Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.

Résumé

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Introduction

échographie de rehaussement du contraste permet l'utilisation d'agents de contraste à microbulles de visualiser et caractériser l'environnement vasculaire. Ces agents permettent l'évaluation non invasive de la microcirculation, la vascularisation et la fonction cardiovasculaire. En outre, la modification de la surface de la bulle peut conduire à la liaison à microbulles ciblée biomarqueurs endotheliales, comme démontré dans des applications précliniques de l'angiogenèse, l'athérosclérose et l'inflammation faisant ^1,2 imagerie par ultrasons moléculaire des événements vasculaires possibles. Échographie de contraste amélioré peut donc être utilisée pour identifier les environnements complexes et variés qui influencent états vasculaires sains et malades ^3-5.

Dans le cours des dernières années, l'intérêt pour l'utilité de l'imagerie de microbulles a étendu au modèle polyvalent d'embryon de souris. Comme un modèle de développement des mammifères, l'introduction de microbulles dans le système vasculaire embryonnaire améliore physiologiqueétude du système circulatoire en développement (par exemple, le flux sanguin, le débit cardiaque) et en cas de transgéniques et des modèles de souris mutantes ciblés de la maladie cardiaque ^6,7, peut fournir des indications sur la façon dont les facteurs génétiques de modifier la fonction cardiovasculaire. En fait, 2D analyse quantitative et qualitative du cerveau embryonnaire vasculaire ont déjà été atteints ^8. En outre, l'embryon de souris présente comme un excellent modèle pour l'examen de la liaison de microbulles ciblées à des marqueurs vasculaires in vivo. Bartelle et al. ^9, par exemple, ont mis en place des microbulles avidine en embryon ventricules cardiaque pour évaluer la liaison ciblées dans BIO TAG-Bira embryons transgéniques et d'examiner l'anatomie vasculaire. La génération de modèles hétérozygotes et homozygotes souris peut également être utilisé comme un substitut pour des études de modèle de tumeur visant à définir la nature quantitative de l'échographie moléculaire - une étape importante dans la traduction de cette technique à la clinique.

microbulles sont le plus souvent introduit à la circulation embryonnaire par injections intra-cardiaque dans des embryons simples exposés à travers une laparotomie ^8-10. Dans injections in utero, cependant, faire face à un certain nombre de défis. Il se agit notamment des conseils d'injection, la nécessité de contrer le mouvement dans la mère et l'embryon extériorisé, le maintien de la viabilité hémodynamique chez la mère et embryons extériorisés, portant sur ​​les effets à long terme de l'anesthésie et de complications dues à un saignement ^11. Par conséquent, l'objectif de l'enquête était de développer une technique pour injecter microbulles en vie isolé des embryons à un stade avancé ^12. Cette option offre plus de liberté en matière de contrôle d'injection et le positionnement, la reproductibilité du plan d'imagerie sans entrave, et l'analyse d'image simplifiée et la quantification.

Dans la présente étude, nous présentons une nouvelle procédure pour l'injection de microbulles en vivant embryons murins for les fins de l'étude du comportement cinétique microbulles et d'étudier la liaison à des marqueurs de surface endothéliales endogènes microbulles ciblées. Non linéaire échographie de contraste spécifique est utilisé pour mesurer un certain nombre de paramètres de perfusion de base, y compris la mise en valeur de crête (PE), lavez-la fréquence et de temps pour culminer (TTP) dans isolées embryons E17.5. Nous démontrons également la validité du modèle d'embryons pour évaluer la nature quantitative de l'échographie moléculaire dans une perte de endogline embryonnaire de modèle de souris fonction transgénique, où endogline est une cible cliniquement pertinente en raison de sa forte expression dans les cellules endothéliales vasculaires dans les sites de l'angiogenèse active ¹³ . L'adhésion de l'endogline ciblée (MB _E), isotype de rat IgG ₂ commande (MB _C) et non ciblées (MB _U) microbulles est évaluée dans endogline hétérozygote ^(+/- Eng) et homozygote endogline (ENG ^{+ / +)} exprimant des embryons. Analyse du bindi cibléeng révèle que l'échographie moléculaire est capable de différencier entre les génotypes de endogline et concernant les densités de récepteurs à des niveaux moléculaires quantifiables à ultrasons.

Protocole

REMARQUE: Les procédures expérimentales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soins des animaux au Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procédures pour le traitement sans cruauté des animaux doivent être respectées en tout temps. Il est supposé que l'enquêteur est formé dans le fonctionnement de base d'un système d'imagerie par ultrasons. Ce protocole fonctionne mieux avec deux personnes.

1. Modèles animaux

1. Compagnon CD-1 mâle et femelle Mus musculus d'obtenir des embryons de type sauvage pour les études de perfusion.
2. Pour les études d'imagerie moléculaire, de générer la souris Eng par recombinaison homologue en utilisant des cellules souches embryonnaires de 129 origine / Ola comme décrit par Bourdeau et al. ^14.
   1. Les souris ^de rétrocroisement B6- Eng, veuillez acquis du Dr Michelle Letarte, sur le CD-1 arrière-plan. Le CD-1 ^Utiliser Eng rétrocroisés embryons, ainsi que leur Eng ^{+ / +} co littermatentrols. Accoupler les souris de produire des embryons mis en scène.

2. Préparation expérimentale

1. Initier accouplement de souris et de vérifier bouchons quotidienne. Jour embryonnaire 0,5 est défini comme midi de la journée d'un bouchon vaginal est observée.
2. Préparer support d'embryon par addition de 50 ml de sérum bovin fœtal, 5 ml de 1 M de HEPES et 5 ml de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de pénicilline, 10 000 ug de streptomycine) à 500 ml du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec haute teneur en glucose (4500 mg / L). Envelopper la bouteille dans du papier et de garder réfrigérés à 4 ° C.
3. Centrifugeuse gel échographique clair dans 50 ml tubes coniques à 140 g pendant 20 min. Dessinez gélifier jusqu'à 30 ml dans des seringues. Remplissez supplémentaires (marqué) 30 ml seringues avec tampon phosphate salin (PBS) et mettre de côté. Une portée d'embryons exige généralement entre 2-3 seringues de gel de l'échographie et 4 seringues de PBS.
4. Tirez environ 30 aiguilles de verre et serrez doucement pour une bande de pâte à modelerdans une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 mm. Cela assure que les aiguilles sont séparées et sûr pendant la manipulation. Aide d'un extracteur de verre, utilisez les paramètres suivants sur 1 x 90 mm capillaires de verre à filament: Chauffeur 77, 55 Sous aimant, aimant principal 70.
5. Préparer dix à douze plaques de dissection (assez pour se assurer que chaque embryon dans une litière recevra sa propre boîte), en utilisant un ratio de 1: 8 en volume d'agent de durcissement à la base. Verser 40 ml de base dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 5-6 ml agent de durcissement et remuer avec un bâton en bois.
   1. Verser dans 60 x boîtes de culture de 15 mm, chaque remplissage de moitié environ. Laisser reposer O / N à définir.
6. Attacher Luer femelle à 400 mm de longs morceaux de chlorure de polyvinyle (PVC) tube (diamètre interne: 0,79 mm). Le tube doit atteindre à partir de la pompe à seringue pour l'étape d'ultrasons confortablement.

3. expérimental

1. Disposer la plate-forme d'imagerie sous le microscope chirurgical avec un moteur 3D et réseau linéaire 21 MHz transducteur.
   1. Orient la plate-forme de sorte que le rail de montage est sur la gauche, à l'étape positionné directement sous le microscope.
   2. Fixer le moteur 3D à la rotule du bras se étendant de la plate-forme. Vissez le poste de libération rapide de la pince de la sonde dans la libération rapide monter sur le moteur, vers l'avant, et de positionner la tête de transducteur dans la pince, la fixation de la serrure.
   3. Fixez le connecteur de la sonde dans le port actif sur le panneau avant du panier. Allumer la machine.
2. Initier le transducteur à ultrasons de 21 MHz, la sélection du réglage 'de cardiologie »pour des études d'imagerie moléculaire, et« générale »pour les études de perfusion. Maj tous les curseurs temps gain compensation à la position milieu exact. Pour «mode Contraste ', définir les paramètres suivants: Fréquence: 18 MHz, la puissance de transmission: 4%, (0,39 MPa), contraste Gain: 30 dB, Foci: 6 et 10 mm, Contraste Mode: non linéaire, le temps d'éclatement: 100% à 0,1largeur sec, faisceau: Large.
3. Aliquotes 40 ml de milieu d'embryon chacun en quatre 50 ml tubes coniques. Placez sur la glace.
4. Chauffer 1 L d'eau dans un bécher de 2 L. sur une plaque chauffante. Maintenir à 45 ° C. Ajouter une seringue de gel d'ultrasons et PBS dans le bécher pour préchauffer. Maintenir cette température par le contrôle d'un thermomètre à tout moment.
5. Mettre de côté dix à douze seringues et 1 ml de dix à douze 21 g d'aiguilles pour l'injection de microbulles.

4. Intervention chirurgicale

NOTE: Demander à un assistant de préparer les bulles (étape 5) tandis que le chirurgien commence l'intervention chirurgicale. Le protocole décrit ici a été adapté de Whiteley et al ^15.

1. Recueillir E16,5 ou E17.5 embryons de la souris femelle enceinte suivants dislocation cervicale.
   REMARQUE: Les effets de l'anesthésie sur les embryons ne ont pas encore été étudiées en détail ^16. D'autres méthodes, y compris la décapitation, peuvent être op appropriéetions pour le sacrifice des souris enceintes.
   1. Couper ouvrir l'abdomen de révéler l'utérus et les embryons. Soigneusement et rapidement enlever l'utérus en coupant à l'extrémité des cornes utérines (sectionnement des vaisseaux ovariens et utérins) et la séparation au vagin et la vessie.
   2. En utilisant une pince à échardes, transférer l'utérus à un tube de 40 ml de milieu d'embryon glacée aussi rapidement que possible sans endommager les embryons. Jeter la carcasse de la souris.
2. Déménagerais dans un microscope et la scène. Déposer l'utérus dans une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 mm. Transférer l'utérus dans un nouveau plat rempli de 50 ml de milieu d'embryons frais.
3. Utilisation stérilisé (pulvérisation d'éthanol à 70%) des pinces fines, déchirer délicatement et retirez les membranes externes de l'utérus commençant à une extrémité. Exposer la caduque placentaire, pariétal sac vitellin et la membrane de Reichert pour séparer et éliminer de la vésicule ombilicale viscérale sous-jacent.
4. On dissèque les embryons une par une, en maintenant la y viscéralesacs OLK intactes et de manutention le placenta aussi doucement que possible ^17. Prenez soin d'éviter la rupture de la vésicule ombilicale que les embryons pop immédiatement.
   1. Utilisez la cuillère perforée pour déplacer les embryons à un autre plat conservé dans la glace avec les médias d'embryons frais. Garder les embryons réfrigérés jusqu'à ce que nécessaire. Changer les médias dans le plat de chaque embryon 1-1,5 h. Avec ces conditions embryons sont viables jusqu'à 4 h après la dissection.

5. microbulles Préparation

REMARQUE: Effectuez imagerie moléculaire avec des ultrasons en utilisant les deux microbulles ciblées et non ciblées. Une expérience unique peut nécessiter jusqu'à trois flacons séparés de microbulles: microbulles i) anticorps ciblée microbulles, ii) anticorps isotype contrôle ciblées et iii) microbulles non ciblées. L'agent de contraste se présente comme une poudre sèche et le gel doit être reconstitué avec une solution saline avant l'injection. Il ya ~ 2 x 10 ⁹ microbulles dans chaque microb non cibléeflacon ubble et ~ 8,8 x 10 ⁸ microbulles dans les flacons prêts cibles. Les microbulles sont stables pendant jusqu'à 3 heures après la reconstitution.

1. Reconstitution des cibles Prêt flacons
   NOTE: Des exemples de préparations prêtes cibles: microbulles de endogline ciblées (MB _E, avec rat biotinylé MJ 7/18 anticorps à endogline de la souris; en installations d'hybridation de la maison); vasculaire récepteur du facteur de croissance endothelial 2 (VEGFR2) microbulles ciblées (Mo _V, à la biotine anti-souris CD309); isotype de rat anticorps IgG de contrôle ₂ microbulles ciblées (MB _C, biotine isotype de rat IgG _deux cibles de maîtrise IgG2a de souris).
   1. Diluer la solution d'anticorps (20 pg) dans 1 ml (volume final) d'une solution saline. Garder sur la glace.
   2. Remplir la seringue avec 1 ml de solution saline, en supprimant toutes les bulles d'air. Fixation de l'aiguille 21 G, injectez lentement la solution dans le flacon de microbulles.
   3. Retirer lentement le piston, retirer 1 ml d'air, et de retirer l'aiguille. Doucementagiter. Laisser reposer 5 min sur la glace.
      REMARQUE: microbulles ultrasons peuvent être détruits dans des environnements à haute pression.
   4. Après le temps écoulé, remplissez une nouvelle seringue avec la dilution d'anticorps et d'ajouter au flacon approprié. Agiter doucement. Laissez le mélange (maintenant 2 ml) reposer pendant 10 min. Garder sur la glace. En supposant que la conjugaison complète de la surface, le nombre moyen de ligand lié pour les microbulles est d'environ ¹⁸ ligands 7600 / um ^2.
2. Reconstitution des flacons non ciblées
   1. Remplir la seringue avec 1 ml de solution saline, en supprimant toutes les bulles d'air. Fixation de l'aiguille 21 G, injectez lentement la solution dans le flacon de microbulles.
   2. Retirer lentement le piston, retirer 1 ml d'air, et de retirer l'aiguille. Agiter doucement. Laisser reposer 5 min. Ajouter un supplément de 1 ml de solution saline, comme décrit ci-dessus. Agiter doucement et laisser reposer 10 min sur la glace.
3. Coulter comptage
   1. Agiter doucement le flacon de microbulles souhaitée et d'en tirer ~50 ul de la solution dans une seringue de 1 ml à l'aide de l'aiguille 21 G. Injecter les microbulles dans un 2 ml microtube vide.
   2. Introduire à la pipette un échantillon de 10 ul de la solution de microbulles de stock en 10 ml de diluant.
   3. Après mélange doux, d'évaluer la concentration et la taille des distributions de la population de microbulles en utilisant soc comptage (voir la liste des matériaux). Compter un minimum de trois mesures de 50 ul (par flacon d'échantillon) à l'aide d'une ouverture 30 um.
4. Microbulles Préparation pour injection
   REMARQUE: L'assistant effectue cette étape lorsque 'injection de microbulles dans des embryons' (étape 6) est introduite. Chaque embryon est injecté une fois, avec le type de microbulles choisi pour chaque injection afin d'être sélectionné au hasard par l'assistant de telle sorte que tous les types de microbulles sont uniformément répartis dans la procédure, mais donnés dans un ordre aléatoire. Se assurer que le chirurgien est aveugle au type de bulle étant injecté.
   1. Déterminer ee volume de la solution stock bulle nécessaire pour produire une concentration finale de 1 x 10 ⁸ Mo / ml dans un volume de 400 pi (calculer le volume en utilisant les concentrations mesurées dans des actions 5.3.3). Aliquoter le volume correspondant de solution saline dans un tube à centrifuger vide.
   2. Agiter doucement le flacon microbulles sélectionnée et attirera un volume excédentaire (~ 50 pi supérieure à celle calculée ci-dessus) de la solution dans une seringue de 1 ml en utilisant l'aiguille 21 G. Injecter les microbulles dans un tube à centrifuger vide.
   3. Pipeter le volume nécessaire de solution stock microbulles et ajouter à l'aliquote de solution saline. Mélanger en remuant délicatement avec la pointe de la pipette.
   4. Aspirer la solution de microbulles dilué dans une seringue propre en utilisant l'aiguille 21 G. Retrait de l'aiguille, éliminer les bulles d'air de la seringue et fixer le luer et de tubes. Poussez lentement la solution à la fin de la fabrication de tubes sûr de ne pas générer les bulles d'air.
   5. Insérez le Syringe dans une pompe à perfusion à seringue fixé pour distribuer les microbulles à un débit de 20 ul / min pour un volume total de 20 ul. Attacher une aiguille de verre tiré à l'extrémité de la tubulure. Déplacer la pompe près de l'étape d'injection.

6. injection de microbulles dans des embryons

1. Choisissez au hasard et retirer (avec une cuillère perforée) un embryon de l'antenne des médias réfrigérés. Placez dans un plat de dissection situé sur la scène de l'échographie dans le stéréoscope et enlever la vésicule ombilicale et des membranes amniotiques avec les fines pinces, coupe / déchirure du côté qui apparaît moins vascularisée (le côté antimesometrial). Ceci est plus facilement obtenu en perçant une zone adjacente à la zone de tête.
   1. Couper suffisant pour enlever l'embryon de l'intérieur, mais pas plus. Stabiliser les plats de dissection à l'aide de petits morceaux de pâte à modeler.
2. Manœuvrer délicatement le sac de partout dans l'embryon. Positionner l'embryon de son côté, avec le placenta etvaisseaux ombilicaux devant. En utilisant les broches insectes, cerner la vésicule ombilicale (4 broches recommandé) et les bords du placenta nécessaire d'apposer en place. Évitez les gros vaisseaux.
3. Laver l'embryon pré-chauffé à 45 ° C jusqu'à ce que l'embryon PBS ravive. Identifier la veine ombilicale et son réseau vasculaire associée. Placez le plat de sorte que l'injection peut être effectuée confortablement.
   NOTE: Une fois réchauffé, du sang dans l'embryon commencera à couler, le pompage visiblement dans l'artère ombilicale. Lorsque le flux commence d'abord, les veines sera un rouge vif, avec le sang dans les vaisseaux apparaissant rapidement identiques. Les branches provenant de la veine ombilicale recouvrent généralement ceux de l'artère ombilicale à la surface placentaire.
4. Une fois que l'embryon a relancé, couvrir (mais pas le placenta) avec du gel US préchauffé, en étant sûr de retirer délicatement les bulles d'air (en utilisant les pince fine) de partout dans l'embryon. Compléter le plat préalablement chauffé PBS.
   NOTE: Gardez un œil sur le niveau de solutidans les seringues PBS et de gel et ajouter seringues de sauvegarde dans le bécher de chauffage au besoin.
5. Montez l'aiguille de verre sur une grosse boule de pâte à modeler sur le bord du plat de dissection et insérer l'extrémité de l'aiguille dans le PBS. Choisir une veine sur la surface du disque chorionique placentaire, aussi loin de la branche principale raisonnable, couper la pointe à la taille avec des ciseaux. Injection est plus facile si la pointe est coupée à un léger angle. Supprimer tous les bords dentelés du verre en utilisant le bord des ciseaux à ressort.
6. Utilisation de la pompe seringue, injecter lentement la solution de microbulles à 20 pl / min dans l'aiguille de verre jusqu'à ce que tout l'air est expulsé de la pointe de l'aiguille et de microbulles peut être vu de circuler librement dans le PBS. Arrêtez la pompe et pour réinitialiser un volume d'injection de 20 pi. Ne pas permettre à l'air d'entrer dans le système vasculaire de l'embryon au cours de l'injection.
7. Insérez la pointe de l'aiguille de verre doucement dans l'une des veines dans le placenta et se assurer qu'il est immobile. Balancer loin le stèretête de oscope et la position du transducteur ci-dessus l'embryon. Initier imagerie.

7. Ultrason Molecular Imaging

NOTE: En utilisant les conditions d'imagerie non linéaires de contraste précédemment définies, positionner le transducteur de façon que l'embryon se trouve également entre les foyers à 6 et 10 mm. Une fois positionné, commencer l'injection en bolus de microbulles. Lorsque l'injection est terminée, démarrer la minuterie.

1. Imagerie de perfusion
   1. Assurez-vous que le nombre maximum d'images pour le mode de contraste non linéaire est sélectionnée en appuyant sur ​​le bouton 'de gestion d'étude »et en cliquant sur ​​l'onglet" Préférences "en haut du navigateur de l'étude. Cochez la case appropriée dans la fenêtre «Préférences».
   2. Réglez les paramètres d'imagerie en lançant imagerie non linéaire. Appuyez sur le bouton 'mode de contraste »sur le panneau de commande. Affiner le gain 2D en ajustant le «gain & #8217; composer à 30 dB, réduire la puissance à 4% en utilisant le «pouvoir» cadran, diminuer la fréquence de 1 Hz en utilisant la «fréquence» cadran et réglez la largeur du faisceau (au coin en bas à gauche) à l'échelle à l'aide du rouleau à billes / souris.
      NOTE: Toutes les commandes sont situées sur le panneau du système à ultrasons de contrôle.
   3. Capturer l'ensemble de lavage et à la dissipation de la microbulle bolus par l'enregistrement d'une boucle ciné 20 min à un débit de 1 Hz de trame. Appuyez sur SCAN / gel pour démarrer l'acquisition de données.
   4. Une fois la séquence complète des images a été capturé, appuyez sur le bouton «magasin ciné» situé sur le panneau de commande pour enregistrer la séquence d'images dans la mémoire tampon du système. Le système crée un ciné boucle horodaté des données du modèle de contraste non linéaires acquises.
2. Ciblée microbulles Imaging
   1. Sous «Préférences», régler le temps de rafale à 0,1 sec. Définissez les paramètres d'imagerie appropriés en utilisant les contrôles described ci-dessus (7.1.2.).
   2. Initier imagerie de contraste non linéaire en appuyant sur ​​le bouton «mode de contraste» sur le panneau de commande. Se assurer que l'embryon est correctement situé sous le transducteur, et que le débit de l'agent de contraste à microbulles par l'embryon est visible dans l'image en mode non linéaire de contraste.
   3. Pour évaluer la liaison au cours d'études d'imagerie moléculaire embryonnaires microbulles ciblées, de permettre aux microbulles de circuler au repos pendant 3 min et 40 s après l'achèvement de l'injection. Cette fois est de permettre la rétention des microbulles circulent. De scan / le gel 'Appuyez sur pour arrêter l'imagerie pendant ce temps.
   4. À 3 min et 40 sec, l'imagerie de CV pour confirmer que l'embryon est encore visible, est suffisamment couvert avec du PBS, et que les bulles continuent à circuler. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'imagerie.
   5. Acquérir la séquence perturbations / reconstitution après l'injection 3 min et 50 sec en enregistrant un «pré-destructionséquence de réponse acoustique tion 'à 29 Hz. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'acquisition de données. Après l'injection de 4 min ^18,19, lancer un 0,1 sec à haute fréquence acoustique rafale. Appuyez sur le bouton «éclater» à mettre en œuvre une rafale.
   6. Continuer à enregistrer des cadres pour le reste de la séquence (jusqu'à ce que la ligne de mémoire tampon est pleine) et sauver la boucle ciné en appuyant sur «magasin ciné».
   7. Recueillir une boucle ciné supplémentaire de microbulles circulation. Cette séquence d'imagerie ultérieure «post-destruction» est supposé contenir ne circulant signaux de bulles qui ont reconstitué les faisceau. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'imagerie et «magasin ciné» afin de recueillir les images.
   8. Étiqueter les boucles de ciné après imagerie chaque embryon. De la gestion de l'étude 'Appuyez sur, sélectionnez le fichier en utilisant la bille et le bouton, appuyez sur «label d'image" et le nom "select" appropriée.

8. Manipulation des embryons après l'injection

1. Imagerie Post, déplacer le transducteur, dégoupiller l'embryon et l'euthanasie (via la décapitation, la dislocation cervicale, dioxyde de carbone asphyxie, ou une anesthésie suivie par le gel ou la fixation rapide) comme vous le souhaitez.
2. Pour chaque injection ultérieure de l'embryon un segment plat frais de dissection, aiguille, la seringue et le tube doit être utilisé, avec la préparation de la prochaine fournée de l'injection de microbulles prise de solution lieu lors de la dissection et de renouveau.
3. Enregistrer des échantillons de tissus (par exemple, la queue, le cerveau) pour des analyses supplémentaires (par exemple, le génotypage déterminée par analyse PCR de l'ADN isolé de queue, lacz coloration, ou des mesures semi-quantitatives d'expression de biomarqueurs en utilisant des empreintes occidentaux ^21).

Résultats

L'injection d'agents de contraste ultrasonore dans ex utero des embryons de souris dépend de l'isolement réussi de vie, les embryons au stade gestationnel tardif de l'utérus et le maintien de la viabilité au cours de l'injection et l'imagerie par ultrasons associée. Une fois que l'embryon a été extériorisé et positionné, comme le montre la figure 1, l'injection soigneuse de l'agent de contraste dans le système vasculaire embryonnaire est possible. ...

Discussion

Ultrasons agents de contraste ont été injectés dans des embryons de souris gestation stade avancé et des images de contraste non linéaires ont été acquis pour mesurer les paramètres de perfusion et de microbulles ciblées contraignant. Imagerie réussie des microbulles à l'intérieur du système vasculaire embryonnaire était dépendant d'un certain nombre de facteurs, le premier étant embryon viabilité. Tous les équipements et appareils ont été préparées à l'avance afin de minimiser le temp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08