Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Riepilogo

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Abstract

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introduzione

Anatomico percorso tracciato è uno degli strumenti più comunemente utilizzati per decifrare il rapporto tra cervello e comportamento ^1. Avanzamento in tecnologie dei circuiti neurali tracciatura ha concesso neuroscienziati con la possibilità di ricostruire i circuiti neurali da popolazioni di neuroni geneticamente identificati nei topi ^2. Nonostante questi progressi tecnici rimane difficile da svelare la formazione dei circuiti neurali soprattutto durante la maturazione embrionale. Questo perché la maggior parte dei metodi di tracciamento sviluppati fino ad oggi sono basate su iniezione stereotassica di rivelatori transsynaptic o virus neurotropici geneticamente modificati (Figura 1) ^2,3. Mentre queste tecniche raggiungono risoluzione spaziale e temporale della connettività, alcuni limiti intrinseci, come tecnicamente impegnativi iniezioni traccianti nel cervello in via di sviluppo, la riproducibilità del sito di iniezione, potenziale infiammazione al sito di iniezione e più importanza citotossicità causata da virus neurotropici limitare il loro utilizzo ^4.

Un metodo alternativo è quello di esprimere i traccianti transsynaptic come transgeni in topi geneticamente modificati. Abbiamo recentemente modificato questa tecnica e sviluppato un sistema binario transsynaptic genetico analisi per mappare i circuiti neurali di qualsiasi popolazione neuronale geneticamente identificato ^5. La nostra strategia sperimentale si basa su due nuovi ceppi di topi knock-in, che esprimono sia la lectina bidirezionale tracciante orzo (BL) ⁶ o il tracciante retrogrado tossina tetanica frammento C fusa a GFP (GTT) ⁷ dalla ROSA 26 locus dopo Cre-mediata ricombinazione. Qui abbiamo usato questi ceppi di topi per esprimere selettivamente BL e GTT in neuroni che producono kisspeptin, un neuropeptide che è implicato nella regolazione della maturazione dell'asse riproduttivo ^8,9. Dimostriamo che questa tecnica è adatta per visualizzare lo sviluppo e la maturazione del baciopeptin circuiti neurali durante lo sviluppo embrionale del topo cervello femminile ^5.

Strategia di allevamento

La R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e R26-GFP-TTC (GTT) linee traccianti sono knock-in ceppi ⁵ che portano alleli ROSA26 ricombinanti. La R26-BIZ e gli alleli R26-GTT sono trascrizionalmente silente a causa della presenza di un forte segnale di arresto della trascrizione, che è affiancato da due siti loxP ^5. Espressione del transgene BIZ e GTT è attivato dalla rimozione Cre-mediata del segnale di arresto trascrizionale. Gli alleli R26-BIZ e R26-GTT possono essere utilizzati indipendentemente attraversando semplicemente con una linea pilota Cre. Per gli animali di analisi eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 può essere utilizzato. Nidiata che trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, dovrebbero essere utilizzati come controlli. In alternativa, è anche possibile generare tRiple knock-in animali portatori degli alleli Cre, R26-BIZ e R26-GTT, tuttavia ciò richiederà una croce supplementare.

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Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato il benessere degli animali dell'Università di Amburgo e l'Università di Saarland.

1. Preparazione e fissaggio del tessuto embrionale

1. Disporre tutte le attrezzature necessarie per sezionare gli embrioni e preparare soluzioni per il successivo fissaggio del tessuto prima di sacrificare gli animali.
   NOTA: preparare sempre una soluzione fresca 4% paraformaldeide (PFA) (4% PFA in 0.1 M tampone fosfato salino (PBS), regolare il pH a 7,4).
2. Euthanize cronometrato femmina incinta mouse con una procedura eticamente approvati.
3. Trasferire il mouse su una piattaforma. Bagnare la parte ventrale dell'addome con il 70% di etanolo e fare una incisione verticale usando forbici affilate per esporre la cavità addominale.
4. Identificare la catena embrionale ed estrarlo con cautela utilizzando una pinza smussato e metterlo in ghiaccio freddo PBS.
5. Rimuovere i singoli embrioni dala catena embrionale con le forbici sottili e pinze. Rimuovere il tessuto in più intorno gli embrioni e lavarli in ghiacciata PBS.
6. Prendete una piccola biopsia coda (prima di trasferire l'embrione in PFA) e incubare in coda tampone di lisi per l'identificazione di genere e tracciante allele genotipizzazione PCR.
7. Avviare dall'embrione al lato più laterale e trasferire ogni embrione separatamente in una provetta contenente ghiacciata 4% PFA su ghiaccio su un agitatore.
8. Immergere gli embrioni all'età di E13.5 o più giovani per 1,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione. Immergere gli embrioni a E14.5 età e E15.5 per 2,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione.
9. Per E16.5 embrioni età o più anziani, decapitate e togliere la pelle esterna prima immersione della testa in soluzione PFA. Capi di embrioni E16.5 possono essere messi a bagno per 4,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione.
10. Dopo la fissazione del caso, lavare gli embrioni tre volte con PBS freddo. Trasferire gli embrioni in 30% di saccarosio in soluzione PBS a 4 ° C fino affondanoal fondo.

2. Congelamento

1. Disporre tutti i materiali necessari prima di iniziare il processo di congelamento: crio-muffa, crio-guanti, pinze piuma entomologia, pennarello e composti temperatura di taglio ottimale (OCT)
2. Etichettare la crio-stampo con un pennarello resistente all'alcool permanente (citare l'orientamento del tessuto, la data e il genotipo). Preparare una granita di ghiaccio secco tritato e il 100% di etanolo in un secchio di ghiaccio. Posizionare un bicchiere di vetro all'interno contenente isopentano. Attendere 10 minuti per il isopentano raffreddare.
3. Nel frattempo rimuovere il tessuto dalla soluzione di saccarosio, eliminare l'eccesso di saccarosio in tutto il tessuto con salviette di laboratorio. Trasferire il tessuto in una pre-etichettati crio-stampo con sufficiente ottobre per coprire il tessuto. Evitare eventuali bolle d'aria nel ottobre; soprattutto intorno il tessuto.
4. Orientare il tessuto in ottobre con pinze entomologia piuma per evitare danni ai tessuti. Inizia congelamento trasferendo la crio-mold nel bagno isopentano pre-raffreddato. Non schizzare isopentano in ottobre in quanto non congelerà correttamente. Avvolgere i campioni in un foglio di alluminio e conservare a -80 ° C.

3. criosezionamento

1. Tagliare 14 micron sezioni seriali sottili in serie 'di cinque con un criostato e raccogliere su SuperFrost® Plus Il vetrini per immunofluorescenza (IF) analisi. Conservare i vetrini a -80 ° C fino utilizzato.

4. Tracer visualizzazione Utilizzando la (TSA) Protocol Tyramide amplificazione del segnale

1. Preparare i tamponi e reagenti necessari per la colorazione. Sempre fresco preparare il tampone Tris-NaCl-Tween (TNT) il giorno di utilizzo.
   1. Preparare tampone TNT usando 100 ml di 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml di NaCl 5 M e DDH ₂ O fino ad un volume finale di 1 L. Aggiungere 500 ml di Tween 20 con una pipetta 1 ml. Aggiungere il Tween 20 lentamente e lavare la pipetta su e giù più volte per garantire che tutti Tween 20 è insoluzione.
   2. Preparare Tris-NaCl-bloccante (TNB) tampone con 100 ml di 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml di NaCl 5 M e DDH ₂ O fino ad un volume finale di 1 L. Aggiungere 5 g Blocking Reagent (disponibile con il kit) lentamente in piccoli incrementi nel buffer agitando. Riscaldare la soluzione gradualmente a 55 ° C con agitazione continua per sciogliere completamente i reagenti blocco (non dovrebbe richiedere più di 30-60 min). Per ottenere il riscaldamento omogeneo utilizzare un bagno d'acqua a 55 ° C. La soluzione appare lattiginosa. Portare la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso. Aliquota e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
   3. Ricostituire biotina reagente tiramide (fornito con il kit) in Biologia Molecolare / HPLC-grade DMSO. A seconda del kit viene utilizzato l'appropriata quantità di DMSO può variare. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
      NOTA: Sezioni di animali eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 possono essere utilizzati per l'analisi del circuito. Usa sessioni da littermates trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, come controlli negativi. Trattare vetrini di controllo negativi esattamente come diapositive di animali doppi eterozigoti. Inoltre, include una diapositiva di controllo da una doppia animale eterozigote, ma lasciare fuori il reagente TSA (controllo non amplificato).
2. Usando un bisturi affilato fresco rimuovere l'eccesso di ottobre che circonda le sezioni di tessuto e segnare il confine intorno sezioni con una penna PAP.
3. Essiccare i vetrini per 2-3 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti a 0,3% H soluzione ₂ O ₂ in metanolo ghiacciata per placare la perossidasi endogena.
4. Lavare 3x con PBS per 5 minuti ciascuna a RT. Incubare per 10 minuti a 0,5% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione tessuto. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna.
5. Block con TNB (soluzione bloccante, 200-300 ml per vetrino) per 30min a RT in una camera umidificata. Assicurarsi che tutte le sezioni sono completamente coperti da TNB. Non lasciate che le diapositive asciugare tra le fasi.
6. Scolare il tampone di blocco in eccesso e applicare l'antisiero primario riconoscere il tracciante (1: 1.000 capra anti-WGA per BL, 1: 15.000 coniglio anti-GFP per GTT) diluito in TNB per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di utilizzare un volume sufficiente per coprire completamente la sezione di tessuto (200-300 ml per vetrino).
   NOTA: Le diluizioni sieri specifici primari raccomandati qui possono avere da regolare.
7. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione.
8. Incubare le sezioni con biotinilato antisiero secondario riconoscono l'ospite della prima dell'antisiero (1: 500 cavalli IgG anti-capra anti-WGA, 1: IgG anti-coniglio di capra 5.000 per anti-GFP in TNB per 1 ora a RT).
9. Lavare 3x con TNT a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno con agitazione. Incubare in 1: 100 streptavidina (SA) -conjugated perossidasi (SA-HRP, fornito with kit) in TNB per 30 minuti a RT in una camera umidificata. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. Intanto scongelare il TSA.
10. Diluire TSA 1:50 TSA amplificazione diluente (fornito con il kit; utilizzare il kit TSA per la visualizzazione di BL e il kit + TSA per GTT). Incubare le sezioni di tessuto in diluita TSA proprio per 10 minuti a temperatura ambiente. Diluire TSA al momento dell'uso, ideale durante la fase di lavaggio precedente, non utilizzare alcun residuo reattivo TSA diluito per futuri esperimenti; sempre preparare fresco.
11. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. Incubare con 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidina coniugato in TNB per 30 minuti a RT. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione.
12. Incubare per 10 min in soluzione Bisbenzimide 5% in PBS a temperatura ambiente per colorazione nucleare. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. Montare con Fluromount G ed eseguire epifluorescenza o microscopia confocale.
    Risoluzione: Efficacia di trasferimento tracciante dipenderà dal livello di espressione del locus ROSA26 nelle cellule che producono (determinata dalla linea pilota Cre utilizzato) e sul circuito neurale analizzato (ad esempio numero di neuroni che producono il tracciante, convergenza etc.). Pertanto, le diluizioni sieri specifici primari raccomandati qui possono essere adeguati per evitare segnale basso o in eccesso. Background dovrebbe sempre essere analizzati utilizzando appositi vetrini di controllo (vedi sopra).

5. τlacZ colorazione per sezioni embrionali

1. Preparare i tamponi e reagenti necessari per la colorazione. Sempre fresco preparare il LacZ tampone C prima dell'uso.
   1. Preparare 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal) soluzione madre (40 mg / ml) aggiungendo 40 g di X-gal a 1 ml 70% dimetilformammide (DMF). Coprire con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
   2. Preparare nitro blu tetrazolio (NBT) stock soluzione (50 mg / ml) aggiungendo 50 g di NBT per 1 ml 70% DMF. Coprire con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
   3. Preparare LacZ fissativo utilizzando 80 ml ​​di 25% glutaraldeide, 5 ml di 4% PFA, 20 ml di 1 M MgCl _2, 100 ml di EGTA 500 ​​mM, 1 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH ₂ O fino a un finale volume di 10 ml.
   4. Preparare tampone LacZ A con 1 ml di 1 M MgCl _2, 5 ml di EGTA 500 ​​mM, 50 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH ₂ O fino ad un volume finale di 500 ml.
   5. Preparare LacZ tampone B con 1 ml di 1 M MgCl _2, 5 ml di EGTA 500 ​​mm, 5 ml di 1% sodio desossicolato, 100 ml di 10% NP-40, 50 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH ₂ O fino ad un volume finale di 500 ml.
   6. Preparare LacZ tampone C con l'aggiunta di 10 ml di soluzione madre NBT e 12,5 ml di soluzione madre X-gal a 1 ml di LacZ tampone B. Trucco fresco appena prima dell'uso e coprire con un foglio di alluminio.
2. Asciugare i vetrini a RT almeno per 10-15 minuti (nel frattempo preparare i vetrini con una penna PAP).
3. Fissare la sezione con LacZ fissante per 2 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata all'interno di una sostanza chimica fumi-cappuccio. Lavare 3 volte con PBS completato con 2 mM MgCl _2.
4. Sciacquare i vetrini con LacZ tampone A. Lavare i vetrini con LacZ tampone A 3 volte per 10 minuti ciascuno a RT. Lavare 2 volte con LacZ tampone B per 5 minuti ciascuno. Incubare i vetrini in LacZ tampone C a 30-37 ° C per 6 ore o durante la notte in una camera umidificata.
   NOTA: Aggiungere un volume sufficiente di LacZ buffer di C; scivoli non devono asciugare durante l'incubazione.
5. Dopo adeguata incubazione lavare i vetrini con PBS integrato con 2 mM MgCl _2. Sciacquare sezioni brevemente con DDH ₂ O. Coverslip con glicina gelatina di Mayer. Adatta per un microscopio ottico equipaggiato con un contrasto interferenziale differenziale (DIC) di imaging set-up.

6. Gender e Tracer genotipizzazione

1. Preparare coda tampone di lisi utilizzando 1 ml di 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ml di EGTA 500 ​​mM, 200 ml di 10% SDS, 400 ml di NaCl 5 M e DDH ₂ O per fare un volume finale di 10 ml.
2. Aggiungere 500 pl di tampone di lisi coda a ciascuna provetta Eppendorf contenente una biopsia coda. Aggiungere proteinasi K ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Incubare per una notte su un agitatore a 55 ° C.
3. Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 500 ml di isopropanolo al supernatante. Mescolare per almeno 5 minuti invertendo i tubi su e giù.
4. Spin in centrifugare a 17.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante. Aggiungere 200 ml di etanolo al 70%. Agitare per almeno 5 minuti.
5. Centrifugare a 17.000 g per 5 min. Rimuovere il surnatante con una Pipetman (non versare off). Essiccare il pellet in una camera calda (37 ° C) per 15-30 min.
6. Risospendere pellet in 100 mlbassa TE pH 8,0 o acqua con punte ampio tunnel filtrata. Mettere in 55 ° C per 1 ora ea 37 ° C per una notte per una corretta dissoluzione. Conservare a 4 ° C.
7. Usare 1 ml di DNA per reazione PCR (miscela di reazione 50 microlitri contenente 1 ml di DNA coda, 2,5 microlitri DMSO, 10:00 di ciascun primer, 25 mM di ciascun dNTP, e betaina 1M). Primer PCR per la genotipizzazione e l'identificazione di genere sono elencati nella tabella dei materiali.

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Risultati

Questa sezione mostra i risultati rappresentativi che possono essere ottenuti lavorando con la R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e la R26-GTT (G FP TT C) alleli. Qui usiamo la R26-BIZ e gli alleli R26-GTT per analizzare la maturazione dei circuiti neurali che regolano l'asse riproduttivo. La riproduzione in vertebrati è controllata centralmente da un piccolo sottogruppo di neuroni dell'ipotalamo, che secernono l'ormone di rilascio delle gonadotropin...

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Discussione

Esprimendo traccianti transsynaptic come transgeni per rintracciare i circuiti neurali di popolazioni di neuroni geneticamente definiti ha diversi vantaggi rispetto alla iniezione stereotassica di traccianti o virus neurotopic. Innanzitutto, il tracciante viene prodotta come proteina endogena e pertanto non suscitare una risposta immunitaria e un percorso neurale selettiva può essere analizzato in diversi animali con elevata riproducibilità. In secondo luogo, perché questo è un metodo non invasivo può essere utiliz...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20mm
DMSO	Sigma	D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF)	VWR Chemicals	23470,293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
Hydrogen peroxide	Sigma	34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane)	Sigma	M32631-2.5L
Kaiser's glycine gelatin	Merck	1092420100
Methanol	Sigma	494437-1L
MgCl2	Sigma	M2670-100G
NaCl	ROTH	HN00.2
NBT	Sigma	298-83-9
Nonidet P40 substitute	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
PAP pen	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
Sucrose	Sigma	S7903-1KG
Superfrost slides	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
TSA kit	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
Cryostat	Leica	na
Light microscope equipped with DIC imaging	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope	Zeiss	Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL)	Vector Laboatories	AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG	Vector Laboatories	BA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Reagent	PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (for BIZ genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (for GTT genotyping)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC