高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング

要約

ここでは、生きている、孤立した後期妊娠期のマウス胚に超音波マイクロバブル造影剤を注入するためのプロトコルを提示する。この方法は、灌流パラメータ及びコントラスト強調高周波超音波イメージングを用いて、胚内の血管の分子マーカーの研究を可能にする。

要約

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

概要

造影超音波イメージングは​​、血管環境を視覚化し、特徴付けるために、マイクロバブル造影剤を利用する。これらの物質は、微小循環、血管分布および心血管機能の非侵襲的評価を可能に。また、気泡表面の改質が可能な血管イベントの分子の超音波イメージングを行う血管形成、アテローム性動脈硬化症および炎症^1,2の前臨床用途で実証されるように、内皮細胞のバイオマーカーに結合する標的化マイクロバブルをもたらすことができる。造影超音波は、したがって、健康と病気の血管の状態^3-5に影響^を与える複雑かつ多様な環境を識別するために使用することができる。

年の過去数には、マイクロバブルイメージングの有用性への関心は汎用性の高いマウス胚モデルに拡張しました。哺乳類の発生のモデルとして、胚の血管系へのマイクロバブルの導入は、生理的な強化開発循環系（ 例えば 、血流量、心拍出量）およびトランスジェニック例での研究と心疾患^6,7の変異マウスモデルをターゲットとは、遺伝的要因が心血管機能を変化させる方法への洞察をもたらすことができる。実際には、胚の脳血管系の定量的および定性的な二次元分析は、既に^8を達成している。さらに、マウス胚は、生体内での血管マーカーに標的マイクロバブルの結合を調べるための優れたモデルとして提示します。 Bartelle ら ^9は 、例えば、Biotag-BirAをトランスジェニック胚に結合し、血管構造を検討対象と評価するために胚心臓の心室にアビジンマイクロバブルを導入しています。診療所にこの技術を翻訳において重要なベンチマーク - ヘテロ接合およびホモ接合性マウスモデルの生成は、分子の超音波の定量的性質を規定することを目的と腫瘍モデル研究のための代用として使用することができる。

マイクロバブルは、最も頻繁に開腹^8-10を介して露出し、単一の胚に心臓内注射を経由して胎児の血液循環に導入される。 子宮内注射では 、しかし、多くの課題に直面しています。これらは、注射の指導、母親と体外胚の動きに対抗する必要性、母親における血行動態の生存率の維持および¹¹の^出血による麻酔の合併症の長期的影響に対処体外胚を、含む。従って、調査の目的は、単離されたリビング後期胚¹²にマイクロバブルを注入するための技術を開発することであった。このオプションは、噴射制御やポジショニング、障害物のない撮像面の再現性、および単純化された画像解析と定量化の面でより多くの自由を提供しています。

本研究では、foの生きているマウスの胚にマイクロバブルを注入するための新規な手順を概説Rマイクロバブル速度論的挙動を研究するとの目的は、内因性の内皮表面マーカーに結合するマイクロバブルをターゲットに勉強。非線形コントラスト特有の超音波イメージングは​​、ピークエンハンスメント（PE）、ウォッシュアウト速度および時間孤立E17.5胚において（TTP）をピークに含む基本的な灌流パラメータの数を測定するために使用される。我々はまた、活性な血管新生¹³の部位で血管内皮細胞におけるその高い発現をエンドグリンは、臨床的に関連する標的で機能するトランスジェニックマウスモデルの胚グリン損失分子音波の定量的性質を評価するための胚のモデルの妥当性を実証する。エンドグリンを標的（MB _E）の付着、ラットアイソタイプIgGを₂コントロール（MB _C）および非標的（MB _U）マイクロバブルは、ヘテロ接合グリン（ 工学 ^+/-）で評価され、ホモ接合エンドグリン（ 工 ^{+ / +）}の胚を表す。目標とビンディの分析ngは、分子の超音波は、エンドグリン遺伝子型を区別し、定量化可能な分子の超音波レベルに受容体密度に関連することが可能であることを明らかにする。

プロトコル

注：この研究で行った実験手順はサニーブルック研究所（トロント、オンタリオ州、カナダ）での動物実験委員会によって承認された。動物の人道的な扱いのための手順は、すべての回で観察されなければならない。これは、治験責任医師は、超音波撮像システムの基本動作の訓練を受けているものとする。このプロトコルは、2人で最適に動作。

1.動物モデル

1. メイトCD-1雄と雌ハツカネズミ潅流研究のための野生型胚を得る。
2. Bourdeau ら ¹⁴によって記載されるように、分子イメージング研究のために、129 / Olaの由来の胚性幹細胞を用いた相同組換えによって工学+/-マウスを作製する。
   1. 戻し交雑B6- 工学 ^+/-マウスは、親切にCD-1バックグラウンドに、博士ミシェルLetarteから取得した。使用工学 ^+/- CD-1戻し交配胚、ならびにそれらの工学 ^{+ / +}同腹コntrols。段階胚を生成するために、マウスメイト。

2.実験の準備

1. マウスの交配を開始し、毎日のプラグを確認してください。胎生0.5膣栓が観察された日の正午と定義される。
2. 500にウシ胎児血清50mlの5 1 M HEPES mlのペニシリン - ストレプトマイシンを5ml（10,000単位のペニシリン10,000μgのストレプトマイシン）を添加することにより、胚培地を調製mlのダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（DMEM）（4500 mgの/ L）。ホイルで瓶をラップし、4℃で冷やしておく。
3. 20分間140×gで50ミリリットルコニカルチューブで遠心し明確な超音波ゲル。 30ミリリットル注射器にゲルを上に描画します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で（マーク）は、追加の30ミリリットル注射器を記入し、取っておく。胚の1リットルは一般的に、超音波ゲルの2-3注射器とPBSの4の注射器との間で必要になります。
4. 約30ガラス針を引き、優しく粘土のストリップに固定します100×20mmの細胞培養皿で。これは針が取り扱い中に分離し、安全であることを保証します。ヒーター77、サブマグネット55、主磁石70：ガラスの引き手を使用して、フィラメントと1×90ミリメートルのガラスキャピラリーに次の設定を使用します。
5. ベースに硬化剤の8体積比：1を使用して、（自身の一品を受け取るごみ内の各胚を確保するのに十分な）十一時五十解剖プレートを準備します。を50mlコニカルチューブに塩基を40mlを注ぐ。 5〜6ミリリットル硬化剤を追加し、木製の棒でかき混ぜる。
   1. 約半分にそれぞれ充填し、60×15mmの培養皿に注ぐ。スタンドO / Nが設定してみましょう。
6. （：0.79ミリメートル内径）ポリ塩化ビニル（PVC）チューブの400ミリメートル長い作品にメスルアーを取り付けます。チューブは快適に超音波ステージにシリンジポンプから到達しなければならない。

3.実験の設定

1. 3Dモーターとリニアアレイ21 MHで手術用顕微鏡下でのイメージングプラットフォームを配置Z変換器。
   1. オリエントレールマウントするようなプラットフォームは、顕微鏡の真下に位置してステージと、左側にあります。
   2. プラットフォームの延びるアームのボールジョイントに3Dモーターを取り付けます。前方を向いた、モーターにマウントクイックリリースへの変換器クランプのクイックリリースポストをねじ込み、ラッチを固定するクランプでトランスデューサヘッドを配置します。
   3. カートのフロントパネル上のアクティブポートにトランスデューサ·コネクタを固定します。マシンをオンにします。
2. 分子イメージング研究のために「心臓病」設定を選択、21 MHzの超音波トランスデューサを開始し、潅流研究のための「全般」。正確な中間の位置にすべての時間利得補償スライダーをシフトします。周波数：：18 MHzの、動力を伝達：4％、（0.39 MPa）を、ゲインコントラスト：30デシベル、巣：6＆10ミリメートル、モードコントラスト：非線形、バースト時間：100％ 'をコントラストモード」の場合は、次のパラメータを設定0.1で秒、ビーム幅：ワイド。
3. アリコート40ミリリットル胚メディア4 50ミリリットルコニカルチューブにそれぞれ。氷の上に置きます。
4. ホットプレート上で2リットルのビーカーに1Lの水を加熱する。 45℃で維持する。予熱するビーカーに超音波ゲルとPBSの1注射器を追加します。すべての回で温度計を監視することで、この温度を維持する。
5. 十二1ミリリットル注射器とマイクロバブルを注入するための10 21〜12のG針に脇十設定してください。

4.手術手順

注：外科医が手術手順を開始しながら、アシスタントは、気泡（ステージ5）を調製持っている。プロトコルは、ここで説明するホワイトリーらから適応されています^。15

1. 頸椎脱臼以下の妊娠雌マウスからE16.5またはE17.5胚を収集します。
   注：胎児への麻酔の効果はまだ詳細¹⁶で検討されていない。断頭含むさらなる方法は、適切なオペアンプとすることができる妊娠マウスの犠牲のためション。
   1. 子宮＆胚を明らかにするために腹部を切開し。慎重かつ迅速（卵巣と子宮の血管を切断する）子宮角の先端に切断し、膣と膀胱で切断することによって子宮を取り除く。
   2. 破片の鉗子を使用して、胚を損傷することなく、可能な限り迅速に氷冷した胚培地を40mlのチューブに子宮に移す。マウスの死体を捨てる。
2. 顕微鏡とステージに再配置します。 100×20ミリメートルの細胞培養皿に子宮を堆積させる。 50ミリリットル新鮮胚メディアで満たされた新しい皿に子宮を転送します。
3. 滅菌した（70％エタノールスプレー）微細鉗子を用いて、静かに一端で始まり、子宮の外膜を引き裂くと引き離す。胎盤の脱落膜、壁側卵黄嚢と分離し、基盤となる内臓卵黄嚢から削除するライヘルト膜を公開します。
4. 内臓Yを保ち、一つ一つの胚を解剖OLK嚢無傷として優しく¹⁷できるだけ胎盤を扱う。胚はすぐに飛び出しとして卵黄嚢の破裂を避けるように注意してください。
   1. 新鮮胚メディアに氷上に維持し、別の皿に胚を移動するために穴のあいたスプーンを使用してください。必要になるまで冷やした胚を保管してください。胚皿にすべての1〜1.5時間後にメディアを変更します。これらの条件では胚は解剖後に最大4時間のために実行可能である。

5.マイクロバブルの準備

注：両方のターゲットと非標的マイクロバブルを用いた超音波との分子イメージングを実行します。 I）抗体標的マイクロバブル、II）対照アイソタイプ抗体標的マイクロバブル及びiii）非標的マイクロバブル：単一の実験は、最大3としてマイクロバブルの別々のバイアルを必要とすることができます。造影剤は、乾燥凍結粉末として来て、注射の前に生理食塩水で再構成する必要があります。各非標的がMicroBで〜2×10 ⁹マイクロバブルがありますubbleバイアルと〜ターゲット準備バイアル中で8.8×10 ⁸マイクロバブル。マイクロバブルは、再構成後最大3時間安定である。

1. ターゲットレディバイアルの再構成
   注：ターゲット準備製剤の例：グリン標的マイクロバブル（マウスエンドグリンにビオチン化ラットMJ 7/18抗体を用いたMB _E;家のハイブリドーマ施設で）;血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）標的マイクロバブル（MB _V、ビオチン抗マウスCD309を有する）;ラットアイソタイプIgGの₂コントロール抗体標的マイクロバブル（MB _C、ビオチンラットアイソタイプIgGを₂コントロールマウスIgG2aをターゲット）。
   1. 1mlの生理食塩水に抗体溶液（20μg）を（最終体積）に希釈する。氷の上に保管してください。
   2. すべての気泡を除去、1ミリリットルの生理食塩水で注射器を埋める。 21 G針を取り付け、マイクロバブルバイアルにゆっくりとソリューションを注入する。
   3. ゆっくりと空気の1ミリリットルを除去し、プランジャーを撤回し、針を撤回。優しく攪拌する。氷上で5分間放置してみましょう。
      注：超音波マイクロバブルは、高圧環境下で破壊することができる。
   4. 経過時間後、抗体希釈新しいシリンジに充填し、適切なバイアルに加える。静かに攪拌する。混合物（現在2ml）を10分間放置する。氷の上に保管してください。完全な表面結合を仮定すると、マイクロバブルのための結合リガンドの平均数は約¹⁸ 7600リガンド^/μm2である。
2. 非標的バイアルの再構成
   1. すべての気泡を除去、1ミリリットルの生理食塩水で注射器を埋める。 21 G針を取り付け、マイクロバブルバイアルにゆっくりとソリューションを注入する。
   2. ゆっくりと空気の1ミリリットルを除去し、プランジャーを撤回し、針を撤回。静かに攪拌する。 5分間放置してみましょう。上記のように、さらに1ミリリットルの生理食塩水を加える。静かに攪拌し、氷上に10分間放置。
3. コー​​ルターカウンティング
   1. 静かに希望マイクロバブルバイアルを攪拌し、描く〜21 Gの針を用いて1ミリリットル注射器に溶液50​​μl。空の2ミリリットルのマイクロチューブにマイクロバブルを注入します。
   2. 希釈剤の10ミリリットルにマイクロバブル原液10μlのサンプルをピペットで。
   3. 穏やかに混合した後、コールターカウント（材料のリストを参照）を使用して、マイクロバブルの人口集中とサイズ分布を評価する。 30μmのアパーチャーを用いて（バイアルサンプルあたり）350μlの測定値の最小値をカウントします。
4. 注射用マイクロバブルの準備
   注：「胚にマイクロバブルの注入を「時のアシスタントは、この手順を実行する（ステップ6）が開始される。各胚をランダムにマイクロバブルのすべてのタイプが均等手順全体に分布が、ランダムな順序で示されているようにアシスタントによって選択される各噴射のために選択されたマイクロバブルの種類、一回注射する。外科医が注入されて、バブルのタイプに盲目であることを確認してください。
   1. 目を決定します400μlの1×10 ⁸メガバイト/ mlの最終濃度を生成するのに必要な株式バブル溶液の電子ボリューム（5.3.3で測定ストック濃度を使用して体積を計算する）。空のマイクロ遠心チューブに生理食塩水の対応するボリュームを分注し。
   2. 静かに選択されたマイクロバブルバイアルを攪拌し、21 Gの針を用いて1ミリリットル注射器に液の過剰量（上記の計算されたものよりも〜50μL以上）を描く。空のマイクロ遠心チューブにマイクロバブルを注入します。
   3. マイクロバブル原液必要な容積をピペット生理食塩水のアリコートに加える。ピペットの先端で穏やかに撹拌することにより混合します。
   4. 21 G針を使用してクリーンなシリンジに希釈されたマイクロバブルソリューションを描画します。針を取り外す、シリンジから気泡を排除し、ルアーやチューブを取り付けます。ゆっくりと気泡を発生させないことを確認チューブ作りの最後にソリューションをプッシュ。
   5. syrinを挿入20μlの総容積のために20μl/分の速度でマイクロバブルを分配するように設定されたシリンジ注入ポンプに葛。チューブの端に引っ張らガラス針を取り付けます。噴射ステージに近いポンプを移動します。

胚にマイクロバブルの6インジェクション

1. ランダムに選択し、チルドメディア皿から（あきスプーンで）1胚を削除します。ステレオスコープの下で超音波ステージ上に位置して解剖皿に置き、少なくとも血管化表示側（antimesometrial側）から引き裂く/切断、細かい鉗子で卵黄嚢と羊膜を取り除く。これは、最も簡単に頭部領域に隣接する領域を穿孔することによって達成される。
   1. 内から胚を除去するのに十分、しかしそれ以上をカットします。粘土の小片を使って解剖料理を安定させます。
2. 静かに胚の周囲から嚢を操縦。胎盤と、その側に胚を置き、前の臍帯血管。卵黄嚢を突き止める、虫ピンを使用して、（4ピンが推奨）し、必要に応じて、胎盤のエッジが所定の位置に固定する。主要な血管を避けてください。
3. 胚が復活するまで予め温め、45℃のPBSで胚を洗ってください。臍帯静脈とその関連する血管ネットワークを識別します。注射が快適に行うことができるように、料理を置きます。
   注：一度温め、胚における血液が目に見えて臍動脈にポンピング、流動し始める。流れが最初に開始すると、静脈が両方の容器内の血はすぐに同一の登場で、鮮やかな赤になります。臍帯静脈から生じる枝は通常、胎盤表面上の臍動脈からのものを重ねる。
4. 胚が復活したら、微妙に胚の周りから（細かい鉗子を使用して）すべての気泡を除去するようにしてくださいされて、予め温め米国ゲルでそれ（ただし、胎盤）をカバー。予め温めておいたPBSで皿を補充する必要があります。
   注：solutiのレベルに目が離せないPBSおよびゲル注射器内に、必要に応じて加熱ビーカーにバックアップ注射器を追加します。
5. 解剖皿の縁​​に粘土の大ボールにガラス針をマウントし、PBS中に針の端を挿入します。限り合理的なように、メインブランチから、胎盤ディスクの絨毛表面の静脈の選択、ハサミを使ってサイズに先端をトリミング。先端がわずかな角度で切断された場合の注入が最も簡単です。春のはさみの刃を用いて、ガラスのいずれかのギザギザを削除します。
6. 全ての空気が針先端から放出されるマイクロバブルはPBS中に自由に流れることが分かるまで、シリンジポンプを用いて、ゆっくりとガラス針に20μlの/分でマイクロバブル液を注入する。ポンプを停止し、20μLの注入量のためにリセットする。空気が注入中に胚の血管系に入らないようにしてください。
7. 胎盤における静脈の一つにそっとガラス針の先端を挿入し、それが不動であることを確認。 Stereのを離れてスイングoscopeヘッドと位置胚上記トランスデューサ。イメージングを開始します。

7.超音波分子イメージング

注：胚6における焦点から10mmの間で均等に位置するように予め設定されたコントラストの非線形撮影条件を使用して、トランスデューサを位置付ける。一度に配置、マイクロバブルのボーラス注射を開始します。注入が完了したら、タイマーを開始する。

1. 灌流イメージング
   1. 非線形のコントラストモードのための最大フレーム数が「 研究管理 」ボタンを押して、研究·ブラウザの上部にある[ 環境設定 ]タブをクリックすることで選択されていることを確認。 「 設定 」ウィンドウで、適切なチェックボックスをオンにします。
   2. 非線形イメージングを開始することによって画像化設定を調整します。コントロールパネルの「 コントラストモード 」ボタンを押します。 「 ゲイン ＆＃を調整することにより、2次元ゲインを絞り込み8217。 、30デシベルにダイヤル「 電源 」ダイヤルを使用して4％に電力を低減、「 周波数 」にダイヤルし、広いローラーボール/マウスを使用してビーム幅（左下隅）に設定を使用して、1 Hzに周波数を下げる。
      注：すべてのコントロールは、超音波システムのコントロールパネルにあります。
   3. 1 60Hzのフレームレートで20分シネループを記録することによって、マイクロバブルボーラスの全体の洗浄、および散逸をキャプチャ。データ収集を開始するキーを押してスキャン/フリーズ。
   4. 画像の全配列が捕捉されると、システムバッファに画像のシーケンスを保存するために、コントロールパネル上に位置する「 シネストア 」ボタンを押す。システムは、取得した非線形のコントラストモデルデータの日付スタンプ付きシネループを作成します。
2. ターゲットマイクロバブルイメージング
   1. 「 環境設定 」の下で、0.1秒にバースト時間を設定します。コントロールDESを使用して、適切な撮像パラメータを設定します。上記cribed（7.1.2。）。
   2. コントロールパネル上の「 コントラストモード 」ボタンを押すことにより、非線形コントラスト撮影を開始する。胚が正しく変換器の下に位置し、胚を経てマイクロバブル造影剤の流れが非線形コントラストモード画像に表示されていることをされていることを確認。
   3. 胚性分子イメージング研究の間に結合ターゲットを絞ったマイクロバブルを評価するために、マイクロバブル注入が完了した後に3分40秒のために邪魔されずに循環させることができます。この時間は、循環するマイクロバブルの保持を可能にすることである。プレスこの間に画像化を停止するには、 'スキャン/フリーズ」。
   4. 3分40秒で、胚は、まだ表示されている十分にPBSで覆われており、マイクロバブルを循環し続けていることを確認するために撮影を再開する。プレスイメージングを開始するために「スキャン/フリーズ」。
   5. 「事前にdestrucを記録することによって、3分50秒のポスト噴射で破壊/補充シーケンスを取得するる「29 Hzの音響応答シーケンス。プレスデータ収集を開始するために「スキャン/フリーズ」。 4分後に注射^18,19で、0.1秒の高周波音響バーストを開始する。バーストを実装するために「バースト」ボタンを押します。
   6. （バッファラインが一杯になるまで）シーケンスの残りのフレームを記録し、「シネストア」を押すことで、シネ·ループを保存し続けます。
   7. 循環するマイクロバブルの追加のシネループを収集します。これ以降の「ポスト破壊 'イメージングシーケンスは、ビームを補充した場合のみ、循環バブル信号を含むと仮定される。プレス画像を収集するために画像化し、「シネストア」を開始するために「スキャン/フリーズ」。
   8. 各胚を画像化した後にシネループにラベルを付けます。プレス「研究マネジメント」、ローラーボールを使用してファイルを強調表示し、適切にボタンを押して「画像のラベル」と名前を「選択」。

注入後の胚の8取り扱い

1. ポストイメージング、必要に応じて（断頭、頸椎脱臼、二酸化炭素窒息、または急速凍結または固定が続く麻酔を介して）、変換器を移動する胚の固定を解除し、安楽死させる。
2. 後続の各胚注入新鮮な解剖皿のために、注射針、注射器とチューブセグメントは解剖と復活の間に起こるマイクロバブル注射液の次のバッチの準備を、使用する必要があります。
3. さらなる分析のための組織サンプル（ 例えば 、尾、脳）を保存（ 例えば 、単離された尾DNA、LacZ染色、またはウェスタンブロット^21を使用してバイオマーカー発現の半定量的尺度のPCR解析により決定遺伝子型決定）。

結果

子宮外でのマウス胚への超音波造影剤の注入は、注入および関連する超音波撮像にわたって生存能力の子宮およびメンテナンスから後期妊娠期胚生活の正常な分離に依存する。胚体外に位置決めされた後、図1に示すように、胚の血管系への造影剤の慎重な注入が可能である。 E17.5マウス胚の典型的なBモード超音波画像は、 図2Aに示されている。マイクロバブ...

ディスカッション

超音波造影剤は、後期妊娠マウス胚および非線形コントラスト画像に注射し、灌流パラメータを測定するために取得し、結合マイクロバブルを標的とした。胚の血管系内のマイクロバブルの成功イメージングは​​、多くの要因、最初のもの胚の生存率に依存していた。すべての機器および装置は、注入の開始に子宮から胚を単離するために必要な時間を最小にするために、事前に調製した?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08