Условный Генетическая Transsynaptic Трассировка в мозге эмбриональных мыши

Резюме

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Аннотация

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Введение

Трассировка Анатомический путь является одним из наиболее часто используемых инструментов, чтобы расшифровать связь между мозгом и поведением ^1. Продвижение в нейронных цепей отслеживания технологий даровал неврологов с возможностью отслеживания нейронных цепей из генетически определенных популяций нейронов у мышей ^2. Несмотря на эти технические достижения остается сложной, чтобы разгадать образование нейронных цепей, особенно во время эмбрионального созревания. Это потому, что большинство методов отслеживания разработанных к настоящему основаны на стереотаксической инъекции transsynaptic индикаторов или генетически модифицированных нейротропных вирусов (рис 1) ^2,3. Хотя эти методы достижения пространственного и временного разрешения подключения, присущие существенные ограничения, такие как технически сложных трассирующих вливаний в развивающемся мозге, воспроизводимость в месте инъекции, потенциал воспаление в месте инъекции и наиболее важtantly цитотоксичность вызвано нейротропных вирусов ограничить их использование ^4.

Альтернативный метод заключается в выражении transsynaptic индикаторов, как трансгенов в генетически измененных мышей. Мы недавно изменили эту технику и разработали двойную систему отслеживания генетических transsynaptic для отображения нейронных цепей любого генетически определенных нейронов населения ^5. Наши экспериментальные стратегия основана на двух новых нокаут в линиях мышей, которые выражают либо двунаправленный Tracer ячменя лектин (BL) ⁶ или ретроградная Tracer столбнячный токсин фрагмента C слит с GFP (GTT) ⁷ из ROSA 26 локуса после Cre-опосредованного рекомбинация. Здесь мы использовали эти штаммы мыши, чтобы выборочно выразить BL и GTT в нейронах, которые производят kisspeptin, нейропептид, который участвует в регуляции созревания репродуктивной оси ^8,9. Мы показываем, что этот метод подходит для визуализации развитие и созревание поцелуяпептин нейронная схема во время эмбрионального развития женского мозга мыши ^5.

Стратегия Разведение

R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) и R26-GFP-ТТЦ (GTT) трассирующие линии плей-штаммов ^5, которые несут рекомбинантные аллелей ROSA26. R26-BIZ и аллели R26-GTT транскрипционно молчание в связи с наличием сильного транскрипции стоп-сигнала, который в сопровождении двух LoxP сайтов ^5. Выражение бизнесе и GTT трансгена активируется с помощью Cre-опосредованного удалени транскрипции стоп-сигналом. Аллели R26-BIZ и R26-GTT может использоваться самостоятельно, просто пересечения с линией водителя CRE. Для анализа животных, гетерозиготных по соответствующим Cre и R26 аллели могут быть использованы. Однопомётники несущие один Cre или один R26 аллель, соответственно, должны быть использованы в качестве контрольных. В качестве альтернативы, также возможно, чтобы генерировать тriple стучать в животных, несущих аллели Cre, R26-Biz и R26-ГЦГ, однако это потребует еще один крест.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этика заявление: Процедуры, связанные с животными предметы были утверждены по животноводству, комиссии университета Гамбурга и Университета земли Саар.

1. Подготовка и фиксация эмбриональной ткани

1. Организовать все оборудование, необходимое для рассекать из эмбрионов и приготовления растворов для последующей фиксации ткани до принесения в жертву животных.
   Примечание: Всегда подготовить свежие 4% параформальдегида (PFA) раствор (4% PFA в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе (PBS), доведения рН до 7,4).
2. Эвтаназии приуроченный беременной женщины мышь с этической точки зрения утвержденной процедурой.
3. Перевести мыши на платформу. Смочите брюшной стороне живота с 70% этанола и сделать вертикальный разрез, используя острые ножницы, чтобы разоблачить брюшной полости.
4. Определить эмбриональных цепь и вытащить его тщательно тупыми щипцами и поместить его в ледяной PBS.
5. Извлеките отдельные эмбрионы изэмбриональных цепи с использованием тонких ножницы и пинцет. Удаление лишних тканей вокруг эмбрионов и мыть их в ледяной PBS.
6. Возьмите небольшой хвост биопсии (перед передачей эмбриона в PFA) и инкубировать ее в хвост буфера для лизиса для гендерной идентификации и трассирующими аллель генотипирования ПЦР.
7. Начало из эмбриона на самых боковой стороне и передачи каждого эмбриона отдельно в пробирку, содержащую ледяной 4% PFA на льду на шейкере.
8. Замочите эмбрионов в возрасте E13.5 или моложе в течение 1,5 ч на льду с постоянной тряски. Замочите эмбрионов в возрасте E14.5 и E15.5 в течение 2,5 ч по льду с постоянной тряски.
9. Для эмбрионы возраста E16.5 и старше, обезглавить и снимите внешнюю оболочку до замачивания голову в растворе PFA. Главы эмбрионов E16.5 можно замочить в течение 4,5 ч по льду с постоянной тряски.
10. После соответствующей фиксации, мыть эмбрионов три раза охлажденным на льду PBS. Передача эмбрионов в 30% сахарозы в растворе PBS при 4 ° С, пока они не тонутна дно.

2. Замораживание

1. Организовать все необходимые материалы, прежде чем начать процесс замораживания: крио-плесени, крио-перчатки, в полулегком энтомология щипцы, Маркер и температура составные оптимального раскроя (OCT)
2. Этикетка крио-формы с постоянным употреблением алкоголя маркер устойчивости (говоря ориентацию ткани, дата и генотипа). Подготовьте слякоть измельченного сухого льда и 100% этанола в ведерке со льдом. Поместите стеклянный стакан внутри, содержащий изопентан. Подождите 10 минут для изопентан, чтобы остыть.
3. В то же время удаления ткани из раствора сахарозы, вытереть излишки сахарозу вокруг ткани с помощью лабораторных салфетки. Передача ткани в предварительно меченных крио-пресс-формы с достаточным октября, чтобы покрыть ткань. Избегайте пузырьков воздуха в центре развертывания; особенно вокруг ткани.
4. Расположите ткань в октябре помощью полулегком энтомологии щипцы, чтобы избежать повреждения тканей. Начните замораживания путем передачи крио-мольд в предварительно охлажденный изопентан бане. Не допускайте попадания изопентан в октябре в качестве не замерзнет должным образом. Оберните образцы в алюминиевую фольгу и хранить при температуре -80 ° C.

3. Cryosectioning

1. Вырезать 14 мкм тонкие серийных срезов в серии «пять с помощью криостата и собирать на SuperFrost® Plus стеклах для иммунофлуоресценции анализа (IF). Хранить слайды при температуре -80 ° С до использования.

4. Tracer визуализация Используя (TSA) Протокол Tyramide усиление сигнала

1. Подготовка буферов и реагентов, необходимых для окрашивания. Всегда свеже подготовить Трис-NaCl-твин (ТНТ) буфер в день использования.
   1. Подготовка TNT буфер с помощью 100 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,5, 30 мл 5 М NaCl и DDH ₂ O до конечного объема 1 л Добавить 500 мкл Tween 20 с использованием 1 мл пипетки. Добавить в анимации 20 медленно и промойте пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что все Твин 20 вРешение.
   2. Подготовка Трис-NaCl-блокировки (TNB), используя буфер 100 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,5, 30 мл 5 М NaCl и DDH ₂ O до конечного объема 1 л Добавить 5 г блокирующий реагент (снабжена Комплект) медленно небольшими порциями в буфер при перемешивании. Нагрейте раствор постепенно до 55 ° C при непрерывном перемешивании до полного растворения блокирующего реагента (это не должно занять больше времени, чем 30-60 мин). Для достижения гомогенного нагрева использовать водяную баню при 55 ° С. Решение появится молочный. Доведите раствор до комнатной температуры перед использованием. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
   3. Восстановить биотин tyramide реагента (входит в комплект) в области молекулярной биологии / ВЭЖХ-класса ДМСО. В зависимости от которых набор используется соответствующее количество может варьироваться в ДМСО. Хранить исходный раствор при 4 ° С.
      Примечание: Секции из животных, гетерозиготных по соответствующим Cre и R26 аллелей могут быть использованы для анализа схем. Использование сотражений от помета, осуществляющих один Cre или один R26 аллель, соответственно, в качестве отрицательного контроля. Лечить негативные слайды управления так же, как слайды из двойных гетерозиготных животных. Кроме того, включать в себя один управления слайд из двойной гетерозиготной животных, но оставить в стороне реагента TSA (неусиленных управления).
2. Использование острый свежий скальпель удалить лишнюю октября окружающих срезов тканей и отметить границу вокруг участков с PAP пера.
3. Сушат слайды в течение 2-3 мин при комнатной температуре (RT). Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 30 мин в 0,3% H ₂ O ₂ решения в ледяной метанола, чтобы утолить активности эндогенной пероксидазы.
4. Промыть 3 раза с PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре. Инкубируют в течение 10 мин в 0,5% Triton X-100 в PBS на ткани проницаемости. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый.
5. Блок с ТНБ (блокирование решение, 200-300 мкл на слайд) для 30мин при комнатной температуре во влажной камере. Убедитесь, что все разделы полностью покрыты ТНБ. Не позволяйте слайды высохнуть в период между шагами.
6. Слить избыток блокирующий буфер и применить основную антисыворотки, распознающий Tracer (1: 1000 козьего анти-WGA для BL, 1: 15000 кроличье анти-GFP для GTT), разбавленного в TNB в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Убедитесь в том, чтобы использовать достаточный объем, чтобы полностью покрыть срезы ткани (200-300 мкл на слайд).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В первую очередь разведения сыворотки иммунные рекомендуемые здесь, возможно, придется быть скорректированы.
7. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании.
8. Инкубируйте участки с биотинилированного вторичного антисыворотки признании множество первой антисыворотки (1: 500 лошади анти-козел IgG для анти-WGA, 1: 5000 козьего антитела против кроличьего IgG для анти-GFP в TNB в течение 1 ч при комнатной температуре).
9. Промыть 3 раза с ТНТ при комнатной температуре в течение 5 мин каждый при перемешивании. Выдержите в 1: 100 стрептавидином (SA) -conjugated пероксидазой хрена (SA-HRP, при условии, Wiго набора) в TNB в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый. Между тем оттепели АСП.
10. Развести АСП 1:50 в АСП усиления разбавителя (входит в комплект, используйте комплект TSA для визуализации BL и набор TSA + для GTT). Инкубируйте срезов ткани в разбавленном АСП именно по 10 мин при комнатной температуре. Развести АСП непосредственно перед использованием, в идеале в течение предыдущего этапа промывки, не используйте оставшуюся разбавленный TSA реагент для будущих экспериментов; всегда готовятся свежие.
11. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании. Инкубируют при 1: 500 Alexa Fluor® 546 стрептавидин конъюгата в TNB в течение 30 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании.
12. Инкубировать в течение 10 мин в 5% растворе bisbenzimide в PBS при комнатной температуре в течение ядерного окрашивания. Вымойте слайды при комнатной температуре в 3 раза с TNT в течение 5 мин каждый при перемешивании. Установите с Fluromount G и выполнять эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
    Устранение неполадок: Эффективность передачи меченых атомов будет зависеть от уровня экспрессии локуса ROSA26 в продуцирующих клеток (определяется строке драйвера Cre используется) и на нервной цепи проанализированы (например, количество нейронов, производящих Tracer, сходимость и т.д.). Поэтому первичные разведения антисыворотки, рекомендованные здесь может должны быть скорректированы, чтобы предотвратить низкий или избыточного сигнала. Фон всегда должны быть проанализированы с использованием соответствующих слайдов управления (смотри выше).

5. τlacZ Окрашивание для эмбрионального разделах

1. Подготовка буферов и реагентов, необходимых для окрашивания. Всегда свеже подготовить буфера C LacZ перед использованием.
   1. Подготовка 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-GAL) маточного раствора (40 мг / мл) с добавлением 40 г X-гал в 1 мл 70% диметилформамида (ДМФ). Накрыть алюминиевой фольгой и хранят при -20 ° С в течение длительного хранения.
   2. Подготовка нитро тетразолия (NBT) улРаствор Ока (50 мг / мл) с добавлением 50 г NBT до 1 мл 70% DMF. Накрыть алюминиевой фольгой и хранят при -20 ° С в течение длительного хранения.
   3. Подготовка LacZ фиксирующий с помощью 80 мкл 25% глутарового альдегида, 5 мл 4% PFA, 20 мкл 1 М MgCl _2, 100 мкл 500 мМ EGTA, 1 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,4, и DDH ₂ O до конечной Объем 10 мл.
   4. Подготовка LacZ буфера А с помощью 1 мл 1 М MgCl _2, 5 мл 500 мМ EGTA, 50 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,4, и DDH ₂ O до конечного объема 500 мл.
   5. Подготовка LacZ буфера B с помощью 1 мл 1 М MgCl _2, 5 мл 500 мМ EGTA, 5 мл 1% дезоксихолат натрия, 100 мл 10% NP-40, 50 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,4, и DDH ₂ O до конечного объема 500 мл.
   6. Подготовка LacZ буфера C, добавляя 10 мкл НБТ маточного раствора и 12,5 мкл X-гал маточного раствора в 1 мл LacZ буфере В. делают свежевыжатый непосредственно перед использованием и накрыть алюминиевой фольгой.
   7. Высушите слайды при комнатной температуре, по крайней мере в течение 10-15 мин (пока подготовить слайды с PAP пера).
   8. Закрепить секции с фиксатором в течение LacZ 2 мин при комнатной температуре во влажной камере внутри химического вытяжного шкафа. Промыть 3 раза PBS с добавлением 2 мМ MgCl _2.
   9. Промыть слайды с LacZ буфером А. Вымойте слайды с LacZ буфер А 3 раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре. Промыть два раза LacZ буфера В в течение 5 мин каждый. Инкубируйте слайды в LacZ буфера С на 30-37 ° С в течение 6 ч или на ночь во влажной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить достаточного объема LacZ буфера С; слайды не должны высыхать во время инкубации.
   10. После соответствующей инкубации мыть слайды с PBS с добавлением 2 мМ MgCl _2. Промыть разделах кратко с DDh ₂ O. Покровное с глицин желатина Майера. Подходит для светового микроскопа, оснащенного дифференциальный интерференционный контраст (DIC) изображений настройки.

   6. Gendэ и Tracer генотипирование

   1. Подготовьте хвост буфера для лизиса с помощью 1 мл 1 М Трис-HCl рН 8,5, 100 мкл 500 мМ EGTA, 200 мкл 10% SDS, 400 мкл 5 М NaCl и DDH ₂ O, чтобы до конечного объема 10 мл.
   2. Добавить 500 мкл буфера для лизиса хвоста каждой пробирке Эппендорфа, содержащую хвостовой биопсии. Добавить протеиназы К до конечной концентрации 100 мг / мл. Инкубируют в течение ночи на качалке при 55 ° C.
   3. Центрифуга образцов при 17000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача супернатант к новому центрифужную пробирку. Добавить 500 мкл изопропанола, супернатант. Смешайте в течение по крайней мере 5 мин путем инвертирования трубы вверх и вниз.
   4. Спина в центрифуге при 17000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Слейте надосадочную. Добавить 200 мкл 70% этанола. Встряхнуть, по крайней мере, 5 мин.
   5. Центрифуга при 17000 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант с Pipetman (не сливать). Сушат гранулы в теплой камере (37 ° C) в течение 15-30 мин.
   6. Ресуспендируют осадок в 100 мклнизким TE pH 8,0 или воды с использованием широким отверстием отфильтрованные советы. Поместить в 55 ° C в течение 1 часа и при 37 ° С в течение ночи для правильного растворения. Хранить при 4 ° С.
   7. Используйте 1 мкл ДНК для ПЦР (50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл хвост ДНК, 2,5 мкл ДМСО, 10 вечера каждого праймера, 25 мкм каждого дНТФ и 1М бетаин). ПЦР праймеры для генотипирования и гендерной идентификации приведены в таблице материалов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом разделе показаны репрезентативные результаты, которые могут быть получены работе с R26-Biz (B L- Я RES-τlac Z) и R26-GTT (G FP- TT C) аллелей. Здесь мы используем R26-BIZ и аллелей R26-ГЦГ проанализировать созревание нейронных цепей, регулирующих репродуктивной систе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Выражая transsynaptic индикаторов, как трансгенов проследить нейронных цепей генетически определенных популяций нейронов имеет ряд преимуществ по сравнению с стереотаксической инъекции индикаторов или NEUROTOPIC вирусов. Во-первых, трассировщик получают в качестве эндогенного белка и, следов?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC