לניתוח מעגל. שימוש שלections מהמלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, כפקדים שליליים. פנק את שקופיות בקרה שליליות בדיוק כמו שקופיות מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים. בנוסף, כולל שקופיות שליטה אחד מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים אבל להשאיר את מגיב TSA (שליטת unamplified).
2. באמצעות אזמל טרי חד להסיר אוקטובר העודף המקיף את חלקי רקמות ולסמן את הגבול סביב החלקים עם עט PAP.
3. ייבש את השקופיות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% פתרון H ₂ O ₂ במתנול קר כקרח כדי להרוות את פעילות peroxidase אנדוגני.
4. 3x לשטוף עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. דגירה של 10 דקות ב 0.5% Triton-X 100 בPBS לpermeabilization רקמות. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד.
5. בלוק עם TNB (חסימת פתרון, 200-300 μl לכל שקופית) במשך 30דקות ב RT בתא humidified. ודא שכל החלקים מכוסים לחלוטין על ידי TNB. אל תתנו לשקופיות להתייבש בין הצעדים.
6. מסננים את חיץ חסימת עודף ולהחיל antiserum העיקרי הכרה נותב (1: 1,000 העז נגד WGA לBL, 1: 15,000 ארנב נגד GFP לGTT) מדולל בTNB לשעה 2 ב RT או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד להשתמש נפח מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה (200-300 μl לכל שקופית) לחלוטין.
   הערה: דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים.
7. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה.
8. דגירה הקטעים עם antiserum המשני biotinylated הכרה בשורה של antiserum הראשון (1: IgG 500 הסוס האנטי-העז לאנטי-WGA, 1: IgG נגד ארנב העז 5,000 לאנטי-GFP בTNB עבור שעה 1 ב RT).
9. 3x לשטוף עם TNT ב RT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה ב 1: 100 streptavidin (SA) peroxidase חזרת -conjugated (SA-HRP wi, ובלבדth הערכה) בTNB למשך 30 דקות ב RT בתא humidified. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. בינתיים להפשיר TSA.
10. לדלל TSA 01:50 בdiluent ההגברה TSA (מצורפת לערכה; להשתמש בערכת TSA להדמיה של BL וערכת TSA + לGTT). דגירה סעיפי הרקמות בTSA המדולל לבדיוק 10 דקות ב RT. לדלל TSA רק לפני השימוש, באופן אידיאלי בשלב הכביסה הקודם, לא להשתמש בכל מגיב TSA מדולל שנותר לניסויים עתידיים; תמיד להכין טרי.
11. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה עם 1: 500 המצומד Alexa Fluor® 546 streptavidin בTNB למשך 30 דקות ב RT. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה.
12. דגירה של 10 דקות ב 5% פתרון bisbenzimide PBS ב RT עבור מכתים גרעיני. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. הר עם Fluromount G ולבצע epifluorescence או confocal.
    פתרון בעיות: יעילות של העברה נותב תהיה תלויה ברמת הביטוי של מוקד ROSA26 בתאים המייצרים (שנקבע על ידי קו נהג Cre בשימוש) ועל המעגלים העצביים ניתחה (למשל מספר הנוירונים הפקה נותב, וכו 'התכנסות). לכן דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים כדי למנוע אות נמוכה או עודפת. רקע תמיד צריך לנתח באמצעות שקופיות בקרה מתאימות (ראה לעיל).

5. τlacZ מכתים לסעיפים עובריים

1. הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ C LacZ לפני השימוש.
   1. הכן 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) פתרון מניות (40 מ"ג / מיליליטר) על ידי הוספת 40 גרם של X-gal עד 1 dimethylformamide מיליליטר 70% (DMF). מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
   2. הכן tetrazolium הכחול ניטרו (NBT) stפתרון Ock (50 מ"ג / מיליליטר) על ידי הוספת 50 גרם של NBT לDMF 1 מיליליטר 70%. מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
   3. הכן LacZ קוֹבֵעַ באמצעות 80 μl של glutaraldehyde 25%, 5 מיליליטר של 4% PFA, 20 μl של 1 M MgCl _2, של 500 מ"מ EGTA 100 μl, 1 מיליליטר של חיץ pH M פוספט 1 7.4 וDDH ₂ O עד גמר נפח של 10 מיליליטר.
   4. הכן LacZ חיץ 1 מיליליטר באמצעות של 1 M MgCl _2, 5 מיליליטר של 500 מ"מ EGTA, 50 מיליליטר של 1 M pH חיץ פוספט 7.4 וDDH ₂ O עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
   5. הכן B חיץ LacZ באמצעות 1 מיליליטר של 1 M MgCl _2, 5 מיליליטר של 500 מ"מ EGTA, 5 deoxycholate מיליליטר של 1% נתרן, 10% NP-40 100 מיליליטר, 50 מיליליטר של חיץ פוספט pH 1 M 7.4 וDDH ₂ O עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
   6. הכן חיץ C LacZ על ידי הוספת 10 μl של פתרון מניות NBT ו12.5 μl של מניות פתרון X-gal עד 1 מיליליטר של חיץ B. LacZ הפוך טרי רק לפני השימוש ומכסים ברדיד אלומיניום.
2. ייבש את השקופיות ב RT לפחות במשך 10-15 דקות (בינתיים להכין שקופיות עם עט PAP).
3. לתקן את הסעיף עם LacZ קוֹבֵעַ למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר בתא humidified בתוך קטר-מנדף כימי. לשטוף 3 פעמים עם PBS בתוספת 2 מ"מ MgCl _2.
4. יש לשטוף את השקופיות עם א 'חיץ LacZ שטוף את השקופיות עם LacZ חיץ 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב RT. לשטוף 2 פעמים עם החיץ B LacZ במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות בC חיץ LacZ ב30-37 מעלות צלזיוס במשך שעה 6 או לילה בתא humidified.
   הערה: הוספת נפח מספיק של חיץ C LacZ; שקופיות לא צריכים להתייבש במהלך דגירה.
5. לאחר הדגירה מתאימה לשטוף את השקופיות עם PBS בתוספת 2 מ"מ MgCl _2. יש לשטוף את החלקים בקצרה עם DDH ₂ O. Coverslip עם ג'לטין גליצין של מאיר. מתאים למיקרוסקופ אור מצויד בסט-אפ הדמיה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC).

6. Gendאה וGenotyping Tracer

1. הכן מאגר תמוגה זנב באמצעות 1 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 8.5, של 500 מ"מ EGTA 100 μl, 200 μl של 10% SDS, 400 μl של 5 M NaCl וDDH ₂ O כדי לפצות נפח סופי של 10 מיליליטר.
2. הוסף 500 μl של חיץ תמוגה זנב לכל צינור Eppendorf המכיל ביופסית זנב. להוסיף K proteinase לריכוז סופי של 100 מ"ג / מיליליטר. דגירה הלילה על שייקר ב 55 ° C.
3. צנטריפוגה דגימות 17,000 XG במשך 10 דקות ב RT. מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות חדש. הוסף 500 μl של isopropanol לsupernatant. מערבבים במשך לפחות 5 דקות על ידי היפוך הצינורות למעלה ולמטה.
4. ספין בצנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 5 דקות בRT. יוצקים את supernatant. הוסף 200 μl של 70% אתנול. לנער במשך 5 דקות לפחות.
5. צנטריפוגה ב17,000 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant עם Pipetman (לא לשפוך את). ייבש את הכדור בתא חם (37 מעלות צלזיוס) במשך 15-30 דקות.
6. גלולה גלולה ב100 μlpH הנמוך TE 8.0 או מים באמצעות טיפים רחבים נשא מסוננים. שים ב -55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ועל 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להמסה נכונה. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
7. השתמש μl 1 של ה- DNA לתגובת PCR (תערובת תגובת 50 μl המכילה 1 μl של DNA זנב, 2.5 μl DMSO, 10:00 של כל צבע יסוד, 25 מיקרומטר של כל dNTP, וbetaine 1M). פריימרים PCR לgenotyping וזיהוי מין רשומים בטבלת חומרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סעיף זה מציג תוצאות נציג שניתן להשיג בעבודה עם R26-BIZ (Z RES-τlac L- אני B) וR26-GTT (G FP- TT C) אללים. כאן אנו משתמשים R26-BIZ ואללים R26-GTT לנתח את ההבשלה של המעגלים העצביים המסדירים את ציר הרבייה. הרבייה בבעלי החוליות נשלטת מרכזית על ידי קבוצה קטנה של תאי עצב בהי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יש להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes להתחקות המעגלים העצביים של אוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטי יש מספר יתרונות בהשוואה להזרקת stereotaxic של קליעים נותבים או וירוסי neurotopic. ראשית, נותב מופק כחלבון אנדוגני ולכן אינו מפיק כל תגובה חיסונית ומסלול עצבי סלקטיבית ניתן לנתח ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC