Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Resumen

A continuación, presentamos un protocolo para inyectar medios de contraste de microburbujas de ultrasonidos en la vida, aislados finales de la gestación de embriones murinos etapa. Este método permite el estudio de los parámetros de perfusión y de marcadores moleculares vasculares dentro del embrión utilizando imágenes de ultrasonido de alta frecuencia con contraste.

Resumen

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Introducción

La ecografía con contraste hace uso de agentes de contraste de microburbujas de visualizar y caracterizar el ambiente vascular. Estos agentes permiten la evaluación no invasiva de la microcirculación, la vascularización y la función cardiovascular. Además, la modificación de la superficie de la burbuja puede resultar en microburbujas específica de unión a los biomarcadores endoteliales, como se ha demostrado en aplicaciones preclínicos de la angiogénesis, la aterosclerosis y la inflamación ^1,2 toma de imágenes por ultrasonido molecular de eventos vasculares posibles. Por lo tanto, un mayor contraste de ultrasonido puede ser usado para identificar los entornos complejos y diversos que influyen en los estados vasculares sanas y enfermas ^3-5.

En el último número de años, el interés en la utilidad de las imágenes de microburbujas se ha extendido al modelo de embrión de ratón versátil. Como modelo de desarrollo de los mamíferos, la introducción de microburbujas en la vasculatura embrionaria mejora fisiológicaestudio del desarrollo del sistema circulatorio (por ejemplo, el flujo sanguíneo, el gasto cardíaco) y en casos de transgénicos y dirigidos modelos de ratones mutantes de la enfermedad cardíaca ^6,7, puede ayudar a comprender cómo los factores genéticos alterar la función cardiovascular. De hecho, los análisis 2D cuantitativa y cualitativa de la vasculatura del cerebro embrionario ya se han logrado ^8. Además, el embrión de ratón se presenta como un modelo excelente para examinar la unión de microburbujas dirigidas a los marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. ^9, por ejemplo, han introducido microburbujas avidina en embrión ventrículos cardíaco para evaluar dirigido específicamente vinculante en Biotag-Bira embriones transgénicos y examinar la anatomía vascular. La generación de modelos heterocigotos y homocigotos ratón también puede ser utilizado como un sustituto de los estudios de modelos tumorales con el objetivo de definir la naturaleza cuantitativa de ultrasonido molecular - un punto de referencia importante en la traducción de esta técnica a la clínica.

microburbujas se presentó con mayor frecuencia a la circulación embrionaria a través de inyecciones intra-cardiaca en embriones únicos expuestos a través de una laparotomía ^8-10. En inyecciones útero, sin embargo, se enfrentan a una serie de desafíos. Estos incluyen la orientación de la inyección, la necesidad de contrarrestar el movimiento en la madre y el embrión exteriorizada, el mantenimiento de la viabilidad de hemodinámica en la madre y embriones exteriorizados, abordando los efectos a largo plazo de la anestesia y las complicaciones por sangrado ^11. Por lo tanto, el objetivo de la investigación fue desarrollar una técnica para la inyección de microburbujas en aislados de vida embriones en etapa tardía ^12. Esta opción ofrece más libertad en términos de control de la inyección y el posicionamiento, la reproducibilidad del plano de formación de imágenes sin obstrucción, y análisis de imagen simplificada y cuantificación.

En el presente estudio, se describe un nuevo procedimiento para la inyección de microburbujas en que viven los embriones murinos FOr los efectos de estudiar el comportamiento cinético de microburbujas y de estudiar la unión a marcadores de superficie endoteliales endógenos de microburbujas dirigidas. Ecografía específica contraste no lineal se utiliza para medir una serie de parámetros de perfusión básicos, incluyendo la mejora de pico (PE), lavandería en la tasa y el tiempo hasta el pico (TTP) en aislados embriones E17.5. También demuestran la validez del modelo de embrión para evaluar la naturaleza cuantitativa de la ecografía molecular en una pérdida de la endoglina embrionario de modelo de ratón transgénico función, donde la endoglina es una diana clínicamente relevante debido a su alta expresión en las células endoteliales vasculares en los sitios de angiogénesis activa ¹³ . La adhesión de isotipo IgG de rata de control de la endoglina _2-dirigida (MB _E), (MB _C) y _(U) MB microburbujas no focalizados se evalúa en la endoglina heterocigotos (Esp ^+/-) y homocigotos endoglina (Eng ^{+ / +)} que expresan embriones. Análisis del bindi apuntadong revela que el ultrasonido molecular es capaz de diferenciar entre los genotipos endoglina y relacionando densidad de los receptores a los niveles cuantificables de ultrasonido moleculares.

Protocolo

NOTA: Los procedimientos experimentales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Sunnybrook (Toronto, Ontario, Canadá). Los procedimientos para el tratamiento humanitario de los animales deben ser observados en todo momento. Se supone que el investigador está entrenado en la operación básica de un sistema de imágenes de ultrasonido. Este protocolo funciona mejor con dos personas.

1. Modelos Animales

1. Casamata del CD-1 macho y hembra Mus musculus para obtener embriones de tipo salvaje para los estudios de perfusión.
2. Para los estudios de imagen molecular, generar ratones Ing +/- mediante recombinación homóloga utilizando células madre embrionarias de origen 129 / Ola como se describe por Bourdeau et al. ^14.
   1. Ratones Retrocruzamiento B6- Eng ^+/-, amablemente adquiridos de la doctora Michelle Letarte, el CD-1 fondo. Uso Ing ^+/- CD-1 embriones backcrossed, así como su Ing ^{+ / +} littermate controls. Mate de los ratones para producir embriones escenificados.

2. Preparación Experimental

1. Iniciar el apareamiento de los ratones y comprobar tapones diaria. Día embrionario 0.5 se define como el mediodía del día se observa un tapón vaginal.
2. Preparar los medios de comunicación de embriones mediante la adición de 50 ml de suero fetal bovino, 5 ml de 1 M HEPES y 5 ml de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de penicilina, 10.000 mg de estreptomicina) a 500 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alta glucosa (4500 mg / L). Envuelva la botella en papel de aluminio y mantener refrigerados a 4 ° C.
3. Centrifugar gel de ultrasonido claro en 50 ml en tubos cónicos de 140 xg durante 20 min. Dibuja gel para arriba en 30 ml jeringas. Rellene adicionales (marcados) 30 ml jeringas con tampón fosfato salino (PBS) y reservar. Una camada de embriones requerirá generalmente entre 2-3 jeringas de gel de ultrasonido y 4 jeringas de PBS.
4. Tire unos 30 agujas de vidrio y fijar con suavidad a una tira de plastilinaen un 100 x 20 mm placa de cultivo celular. Esto asegura que las agujas se separan y seguro durante la manipulación. Con un extractor de vidrio, utilice los siguientes ajustes en 1 x 90 mm capilares de vidrio con filamento: Calentador de 77, Sub 55 de imán, imán principal 70.
5. Preparar once y cincuenta placas de disección (lo suficiente para asegurar que cada embrión dentro de una camada recibirá su propio plato), usando una proporción de 1: 8 volumen de agente de curado a la base. Verter 40 ml de la base en un tubo cónico de 50 ml. Añadir agente de curado 5.6 ml y se agita con un palo de madera.
   1. Vierta la mezcla en 60 x 15 mm cultura platos, llenando cada uno de aproximadamente la mitad. Deje reposar O / N para ajustar.
6. Adjuntar luers femeninos y 400 mm piezas largas de cloruro de polivinilo (PVC) tubo (diámetro interior: 0,79 mm). El tubo debe llegar desde la bomba de jeringa a la etapa de ultrasonidos cómodamente.

3. Estructura de ensayo

1. Organizar la plataforma de imágenes en el microscopio quirúrgico con un motor 3D y disposición lineal 21 MHtransductor z.
   1. Oriente la plataforma de manera que el carril de montaje está a la izquierda, con la etapa de posicionado directamente debajo del microscopio.
   2. Una el motor 3D para la articulación de rótula del brazo que se extiende de la plataforma. Atornille el poste de liberación rápida de la abrazadera transductor en la liberación rápida de montaje en el motor, mirando hacia adelante, y la posición de la cabeza del transductor en la pinza, la fijación del pestillo.
   3. Asegure el conector del transductor en el puerto activo en el panel frontal del carro. Encienda la máquina.
2. Iniciar el transductor de ultrasonidos 21 MHz, de seleccionar el ajuste 'Cardiología' para los estudios de imagen molecular, y "general" para los estudios de perfusión. Shift todos los deslizadores de tiempo de ganancia de compensación a la posición media exacta. Para 'Modo Contraste', establecer los siguientes parámetros: Frecuencia: 18 MHz, la potencia de transmisión: 4%, (0,39 MPa), Contrast Ganancia: 30 dB, focos: 6 y 10 mm, Modo de Contraste: no lineal, el tiempo de rotura: 100% en 0,1ancho seg, haz: Amplia.
3. Alícuota de 40 ml de medio de embrión de cada uno en cuatro tubos de 50 ml cónicos. Coloque sobre hielo.
4. Calentar 1 L de agua en un vaso de precipitados de 2 L en una placa caliente. Mantener a los 45 ° C. Añadir una jeringa de gel de ultrasonido y PBS en el mismo vaso para precalentar. Mantener esta temperatura mediante el control con un termómetro en todo momento.
5. Ponga a un lado once y cincuenta 1 ml jeringas y once y cincuenta 21 agujas G para la inyección de microburbujas.

4. Procedimiento Quirúrgico

NOTA: Tienes una asistente preparar las burbujas (fase 5), mientras que el cirujano comienza el procedimiento quirúrgico. El protocolo descrito aquí ha sido adaptada de Whiteley et al. ¹⁵

1. Recoger E16.5 E17.5 o embriones de ratón hembra gestante siguientes dislocación cervical.
   NOTA: Los efectos de la anestesia en los embriones no han sido estudiados en detalle ^16. Los métodos adicionales, incluyendo la decapitación, pueden ser op apropiadociones para el sacrificio de los ratones preñados.
   1. Cortar abrir el abdomen para revelar el útero y los embriones. Cuidadosa y rápidamente se extrae el útero mediante el corte en las puntas de los cuernos uterinos (cortando los vasos ováricos y uterinos) y corte en la vagina y la vejiga.
   2. El uso de pinzas en astilla, transferir el útero a un tubo de 40 ml de helado medios embrión tan rápidamente como sea posible sin dañar los embriones. Deseche la carcasa del ratón.
2. Reubicar a microscopio y el escenario. Depositar el útero en un 100 x 20 mm placa de cultivo celular. Transferir el útero en un nuevo plato lleno con 50 ml de medio de embriones frescos.
3. Utilizando esterilizada (70% aerosol etanol) pinzas finas, rasga suavemente y apartó las membranas externas de útero a partir de un extremo. Exponer la decidua de la placenta, saco vitelino parietal y la membrana de Reichert para separar y retirar del saco vitelino visceral subyacente.
4. Diseccionar los embriones uno por uno, y manteniendo el visceralsacos olk intactas y manejo de la placenta lo más suavemente posible ^17. Tenga cuidado de evitar la ruptura del saco vitelino como los embriones se salgan inmediatamente.
   1. Use la cuchara perforada para mover los embriones a otro plato mantenido en hielo con medios de embriones frescos. Mantener los embriones refrigerados hasta que se necesite. Cambie los medios de comunicación en el plato embrión cada 1-1,5 horas. Con estas condiciones embriones son viables para un máximo de 4 hr después de la disección.

5. Preparación de microburbujas

NOTA: Realice la imagen molecular con ultrasonidos utilizando tanto microburbujas dirigidas y no dirigidas. Un solo experimento puede requerir hasta 3 viales separados de microburbujas: microburbujas i) de anticuerpos dirigidos microburbujas, ii) anticuerpo isotipo de control específicas y iii) microburbujas no focalizados. El agente de contraste se presenta como un polvo seco por congelación y debe reconstituirse con solución salina antes de la inyección. Hay ~ 2 x 10 ⁹ microburbujas en cada microb no directovial ubble y ~ 8.8 x 10 ⁸ microburbujas en los viales listos objetivo. Las microburbujas son estables durante un máximo de 3 horas después de la reconstitución.

1. Reconstitución de Ready objetivo Viales
   NOTA: Los ejemplos de preparaciones listas de destino: microburbujas dirigidas endoglina (MB _E, con rata biotinilado MJ 7/18 de anticuerpos a la endoglina ratón; en instalaciones hibridoma casa); factor de crecimiento endotelial vascular del receptor 2 (VEGFR2) microburbujas dirigidas (MB _V, con biotina anti-ratón CD309); isotipo de anticuerpos IgG de rata ₂ Control de microburbujas dirigidas (MB _C, isotipo de rata biotina IgG ₂ de control centrado IgG2a de ratón).
   1. Diluir la solución de anticuerpo (20 mg) en 1 ml (volumen final) de solución salina. Mantener en hielo.
   2. Llene la jeringa con 1 ml de solución salina, la eliminación de todas las burbujas de aire. Colocación de una aguja de calibre 21, inyecte la solución lentamente en el vial de microburbujas.
   3. Retire lentamente el émbolo, la eliminación de 1 ml de aire y retire la aguja. Suavementeagitar. Dejar reposar 5 minutos en hielo.
      NOTA: microburbujas de ultrasonidos pueden ser destruidos en ambientes de alta presión.
   4. Después del tiempo transcurrido, llenar una nueva jeringa con la dilución de anticuerpo y añadir al vial apropiado. Agitar suavemente. Deje que la mezcla (ahora 2 ml) reposar durante 10 min. Mantener en hielo. Suponiendo Conjugación superficie completa, el número promedio de ligando unido para las microburbujas es de aproximadamente ¹⁸ 7,600 ligandos / m ^2.
2. Reconstitución de los viales no focalizados
   1. Llene la jeringa con 1 ml de solución salina, la eliminación de todas las burbujas de aire. Colocación de una aguja de calibre 21, inyecte la solución lentamente en el vial de microburbujas.
   2. Retire lentamente el émbolo, la eliminación de 1 ml de aire y retire la aguja. Agitar suavemente. Dejar reposar 5 min. Añadir un adicional de 1 ml de solución salina, como se describe anteriormente. Agitar suavemente y dejar reposar 10 minutos en hielo.
3. Coulter Conteo
   1. Agitar suavemente el vial de microburbujas deseada y dibujar ~50 l de la solución en una jeringa de 1 ml usando la aguja 21 G. Inyectar las microburbujas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml vacía.
   2. Pipetear una muestra de 10 l de solución de microburbujas caldo en 10 ml de diluyente.
   3. Después de mezclar suavemente, evaluar la concentración y el tamaño de las distribuciones de la población de microburbujas mediante conteo de siembra (ver Lista de Materiales). Contar con un mínimo de tres mediciones de 50 mu l (por muestra vial) con una abertura de 30 micras.
4. Microburbujas Preparación para inyección
   NOTA: El asistente realiza este paso cuando "La inyección de microburbujas en embriones '(paso 6) se inicia. Cada embrión se inyecta una vez, con el tipo de microburbujas elegido para cada inyección para ser seleccionado al azar por el asistente de tal manera que todos los tipos de microburbujas se distribuyen uniformemente por todo el procedimiento, pero dan en un orden aleatorio. Asegúrese de que el cirujano es ciego para el tipo de burbuja que se inyecta.
   1. Determinar ªe volumen de solución madre de burbujas requerida para producir una concentración final de 1 x 10 ⁸ MB ​​/ ml en un volumen de 400 l (calcular el volumen utilizando las concentraciones de valores medidos en 5.3.3). Alícuota el volumen correspondiente de solución salina en un tubo de microcentrífuga vacío.
   2. Agitar suavemente el vial de microburbujas seleccionado y dibujar un volumen en exceso (~ 50 l mayor que el calculado anteriormente) de la solución en una jeringa de 1 ml usando la aguja 21 G. Inyectar las microburbujas en un tubo de microcentrífuga vacía.
   3. Pipetear el volumen necesario de solución madre de microburbujas y añadir a la alícuota de solución salina. Mezclar agitando suavemente con la punta de la pipeta.
   4. Dibuje la solución de microburbujas diluida en una jeringa limpia utilizando la aguja 21 G. Retirada de la aguja, eliminar las burbujas de aire de la jeringa y fijar la luer y la tubería. Empuje lentamente la solución al final de la toma de la tubería seguro de no generar burbujas de aire.
   5. Inserte el Syringe en una bomba de infusión de jeringa configurar para dispensar las microburbujas a una velocidad de 20 l / min para un volumen total de 20 l. Adjuntar una aguja de vidrio arrastrado hasta el final de la tubería. Mueva la bomba cerca de la etapa de inyección.

6. La inyección de microburbujas en embriones

1. Aleatoriamente seleccionar y eliminar (con cuchara perforada) de un embrión desde el plato medios refrigerados. Coloque en un plato de la disección se encuentra en la etapa de ultrasonidos bajo el estereoscopio y quitar el saco vitelino y membranas amnióticas con las pinzas finas, cortar / desgarro desde el lado que aparece menos vascularizado (el lado antimesometrial). Esto se logra más fácilmente por la perforación de un área adyacente a la región de la cabeza.
   1. Cortar suficiente para eliminar el embrión desde el interior, pero no más. Estabilizar los platos de disección utilizando pequeños trozos de plastilina.
2. Maniobrar con cuidado el saco de todo el embrión. Coloque el embrión en su lado, con la placenta yvasos umbilicales en el frente. El uso de los pasadores de insectos, precisar el saco vitelino (4 pasadores recomendado) y bordes de la placenta como necesario colocar en su lugar. Evite los grandes vasos.
3. Lave el embrión con pre-calentado a 45 ° C PBS hasta que el embrión revive. Identificar la vena umbilical y su red vascular asociada. Coloque el plato de manera que la inyección se puede hacer cómodamente.
   NOTA: Una vez calentada, la sangre en el embrión comenzará a fluir, visiblemente bombeo en la arteria umbilical. Cuando el flujo comienza en primer lugar, las venas serán un color rojo brillante, con la sangre en los dos buques que aparezcan rápidamente idénticos. Las ramas derivadas de la vena umbilical generalmente se superponen los de la arteria umbilical en la superficie de la placenta.
4. Una vez que el embrión ha revivido, cúbralo (pero no la placenta) con pre-calentado gel de EE.UU., asegurándose de remover delicadamente las burbujas de aire (utilizando las pinzas finas) de todo el embrión. Completar el plato con PBS precalentado.
   NOTA: Mantenga un ojo en el nivel de solutien en las jeringas de PBS y de gel y añadir jeringas de copia de seguridad al vaso de precipitados de calentamiento según sea necesario.
5. Montar la aguja de vidrio en una gran bola de plastilina en el borde del plato disección e inserte el extremo de la aguja en el PBS. La elección de una vena en la superficie del disco coriónica placentaria, tan lejos de la rama principal como razonable, recortar la punta a medida con tijeras. La inyección es más fácil si la punta se corta en un ligero ángulo. Retire los bordes dentados de vidrio utilizando el borde de las tijeras de primavera.
6. Uso de la bomba de jeringa, inyectar lentamente la solución de microburbujas en 20 l / min en la aguja de vidrio hasta que todo el aire es expulsado de la punta de la aguja y las microburbujas se puede ver a fluir libremente en el PBS. Parar la bomba y restablezca para un volumen de inyección de 20 microlitros. No permita que el aire entre en el sistema vascular del embrión durante la inyección.
7. Inserte la punta de la aguja de vidrio suavemente en una de las venas en la placenta y asegúrese de que está inmóvil. Oscilación lejos del estéreooscope cabeza y la posición del transductor sobre el embrión. Iniciar formación de imágenes.

7. Ecografía Imagen Molecular

NOTA: El uso de las condiciones de contraste de imagen no lineales fijados anteriormente, coloque el transductor de manera que el embrión se encuentra en partes iguales entre los focos a los 6 y 10 mm. Una vez colocado, iniciar la inyección en bolo de las microburbujas. Cuando la inyección se ha completado, iniciar el temporizador.

1. Imagen de perfusión
   1. Asegúrese de que el número máximo de fotogramas para el modo de contraste no lineal se selecciona pulsando el botón "gestión estudio 'y haciendo clic en la pestaña' Preferencias 'en la parte superior del navegador estudio. Marque la casilla correspondiente en la ventana de "Preferencias".
   2. Ajuste la configuración de imagen mediante el inicio de imagen no lineal. Pulse el botón 'modo de contraste "en el panel de control. Refinar la ganancia 2D ajustando la 'ganancia & #8217; marcar a 30 dB, reducir el poder de 4% a través del "poder" marcar, disminuir la frecuencia de 1 Hz utilizando la "frecuencia" marcar y establecer el ancho de haz (esquina inferior izquierda) para todo el uso de la bolilla / ratón.
      NOTA: Todos los controles se encuentran en el panel de control del sistema de ultrasonido.
   3. Capturar la totalidad de lavado-in y la disipación del bolo de microburbujas mediante la grabación de un bucle de cine 20 min a una velocidad de 1 Hz. Presione exploración / congelación para iniciar la adquisición de datos.
   4. Una vez que la secuencia completa de las imágenes ha sido capturado, pulse el botón de 'tienda de cine' se encuentra en el panel de control para guardar la secuencia de imágenes en el buffer del sistema. El sistema crea un cine loop sellada con la fecha de los datos del modelo de contraste no lineales adquiridos.
2. Dirigida microburbujas Imaging
   1. En 'Preferencias', establecer el tiempo de ráfaga a 0,1 seg. Establezca los parámetros de imagen apropiadas usando los controles descrito anteriormente (7.1.2.).
   2. Iniciado imágenes de contraste no lineal pulsando el botón 'modo de contraste "en el panel de control. Asegúrese de que el embrión está correctamente situado bajo el transductor y que el flujo de agente de contraste de microburbujas a través de la embrión es visible en la imagen de modo de contraste no lineal.
   3. Para evaluar microburbujas específica vinculante durante los estudios de imagen molecular embrionarias, permiten que las microburbujas que circulan en reposo durante 3 minutos y 40 segundos después de la finalización de la inyección. Este tiempo es para permitir la retención de las microburbujas circulantes. Pulse 'scan / congelar "para detener la imagen durante este tiempo.
   4. En 3 min y 40 seg, imágenes curriculum vitae para confirmar que el embrión es aún visible, está cubierto adecuadamente con PBS, y que las microburbujas continúan circulando. Pulse 'scan / congelar "para iniciar la imagen.
   5. Adquirir la secuencia de interrupción / reposición después de la inyección de 3 minutos y 50 segundos mediante el registro de un "pre-destrucciónsecuencia respuesta acústica ción 'a los 29 Hz. Pulse 'scan / congelación' para iniciar la adquisición de datos. A los 4 minutos después de la inyección ^18,19, iniciar una explosión acústica de alta frecuencia 0,1 seg. Pulse el botón 'explosión' de implementar una ráfaga.
   6. Continuar registrando marcos para el resto de la secuencia (hasta la línea de buffer está lleno) y guardar el cine loop pulsando 'tienda de cine'.
   7. Recoger un bucle de cine adicional de microburbujas circulante. Se supone que esta secuencia de imágenes posterior 'post-destrucción "para contener sólo circulan las señales de burbujas que se repone la viga. Pulse 'scan / congelar "para iniciar de imágenes y' tienda de cine 'para recoger las imágenes.
   8. Etiquetar los bucles de cine tras explorar cada embrión. Pulse 'gestión de estudio', resalte el archivo con la bolilla y el 'select', pulse el botón 'etiqueta de imagen' y el nombre apropiado.

8. Manipulación de los embriones después de la inyección

1. Formación de imágenes Post, mover el transductor, desanclar el embrión y la eutanasia (a través de la decapitación, la dislocación cervical, asfixia con dióxido de carbono, o anestesia seguido por congelación rápida o fijación) como se desee.
2. Para cada inyección posterior de embriones debe ser utilizado un plato de disección, aguja, jeringa y tubo segmento fresco, con la preparación del siguiente lote de inyección de microburbujas toma de solución durante la disección y el renacimiento.
3. Guardar muestras de tejido (por ejemplo, cola, cerebrales) para análisis adicionales (por ejemplo, la genotipificación determinado por análisis de PCR de ADN aislado de la cola, la tinción lacZ, o medidas semi-cuantitativa de la expresión de biomarcadores utilizando Western blots ^21).

Resultados

La inyección de agentes de contraste de ultrasonido en el útero los embriones de ratón ex depende del éxito en el aislamiento de la vida, embriones en fase tardía de la gestación del útero y el mantenimiento de la viabilidad en el transcurso de la inyección y de formación de imágenes de ultrasonido relacionada. Una vez que el embrión se ha exteriorizado y posicionado, como se muestra en la Figura 1, la inyección cuidadosa de agente de contraste en la vasculatura embrionaria...

Discusión

Los agentes de contraste de ultrasonido fueron inyectadas en la última etapa de la gestación de embriones de ratón y las imágenes de contraste no lineales fueron adquiridos para medir parámetros de perfusión y microburbujas dirigidos vinculante. El éxito de formación de imágenes de microburbujas dentro de la vasculatura embrionaria era dependiente de una serie de factores, siendo el primero la viabilidad del embrión. Todo el equipo y el aparato se prepararon de antemano con el fin de minimizar el tiempo requer...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08