הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.

Abstract

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Introduction

ההדמיה אולטרסאונד contrast-enhanced עושה שימוש בחומרי ניגוד microbubble לדמיין ולאפיין את הסביבה של כלי הדם. סוכנים אלה מאפשרים הערכה לא פולשנית של זרימת הדם, כלי הדם ותפקוד לב וכלי דם. בנוסף, שינוי של פני השטח הבועה יכול לגרום microbubble ממוקד מחייב סמנים ביולוגיים אנדותל, כפי שהודגם ביישומים פרה-קליניים של אנגיוגנזה, טרשת עורקים ודלקת ^1,2 עושים הדמיה אולטרסאונד מולקולרית של אירועי לב וכלי דם אפשריים. אולטרסאונד חומר ניגוד ולכן יכול לשמש כדי לזהות את הסביבות המורכבות ומגוונות המשפיעות על כלי דם בריאים ומדינות נגועות ^3-5.

במספר האחרון של שנה, עניין בשירות של ההדמיה microbubble האריך למודל עובר עכבר תכליתי. כמודל להתפתחות יונקים, כניסתה של microbubbles לכלי הדם העוברי משפרת פיזיולוגית מחקר של מערכת הדם המתפתחת (זרימה למשל, דם, תפוקת לב) ובמקרים של מהונדס ומודלים של עכברים שעברו מוטציה ממוקדת של מחלות לב ^6,7, עשוי להניב תובנות כיצד גנטי לשנות את תפקוד לב וכלי דם גורמים. למעשה, 2D כמותיים ואיכותי ניתוחים של כלי דם במוח עובריים כבר הושג ^8. יתר על כן, את עובר העכבר מציג כמודל מצוין לבחינת המחייבת של microbubbles ממוקדת לסמני כלי דם in vivo. Bartelle et al. ^9, למשל, הציג microbubbles avidin לתוך חדרי לב עובר להעריך ממוקדים מחייב בעוברים מהונדסים Biotag-בירה ולבחון האנטומיה של כלי דם. הדור של דגמי עכבר הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים ניתן לשמש גם כתחליף ללימודי מודל גידול במטרה להגדיר את האופי הכמותי של אולטרסאונד המולקולרי - אמת מידה חשובה בתרגום בטכניקה זו למרפאת.

התחת = "jove_content"> microbubbles בתדירות הגבוהה ביותר הציג למחזור העוברי באמצעות זריקות תוך-לב לעוברי בודדים נחשפו דרך laparotomy ^8-10. בזריקות ברחם, לעומת זאת, מתמודד עם מספר האתגרים. אלה כוללים הדרכת הזרקה, צורך לפעול נגד תנועה באמא ועובר exteriorized, תחזוקה של כדאיות hemodynamic באמא ועוברי exteriorized, פונים השפעות ארוכות הטווח של הרדמה וסיבוכים עקב דימום ^11. לכן, המטרה של החקירה הייתה לפתח טכניקה להזרקת microbubbles לעוברי בשלב מאוחר חיים מבודדים ^12. אפשרות זו מציעה יותר חופש במונחים של שליטת הזרקה ומיצוב, שחזור של מטוס ההדמיה ללא חסימה, וניתוח תמונה פשוט וכימות.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך חדשני להזרקה של microbubbles לעוברי עכבריים חיים for המטרות של לימוד התנהגות הקינטית microbubble ולימוד ממוקד microbubble מחייב סמני משטח אנדותל אנדוגני. הדמיה אולטרסאונד שאינו ליניארי ניגוד ספציפי משמשת למדידה של מספר הפרמטרים זלוף הבסיסיים כוללים שיפור שיא (PE), לשטוף-בשיעור ובזמן השיא (TTP) בעוברי E17.5 מבודדים. אנחנו גם מדגימים את תוקפו של מודל העובר להערכה כמותית של טבע אולטרסאונד המולקולרי באובדן endoglin עוברי של מודל עכבר מהונדס פונקציה, שבו endoglin הוא יעד רלוונטי מבחינה קלינית בשל הביטוי הגבוה שלה בתאי האנדותל של כלי דם באתרים של אנגיוגנזה הפעילה ¹³ . ההידבקות של שליטה (MB _E), ממוקד endoglin אלוטיפ עכברוש IgG ₂ (MB _C) וmicrobubbles לא ממוקדת (MB _U) מוערכת בendoglin הטרוזיגוטיים (Eng ^+/-) וendoglin הומוזיגוטים (Eng ^{+ / +)} להביע עוברים. ניתוח של בינדי הממוקדng מגלה כי אולטרסאונד המולקולרי הוא מסוגל להבדיל בין גנוטיפים endoglin ונוגעים צפיפות קולטני לרמות אולטרסאונד מולקולריות לכימות.

Protocol

הערה: הפרוצדורות שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים בSunnybrook מכון מחקר (טורונטו, אונטריו, קנדה). נהלים לטיפול ההומני לבעלי החיים חייבים להיות נצפו בכל העת. הנחה היא שהחוקר מיומן בפעולה הבסיסית של מערכת הדמיה אולטרסאונד. פרוטוקול זה עובד הכי טוב עם שני אנשים.

1. מודלים בבעלי חיים

1. זכר CD-1 Mate ומאסכאלאס נקבה להשיג עוברי סוג בר ללימודי זלוף.
2. לבדיקות הדמיה מולקולריות, ליצור עכברי +/- Eng ידי רקומבינציה ההומולוגית באמצעות תאי גזע עובריים של 129 המוצא / Ola כפי שתואר על ידי et al Bourdeau. ^14.
   1. עכברי ההכלאה לאחור B6- ^+/- אנג, שנרכשו באדיבותו של ד"ר מישל Letarte, על הרקע CD-1. CD-1 ^+/- השימוש Eng עוברי backcrossed, כמו גם Eng ^{+ / +} שיתוף littermatentrols. Mate העכברים לייצר עוברים מבוימים.

2. ניסיוני הכנה

1. ליזום הזדווגות של עכברים ולבדוק תקעים יומיים. יום עוברי 0.5 מוגדר כבצהרים ביום תוסף נרתיק הוא ציין.
2. הכן תקשורת עובר על ידי הוספת 50 מיליליטר של סרום שור עוברי, 5 מיליליטר של 1 M HEPES ו -5 מיליליטר של פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין 10,000 יחידות, 10,000 מיקרוגרם סטרפטומיצין) 500 מיליליטר הבינוני של הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה שונה Dulbecco (4,500 מ"ג / L). לעטוף את הבקבוק בנייר כסף ולשמור צוננים על 4 מעלות צלזיוס.
3. ג'ל צנטריפוגה ברור אולטרסאונד בצינורות חרוטי 50 מיליליטר ב 140 XG במשך 20 דקות. צייר ג 'עד ל -30 מיליליטר מזרקים. מלא 30 מיליליטר מזרקים עם ופר פוספט (PBS) ומניחים בצד (מסומנים) נוספים. המלטה אחת של עוברים בדרך כלל תדרוש בין 2-3 מזרקים של ג'ל אולטרסאונד ו- 4 מזרקים של PBS.
4. משוך כ -30 מחטי זכוכית ובעדינות להדק לרצועה של פלסטלינהבצלחת תרבית תאי 100 x 20 מ"מ. הדבר מבטיח כי המחטים מופרדות ובטוחה במהלך טיפול. באמצעות חולץ זכוכית, השתמש בהגדרות הבאות על 1 x 90 מ"מ זכוכית נימים עם נימה: דוד 77, מגנט Sub 55, מגנט ראשי 70.
5. הכן 11:50 צלחות דיסקציה (מספיק כדי להבטיח שכל עובר בהמלטה תקבל מנה משלו), באמצעות יחס של 1: 8 נפח של סוכן ריפוי לבסיס. יוצקים 40 מיליליטר של בסיס לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף סוכן ריפוי 5-6 מ"ל ומערבבים עם מקל עץ.
   1. יוצקים לתוך 60 x 15 מנות תרבות מ"מ, מילוי כל כלמחצית. בואו O הדוכן / N להגדיר.
6. צרף luers הנשי לחתיכות ארוכות 400 מ"מ של פוליוויניל כלוריד (PVC) צינור (קוטר פנימי: 0.79 מ"מ). צינורות חייבים להגיע ממשאבת המזרק לבמה אולטרסאונד בנוחות.

3. ניסיוני Set-up

1. מסדרים את פלטפורמת ההדמיה תחת מיקרוסקופ הניתוחי עם מנוע 3D ומערך ליניארי 21 MHמתמר z.
   1. אוריינט הפלטפורמה, כך שרכבת הר הוא בצד השמאל, עם הבמה ממוקמת ישירות מתחת למיקרוסקופ.
   2. צרף את מנוע 3D לכדור המשותף של זרוע הארכה של הפלטפורמה. לדפוק את ההודעה השחרור מהירה של המהדק מתמר לשחרור מהיר לעלות על הרכב, פונה קדימה, ומקם את הראש מתמר במהדק, מהדק את התפס.
   3. לאבטח את המחבר מתמר בנמל הפעיל בלוח הקדמי של העגלה. הדלק את המכשיר.
2. ליזום מתמר אולטרסאונד 21 MHz, בחירת ההגדרה 'קרדיולוגיה' לבדיקות הדמיה מולקולריות, ו'כללי 'ללימודי זלוף. להעביר את כל המחוונים בזמן עלייה-פיצוי למצב האמצעי המדויק. עבור 'מצב ניגודיות', להגדיר את הפרמטרים הבאים: התדירות: 18 MHz, לשדר עוצמה: 4%, (0.39 MPA), השוו את רווח: 30 dB, מוקדים: 6 & 10 מ"מ, השווה מצב: לא לינארית זמן פרץ,: 100% 0.1רוחב שניות, Beam: Wide.
3. תקשורת Aliquot 40 מיליליטר עובר כל לארבעה 50 מיליליטר צינורות חרוטי. מניחים על קרח.
4. מחממים 1 ליטר של מים בכוס 2 L על פלטה חשמלית. לשמור על 45 מעלות צלזיוס. להוסיף מזרק אחד ג'ל אולטרסאונד וPBS לכוס למחממת. לשמור על טמפרטורה זו על ידי ניטור עם מדחום בכל העת.
5. מניח בצד 11:50 1 מיליליטר מזרקים ו11:50 21 מחטי G לזריקה של microbubbles.

4. נוהל כירורגי

הערה: יש לך עוזר להכין את הבועות (שלב 5) ואילו המנתח מתחיל את ההליך כירורגי. הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מויטלי et al. ¹⁵

1. לאסוף E16.5 או E17.5 עובר מנקבת העכבר בהריון הבא נקע בצוואר הרחם.
   הערה: ההשפעות של הרדמה על עוברים עדיין לא נחקרו בפירוט ^16. שיטות נוספות, כוללים עריפת ראש, עשויות להיות op המתאיםמשא ולהקרבה של העכברים בהריון.
   1. גזור לפתוח את הבטן כדי לחשוף את הרחם ועוברים. בזהירות ובמהירות להסיר את הרחם על ידי חיתוך בטיפים של קרן הרחם (ניתוק כלי השחלות ורחם) וניתוק בנרתיק ובשלפוחית ​​השתן.
   2. בעזרת מלקחיים קיסם, להעביר את הרחם לצינור של 40 מיליליטר של תקשורת עובר קר כקרח מהר ככל האפשר מבלי לפגוע בעוברים. מחק את פגר העכבר.
2. לעבור למיקרוסקופ ושלב. להפקיד את הרחם לתוך צלחת תרבית תאי 100 x 20 מ"מ. העבר את הרחם לתוך צלחת חדשה מלאות ב50 מיליליטר תקשורת עובר טרי.
3. באמצעות מעוקר (70% תרסיס אתנול) מלקחיים עדינים, בעדינות לקרוע ולמשוך משם הקרומים החיצוניים של הרחם מתחיל בקצה אחד. לחשוף את decidua השליה, שק חלמון הקודקודית והקרום של רייכרט להפריד ולהסיר מצק החלמון הקרביים הבסיסי.
4. לנתח את העוברים אחד אחד, שמירה על y הקרבייםשקי olk שלמים וטיפול בשליה בעדינות ככל האפשר ^17. תשמור על עצמך, כדי למנוע קרע של שק החלמון כעוברים קופצים החוצה מייד.
   1. השתמש בכף המחוררת להעביר את העוברים למנה אחרת שמרה על קרח עם תקשורת עובר טרי. שמור את העוברים מקוררים עד צורך. לשנות את התקשורת בצלחת העובר כל שעה 1-1.5. בתנאים אלה הם עוברים קיימא עבור עד 4 שעות לאחר ניתוח.

5. Microbubble הכנה

הערה: בצע הדמיה מולקולרית עם אולטרסאונד בשתי microbubbles ממוקדת ולא ממוקד. ניסוי בודד יכול לדרוש כמה שרק 3 בקבוקונים נפרדים של microbubbles: microbubbles i) microbubbles נוגדן ממוקד, ii) נוגדן אלוטיפ שליטה ממוקדת וiii) microbubbles לא ממוקדת. חומר הניגוד מגיע כאבקה יבשה-הקפאה וחייב לעבור תהליך עם מי מלח לפני ההזרקה. יש ~ 2 x 10 ⁹ microbubbles בכל microb לא ממוקדבקבוקון ubble ו~ 8.8 x 10 ⁸ microbubbles בבקבוקונים מוכנים היעד. Microbubbles יציבה לתקופה של עד 3 שעות לאחר הכינון מחדש.

1. כינונה מחדש של בקבוקים מוכנים יעד
   הערה: דוגמאות להכנות מוכנות יעד: microbubbles endoglin ממוקדת (MB _E, עם עכברוש biotinylated MJ נוגדן 7/18 לendoglin עכבר; במתקן hybridoma בית); קולט כלי דם פקטור הגדילה של אנדותל 2 (VEGFR2) microbubbles ממוקדת (MB _V, עם אנטי עכבר CD309 ביוטין); microbubbles ממוקדת נוגדני IgG שליטת ₂ אלוטיפ חולדה (MB _C, אלוטיפ עכברוש ביוטין IgG ₂ שליטת מיקוד IgG2a עכבר).
   1. לדלל את פתרון הנוגדן (20 מיקרוגרם) לתוך 1 מיליליטר (נפח סופי) של תמיסת מלח. שמור על קרח.
   2. מלא מזרק עם מי מלח 1 מיליליטר, הסרת כל בועות האוויר. חיבור מחט G 21, להזריק את הפתרון באיטיות לתוך בקבוקון microbubble.
   3. לאט לאט למשוך את הבוכנה, הסרת 1 מיליליטר של אוויר, ולמשוך את המחט. בעדינותלהתסיס. לתת לעמוד 5 דקות על קרח.
      הערה: ניתן להשמיד microbubbles אולטראסאונד תחת סביבות בלחץ גבוה.
   4. אחרי הזמן שחלף, למלא מזרק חדש עם דילול הנוגדן ולהוסיף לבקבוקון המתאים. בעדינות להתסיס. תן לתערובת (2 עכשיו מיליליטר) לעמוד במשך 10 דקות. שמור על קרח. בהנחת נטיית משטח מלאה, מספר יגנד הכרוך הממוצע לmicrobubbles הוא כ ¹⁸ 7,600 ligands / מיקרומטר ^2.
2. כינונה מחדש של בקבוקים לא ממוקדים
   1. מלא מזרק עם מי מלח 1 מיליליטר, הסרת כל בועות האוויר. חיבור מחט G 21, להזריק את הפתרון באיטיות לתוך בקבוקון microbubble.
   2. לאט לאט למשוך את הבוכנה, הסרת 1 מיליליטר של אוויר, ולמשוך את המחט. בעדינות להתסיס. בואו לעמוד 5 דקות. להוסיף מלח 1 מיליליטר נוסף, כפי שתואר לעיל. בעדינות להתסיס ולתת לעמוד 10 דקות על קרח.
3. ספירת קולטר
   1. בעדינות להתסיס את בקבוקון microbubble הרצוי ולצייר ~50 μl של הפתרון לתוך מזרק 1 מיליליטר באמצעות מחט 21 G. להזריק את microbubbles לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר ריק.
   2. פיפטה מדגם 10 μl של פתרון מניות microbubble לתוך 10 מיליליטר של מדלל.
   3. לאחר ערבוב עדין, להעריך את הפצות ריכוז וגודל אוכלוסיית microbubble באמצעות ספירת קולטר (ראה רשימה של חומרים). רוזן מינימום של שלוש 50 מדידות μl (לדגימה בקבוקון) באמצעות צמצם 30 מיקרומטר.
4. Microbubbles מתכוננת להזרקה
   הערה: העוזר מבצע צעד זה כאשר "הזרקה של microbubbles לעוברי" (שלב 6) החלה. כל עובר מוזרק פעם אחת, עם הסוג של microbubble נבחר לכל זריקה שנבחר באופן אקראי על ידי העוזר כך שכל סוגי microbubble מופצים באופן שווה לאורך כל ההליך אבל בהתחשב בסדר אקראי. ודא המנתח הוא עיוור לסוג של בועה שהוזרק.
   1. לקבוע הדואר נפח של פתרון בועת המניות הנדרשים כדי לייצר ריכוז סופי של 1 x 10 ⁸ MB ​​/ מיליליטר בנפח של 400 μl (לחשב את עוצמת הקול באמצעות הריכוזים שנמדדו בבורסת 5.3.3). Aliquot הנפח המתאים של תמיסת מלח לתוך צינור microcentrifuge ריק.
   2. בעדינות להתסיס את בקבוקון microbubble נבחר ולצייר נפח עודף (~ 50 μl גדול יותר מזה שחושב לעיל) של הפתרון לתוך מזרק 1 מיליליטר באמצעות מחט 21 G. להזריק את microbubbles לתוך צינור microcentrifuge ריק.
   3. פיפטה הנפח ההכרחי של פתרון מניות microbubble ולהוסיף לaliquot של תמיסת מלח. מערבבים על ידי ערבוב בעדינות עם הקצה של פיפטה.
   4. צייר את פתרון microbubble המדולל לתוך מזרק נקי באמצעות מחט 21 G. הסרת המחט, לחסל את כל בועות אוויר מהמזרק ולצרף luer וצינורות. לאט לאט לדחוף את הפתרון לסוף עשיית צינורות בטוח שלא ליצור בועות אוויר.
   5. הכנס את syringe למשאבת עירוי מזרק מוגדר לוותר microbubbles בשיעור של 20 μl / min להיקף כולל של 20 μl. צרף מחט זכוכית משך לסוף הצינור. הזז את המשאבה הקרובה לבמה ההזרקה.

6. הזרקה של microbubbles לעוברי

1. באופן אקראי לבחור ולהסיר (עם כף מחוררת) עובר אחד מצלחת התקשורת מצוננת. מניחים בצלחת לנתיחה ממוקמת על הבמה אולטרסאונד תחת stereoscope ולהסיר את שק החלמון וקרומים מי שפיר עם המלקחיים העדינים, חיתוך / קורע מהצד שמופיע לפחות כלי דם (צד antimesometrial). זו מושגת בקלות על ידי פירסינג אזור סמוך לאזור הראש.
   1. לחתוך מספיק כדי להסיר את העובר מבפנים, אך לא יותר. לייצב את המנות לנתיחה באמצעות חתיכות קטנות של פלסטלינה.
2. בעדינות לתמרן את השק מסביב העובר. מקם את העובר בצד שלה, עם השליה וכלי טבור בחזית. באמצעות סיכות חרקים, להצמיד את שק החלמון (4 סיכות מומלצת) וקצוות של השליה כנדרשת כדי להדביק במקום. הימנע מכולים גדולים.
3. לשטוף את העובר עם מראש חימם 45 ° C PBS עד העובר מחיה. זהה את וריד הטבור ורשת כלי הדם הקשורים אליו. מקם את הצלחת כך שההזרקה ניתן לעשות בנוחות.
   הערה: ברגע שחמם, דם בעובר יתחיל לזרום, בעליל שאיבה בעורק הטבור. כאשר הזרימה מתחילה ראשונה, הוורידים יהיו בצבע אדום בוהק, עם הדם בשני כלי המופיעים במהירות זהה. הסניפים הנובעים מוריד הטבור בדרך כלל כיסוי אלה מעורק הטבור על פני השטח השליה.
4. ברגע שהעובר שהחיה, לכסות אותו (אך לא את השליה) עם ג'ל ארה"ב המחומם מראש, להיות בטוח כדי להסיר בעדינות את כל בועות אוויר (באמצעות המלקחיים העדינים) מסביב העובר. למעלה מעלה את המנה עם PBS המחומם מראש.
   הערה: שים עין על הרמה של solutiבמזרקי PBS וג'ל ולהוסיף מזרקים גיבוי לכוס החימום בהתאם לצורך.
5. הר מחט הזכוכית על כדור גדול של פלסטלינה בקצה הצלחת לנתיחה והכנס את קצה המחט לתוך PBS. בחירת וריד על פני השטח כוריוני של דיסק השליה, כרחוק מהסניף הראשי סביר, חתוך את הקצה לגודל באמצעות מספריים. הזרקה היא הקלה ביותר אם הקצה הוא לחתוך בזווית קלה. הסר את כל קצוות משוננים של הזכוכית באמצעות הקצה של המספריים באביב.
6. באמצעות משאבת המזרק, להזריק לאט פתרון microbubble ב 20 μl / min לתוך מחט הזכוכית עד שכל האוויר שגורש מקצה המחט וניתן לראות microbubbles לזרום בחופשיות לתוך PBS. עצור את המשאבה ולאפס עבור נפח הזרקה של 20 μl. אל תאפשר לאוויר להיכנס למערכת כלי הדם של העובר במהלך הזרקה.
7. הכנס את קצה מחט זכוכית בעדינות לתוך אחד הוורידים בשליה ולהבטיח שהוא נייח. תחבוט stereראש oscope ומיקום מתמר מעל העובר. ליזום הדמיה.

7. אולטראסאונד הדמיה מולקולרית

הערה: שימוש בתנאי ההדמיה קוי הניגוד שנקבעו בעבר, מקם את המתמר כדי שהעובר נמצא באופן שווה בין המוקדים בשעה 6 ו 10 מ"מ. ברגע שהמיקום, להתחיל את הזרקת בולוס של microbubbles. כאשר ההזרקה היא מלאה, להפעיל את הטיימר.

1. זלוף הדמיה
   1. ודא שהמספר המרבי של מסגרות למצב ניגוד ליניארית נבחר על ידי לחיצה על הכפתור "ניהול מחקר 'ולחיצה על הכרטיסייה' Prefs 'בחלק העליון של דפדפן המחקר. סמן את התיבה המתאימה בחלון 'העדפות'.
   2. התאם את הגדרות הדמיה על ידי ייזום הדמיה קוי. לחץ על הכפתור 'מצב ניגודיות' בלוח הבקרה. לחדד את רווח 2D על ידי התאמת הרווח & #8217; החיוג ל -30 dB, להפחית את הכח 4% באמצעות 'הכח' לחייג, להקטין את התדירות להרץ 1 באמצעות "התדר" לחייג ולהגדיר את רוחב האלומה (פינה השמאלית תחתונה) לרחב באמצעות גלגלת הכדור / העכבר.
      הערה: כל הפקדים נמצאים בלוח הבקרה של מערכת אולטרסאונד.
   3. ללכוד את כל שטיפה-ובפיזור של בולוס microbubble על ידי הקלטת cine לולאת 20 דקות בקצב פריימים של 1 הרץ. סריקה / הקפאה לחץ כדי להתחיל את רכישת נתונים.
   4. ברגע שהרצף המלא של תמונות כבר נתפס, לחץ על הכפתור 'חנות cine' ממוקם בלוח הבקרה לשמירת הרצף של תמונות במאגר המערכת. המערכת יוצרת לולאת cine-חותמת תאריך של נתוני מודל הניגוד ליניארית רכשו.
2. ההדמיה Microbubble ממוקדת
   1. תחת 'Prefs', קבע את זמן פרץ 0.1 שניות. הגדר את הפרמטרים ההדמיה המתאימים באמצעות הפקדים described לעיל (7.1.2.).
   2. ליזום הדמיה ניגוד ליניארית על ידי לחיצה על הכפתור "מצב ניגודיות 'בלוח הבקרה. להבטיח את העובר ממוקם כראוי תחת מתמר ושזרימת חומר ניגוד microbubble של דרך את העובר נראית בתמונה מצב ניגודיות קוי.
   3. כדי להעריך microbubble ממוקד מחייב במהלך בדיקות הדמיה מולקולריות עוברית, לאפשר microbubbles לזרום באין מפריעה במשך 3 דקות ו -40 שניות לאחר השלמת ההזרקה. הפעם הוא לאפשר שמירה של microbubbles במחזור. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי לעצור הדמיה בתקופה זו.
   4. בדקות 3 ו -40 שניות, הדמיה קורות חיים כדי לוודא שהעובר עדיין גלוי, מכוסה כראוי עם PBS, ושmicrobubbles תמשיך לזרום. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי ליזום הדמיה.
   5. לרכוש את רצף שיבוש / חידוש שבלאחר הזרקה 3 דקות ו -50 שניות על ידי הקלטה מראש בהרס 'רצף 'tion אקוסטית תגובה ב -29 הרץ. 'הסריקה / הקפאה "כדי להתחיל ברכישת נתונים. בהודעת הזרקת 4 דקות ^18,19, ליזום פרץ אקוסטי בתדירות גבוהה 0.1 שניות. לחץ על כפתור 'הפרץ "ליישם פרץ.
   6. תמשיך להקליט מסגרות לשארית הרצף (עד קו החיץ מלא) ולשמור את cine הלולאה על ידי לחיצה על "חנות cine".
   7. לאסוף cine לולאה נוספת של מחזור microbubbles. רצף זה שלאחר מכן "לאחר ההרס" הדמיה הנחה הוא להכיל אותות בועה במחזור רק שמלאו את הקורה. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי ליזום הדמיה ו'חנות cine' כדי לאסוף את התמונות.
   8. תווית לולאות cine לאחר ההדמיה כל עובר. "ניהול המחקר 'לחץ, סמן את הקובץ באמצעות מכבש הכדור ו'בחר' כפתור," תווית תמונה "עיתונות ושם כראוי.

8. טיפול בעוברים לאחר הזרקה

1. הדמיה הודעה, להעביר את המתמר, להוציא סיכת העובר ולהרדים (באמצעות עריפת ראש, נקע בצוואר הרחם, מחנק פחמן דו חמצני, או הרדמה ואחרי הקפאה או קיבעון מהיר) כרצוי.
2. לכל זריקת עובר לאחר מכן יש להשתמש בקטע צלחת לנתיחה, מחט, מזרק וצינורות טרי, עם הכנה של המנה הבאה של מקום לקיחת פתרון הזרקת microbubble במהלך נתיחה ותחייה.
3. להציל את דגימות רקמה (למשל, זנב, מוח) לניתוחים נוספים (למשל, גנוטיפ נקבע על ידי ניתוח PCR של DNA המבודד זנב, מכתים lacZ, או אמצעים חצי כמותית של ביטוי סמן ביולוגי באמצעות כתמים מערביים ^21).

תוצאות

ההזרקה של חומר הניגוד אולטרסאונד לעוברי עכבר לשעבר הרחם תלויה בבידוד המוצלח של חיים, עובר שלב מאוחר של הריון מהרחם והתחזוקה של כדאיות במהלך ההזרקה וההדמיה אולטרסאונד בנושא. ברגע שהעובר כבר exteriorized ואת מיקומו, כפי שמוצג באיור 1, הזרקה זהירה של חומר ניגוד ?...

Discussion

הסוכנים בניגוד אולטראסאונד הוזרקו לעוברי עכבר הריון בשלב מאוחר ותמונות עם ניגודיות קוי נרכשו למדוד פרמטרים זלוף וממוקד microbubble מחייב. הדמיה מוצלחת של microbubbles בתוך כלי דם עובריים הייתה תלויה במספר גורמים, את כדאיות העובר להיות הראשונה. כל הציוד ומכשירים הוכנו מראש כדי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08