Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Özet

Burada, biz yaşam içine ultrason mikrokabarcık kontrast maddeler, izole geç gebelik sahne kemirgen embriyolar enjekte etmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem perfüzyon parametrelerinin ve kontrastlı yüksek frekanslı ultrason görüntüleme kullanılarak embriyo içinde vasküler moleküler belirteçlerin çalışma sağlar.

Özet

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Giriş

Kontrastlı ultrason görüntüleme görselleştirmek ve damar ortamı karakterize etmek kabarcık kontrast maddelerin kullanımını kolaylaştırır. Bu ajanlar mikrosirkülasyon, damarlanma ve kardiyovasküler fonksiyonu noninvaziv değerlendirmesini sağlar. Buna ek olarak, baloncuk yüzeyinin modifikasyonu mümkün vasküler olay moleküler ultrason görüntüleme yapmak anjiyojenez, ateroskleroz ve inflamasyon ^1,2 klinik öncesi uygulamalarda gösterildiği gibi, endotelyal biyolojik bağlanma hedeflenen mikro-sonuçlanabilir. Kontrastlı ultrason nedenle de sağlıklı ve hastalıklı damar durumları ^3-5 etkileyen karmaşık ve çeşitli ortamlar belirlemek için kullanılabilir.

Yıl geçmiş sayıda, kabarcık görüntüleme programı ilgi yönlü fare embriyo modeli genişletmiştir. Memeli bir gelişme modeli olarak, embriyonik damar içine kabarcıkların giriş fizyolojik artırırGelişmekte olan dolaşım sistemi (örneğin, kan akımı, kardiyak output) ve transgenik durumlarda ve kalp hastalığı ^6,7 hedeflenen mutant fare modellerinde, çalışma kardiyovasküler fonksiyonu nasıl değiştirdiğini genetik faktörler anlayışlar verebilir. Aslında, nicel ve nitel 2D embriyonik beyin damar analizleri zaten ⁸ elde edilmiştir. Bundan başka, fare embriyosu canlı dokuda vasküler belirteçlerle hedeflenen mikro-kabarcıklar bağlanmasının incelenmesi için mükemmel bir model olarak sunulur. Bartelle ve diğ. ^9, örneğin, Biotag-BirA transgenik embriyo bağlanma ve damar anatomisinin incelemek hedeflenen değerlendirir embriyo kalp ventriküllere, avidin mikro-kabarcıkları getirmiştir. kliniğe Bu teknik çeviri önemli bir kriter - heterozigot ve homozigot fare modelleri üretimi de moleküler ultrason kantitatif tabiatının belirlemek amacıyla yapılan tümör modeli araştırmaları için bir vekil olarak kullanılabilir edilebilir.

mikro-en sık laparotomi ^8-10 aracılığıyla maruz tek embriyo içi kardiyak enjeksiyonlar aracılığıyla embriyonik dolaşıma tanıtıldı. utero enjeksiyonları Ancak, bir takım zorluklarla karşı karşıya. Bu enjeksiyon rehberlik, anne ve batın embriyo hareketi karşı ihtiyacını, anne hemodinamik canlılığının bakım ve ¹¹ kanama nedeniyle anestezi ve komplikasyon uzun vadeli etkileri ele batın embriyolar içerir. Bu nedenle, soruşturmanın amacı izole yaşayan geç evre embriyoların ¹² içine mikrokabarcıkları enjekte için bir teknik geliştirmek oldu. Bu seçenek, enjeksiyon kontrol ve konumlandırma, tıkanma olmadan görüntüleme uçağın tekrarlanabilirlik ve basitleştirilmiş görüntü analizi ve ölçümü açısından daha fazla özgürlük sunuyor.

Bu çalışmada, biz fo yaşayan kemirgen embriyolara kabarcıkların enjeksiyon için yeni bir prosedür anahatr kabarcık kinetik davranışları okuyan ve amaçları endojen endotel yüzey belirteçleri bağlayıcı Kabarcığa hedeflenen Derslerinizi. Lineer olmayan bir kontrast özel ultrason görüntüleme tepe geliştirilmesinde uygulanmıştır (PE), yıkama-oranı ve süresi izole E17.5 embriyolar (TTP) tepe dahil olmak üzere temel perfüzyon bir dizi parametre ölçülmesi için kullanılır. Bu, aynı zamanda, aktif bir anjiyojenez ¹³ bölgelerinde damar endotel hücrelerinde yüksek ifade için endoglin klinik olarak anlamlı bir hedef işlev transjenik fare modeli, bir embriyonik endoglin kaybına moleküler ultrason kantitatif tabiatının değerlendirmek için embriyo modelinin geçerliliğini göstermek . endoglin hedefli (MB _E) fare izotip _IgG2 kontrol (MB _C) ve hedefsiz (MB _U) mikro-kabarcıkların yapışma heterozigot endoglin (İngilizce ^+/-) ve homozigoz endoglin (İngilizce ^{+ / +)} sentezleyen embriyolar değerlendirilir. Hedeflenen bindinin analizing moleküler ultrason endoglin genotipleri arasında ayırt ve ölçülebilir moleküler ultrason seviyelerine reseptör yoğunlukları ilgili yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Protokol

NOT: Bu çalışmada gerçekleştirilen deneysel prosedürler Hayvan Bakım Sunnybrook Araştırma Enstitüsü Komitesi (Toronto, Ontario, Kanada) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların insancıl için prosedürler her zaman dikkat edilmelidir. Bu araştırmacı bir ultrason görüntüleme sisteminin temel operasyonda eğitimli olduğu varsayılır. Bu protokol, iki kişi ile iyi çalışır.

1. Hayvan Modelleri

1. Mate CD-1 erkek ve dişi Mus musculus perfüzyon çalışmaları için vahşi tip embriyolar elde etmek.
2. Bourdeau ve ark. ¹⁴ tarafından tarif edildiği gibi moleküler görüntüleme çalışmaları için, 129 / Ola kökenli embriyonik kök hücreleri kullanılarak, homolog birleştirme yoluyla, Eng +/- fareleri üretmek.
   1. Geri çaprazlama B6- Eng ^+/- fareler, nazik, CD-1 arka Dr. Michelle Letarte elde. Kullanım Eng ^+/- CD-1 çaprazlanmış embriyoları, aynı zamanda bunların İng ^{+ / +} yavru kontrols. Sahnelenen embriyolar üretmek için fareler Mate.

2. Deneysel hazırlanması

1. Farelerin çiftleşme başlatın ve günlük fişlerini kontrol edin. Embriyonik gün 0.5 vajinal fiş görülmektedir günün öğleden olarak tanımlanır.
2. 500 fetal sığır serumu, 50 ml, 5, 1 M HEPES ml Penisilin-Streptomisin ve 5 ml (10.000 birim penisilin, 10,000 ug streptomisin) eklenerek embriyo ortamı hazırlamak mi Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı, yüksek glikoz (DMEM) (4,500 mg / L). Folyo şişe sarın ve 4 ° C'de soğutulmuş tutmak.
3. 20 dakika için 140 xg'de 50 ml konik tüpler santrifüj net ultrason jeli. 30 ml'lik şırınga içine jel çizin. Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve bir kenara ek (işaretli) 30 mi şırınga doldurun. Embriyoların biri çöp genellikle ultrason jeli 2-3 şırınga ve PBS 4 şırınga arasında gerektirecektir.
4. Yaklaşık 30 cam iğneler çekin ve hamuru bir şerit bağlamak hafifçe100 x 20 mm hücre kültür kaplarına. Bu iğneler ayrıldı ve kullanım sırasında güvenli olmasını sağlar. Isıtıcı 77, Alt mıknatıs 55, Ana mıknatıs 70: cam çektirmenin kullanarak, filamanın 1 x 90 mm cam kılcal aşağıdaki ayarları kullanın.
5. Baz için sertleştirici 8 hacim oranı: 1 kullanılarak, (kendi çanak alacak bir çöp içinde her embriyo sağlamak için yeterli) 10-12 diseksiyon tabak hazırlayın. 50 ml'lik bir konik tüp içine baz 40 ml dökün. 5-6 ml kür ajanı ekleyin ve tahta sopa ile karıştırın.
   1. Yaklaşık yarısına her bir doldurma, 60 x 15 mm kültür çanakları içine dökün. Stand O / N ayarlamak için izin ver.
6. (: 0.79 mm iç çap) polivinil klorür (PVC) boru 400 mm uzunluğunda parçalara kadın dişlerde takın. boru rahatça ultrason aşamasına şırınga pompası ulaşmak gerekir.

3. Deney Seti-up

1. 3B motor ve doğrusal dizi 21 MH cerrahi mikroskop altında görüntü platformu düzenlemekz dönüştürücü.
   1. Orient platformu ray monte böylece mikroskop altında doğrudan konumlandırılmış Evre, sol açık.
   2. Platformun uzanan kolunun topu eklem 3D motoru takın. Ileriye dönük, motorun monte hızlı sürümde dönüştürücü kelepçe hızlı bırakma sonrası Vida ve mandalı tespit, kelepçe dönüştürücü kafa yerleştirin.
   3. Arabanın ön panelindeki etkin limanda dönüştürücü konektörü sabitleyin. Makineyi açın.
2. Moleküler görüntüleme çalışmaları için 'kardiyoloji' ayarı seçerek, 21 MHz ultrason dönüştürücüyü başlatın ve perfüzyon çalışmaları için 'genel'. Tam orta pozisyona her zaman kazanç-tazminat sürgü Shift. Sıklığı: 'Kontrast Modu' için, aşağıdaki parametreler ayarlanmalıdır 18 MHz, güç iletimi: 30 dB, Foci:% 4, (0.39 Mpa), Kazanç Kontrast Doğrusal Olmayan, Burst zamanı: 6 & 10 mm, Mod Kontrast 100% 0,1sn, Işın genişliği: Geniş.
3. Kısım 40 mi embriyo ortam dört adet 50 ml konik tüp içine, her. Buz üzerine yerleştirin.
4. Sıcak bir plaka üzerinde, bir 2 L'lik bir kap içinde su 1 L ısıtın. 45 ° C'de muhafaza edin. Ön ısıtmak için bir deney şişesine ultrason jel ve PBS, bir şırınga ekleyin. Her zaman bir termometre ile takip ederek bu sıcaklığı korur.
5. Oniki 1 ml şırınga ve kabarcıkların enjeksiyonu için on 21 oniki G iğne kenara on ayarlayın.

4. Cerrahi Prosedür

NOT: Cerrah cerrahi prosedür başlar iken bir asistan kabarcıklar (evre 5) hazırlamak var. Burada açıklanan protokol Whiteley ve ark adapte edilmiştir. ¹⁵

1. Servikal dislokasyon aşağıdaki hamile bir dişi fareden E16.5 veya E17.5 embriyolar toplayın.
   NOT: embriyoların anestezi etkileri henüz detaylı ¹⁶ incelenmemiştir. Dekapitasyon içeren ek yöntemler, uygun op olabilirHamile farelerin kurban ları.
   1. Rahim ve embriyoların ortaya çıkarmak için karın açmak kesin. Dikkatle ve hızlı bir şekilde (yumurtalık ve rahim damarlarının koparılması) uterus boynuzları ucunda kesme ve vajina ve mesane de kesilmesinin rahim kaldırmak.
   2. Kıymık forseps kullanarak, embriyo zarar vermeden mümkün olduğunca çabuk buz soğuk embriyo medya 40 ml tüp rahim aktarın. Fare karkas atın.
2. Mikroskop ve sahneye taşınmaya. 100 x 20 mm hücre kültürü çanak içine rahim yatırın. 50 mi taze embriyo ortamı ile doldurulmuş yeni bir çanak içine rahim aktarın.
3. Yavaşça gözyaşı ve bir ucunda başlayan rahim dış membranlar uzak çekin, sterilize (% 70 etanol sprey) ince forseps kullanarak. Plasental desidua, parietal sarısı kesesi ve ayırmak ve altta yatan visseral yolk kesesi kaldırmak için Reichert membran Açığa.
4. Visseral y tutarak, tek tek embriyolar parçalara ayırolk keseler sağlam ve yavaşça mümkün olduğu plasenta ¹⁷ taşıma. Embriyolar hemen dışarı pop gibi yumurta sarısının rüptürü önlemek için dikkat edin.
   1. Taze embriyo medya ile buz üzerinde muhafaza başka yemeğe embriyolar taşımak için delikli kaşık kullanın. Ihtiyaç kadar soğutulmuş embriyolar tutun. Embriyo çanak her 1-1.5 saat ortamı değiştirin. Bu koşullar ile embriyolar diseksiyon sonra 4 saat boyunca yaşayabilir.

5. kabarcık Hazırlık

NOT: Her iki hedefli ve hedefsiz mikrokabarcıkları kullanarak ultrason ile moleküler görüntüleme gerçekleştirin. I) antikor hedeflenen mikro-kabarcıklar, ii) Kontrol izotip antikor hedeflenen microbubbles ve iii) hedefsiz microbubbles: Tek deney gibi birçok 3 olarak mikro kabarcık ayrı şişeleri gerektirebilir. Kontrast madde, bir kuru-dondurma bir toz halinde gelen ve enjeksiyondan önce serum fizyolojik ile yeniden gerekir. Her hedefsiz microb içinde ~ 2 x 10 ⁹ mikro kabarcıklar vardırubble şişe ve • hedef hazır şişelerde 8.8 x 10 ⁸ mikrokabarcıklar. mikro-kabarcıklar yeniden sonra 3 saat boyunca stabildir.

1. Hedef Hazır Şişelerinin Sulandırma
   NOT: Hedef hazır preparatların örnekleri: endoglin hedeflenen mikro kabarcıklar (fare endoglin için biyotinile sıçan MJ 7/18 antikoru ile MB _E; ev hibridoma tesis); vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 (VEGFR2) hedeflenen mikro-kabarcıklar (MB _V, biyotin, anti-fare CD309 ile birlikte); Sıçan izotip IgG ₂ kontrol antikoru hedeflenen mikro kabarcıklar (MB _C, biyotin sıçan isotip IgG ₂ kontrol fare IgG2a hedefleme).
   1. Tuz 1 ml antikor çözeltisi (20 ug) (nihai hacim) seyreltin. Buz üzerinde tutun.
   2. Tüm hava kabarcıkları kaldırarak, 1 ml serum fizyolojik ile şırınga doldurun. 21 G iğne takma, kabarcık şişenin içine yavaş yavaş çözüm enjekte.
   3. Yavaşça hava 1 ml kaldırarak, piston çekilme ve iğneyi çıkartın. Nazikçeçalkalayın. Buz üzerinde 5 dakika bekletin.
      NOT: Ultrason mikro kabarcıklar yüksek basınçlı ortamlarda altında tahrip olabilir.
   4. Zamanın geçmesinden sonra, antikor seyreltme ile yeni bir şırınga doldurun ve uygun bir şişeye ekleyin. Yavaşça çalkalayın. Karışım (şimdi 2 mi), 10 dakika boyunca bekletilir. Buz üzerinde tutun. Tam yüzey konjugasyon varsayarsak, mikro kabarcık için bağlı ligand ortalama sayısı yaklaşık ¹⁸ 7,600 ligandlar / um ^2.
2. Hedefsiz Şişelerinin Sulandırma
   1. Tüm hava kabarcıkları kaldırarak, 1 ml serum fizyolojik ile şırınga doldurun. 21 G iğne takma, kabarcık şişenin içine yavaş yavaş çözüm enjekte.
   2. Yavaşça hava 1 ml kaldırarak, piston çekilme ve iğneyi çıkartın. Yavaşça çalkalayın. 5 dakika bekletin. Yukarıda tarif edildiği gibi, ilave bir 1 mL tuzlu su ekleyin. Yavaşça ajitasyon ve buz üzerinde 10 dakika bekletin.
3. Coulter Sayma
   1. Yavaşça ~ istenen kabarcık flakon ajitasyon ve beraberlik21 G iğne kullanılarak bir 1 ml şırınga içinde çözelti 50 ul. Boş 2 ml mikrosantrifüj tüp içine mikrokabarcıkları enjekte edilir.
   2. Seyreltici 10 ml mikro-kabarcık stok çözeltisi, 10 ul örnek Pipet.
   3. Hafifçe karıştırdıktan sonra, ekim sayım (Malzeme listesi bakınız) kullanarak kabarcık nüfus yoğunluğu ve boyutu dağılımları değerlendirmek. 30 mikron diyafram kullanarak (flakon örnek başına) üç 50 ul ölçümleri en az Kont.
4. Enjeksiyon için hazırlanıyor mikro-
   NOT: '' Embriyolar içine Mikrokabarcıkların Enjeksiyon 'zaman asistanı bu adımı gerçekleştirir (adım 6) başlatılır. Her embriyo her enjeksiyon için seçilen mikro-tipi rastgele mikro-her türlü eşit işlem boyunca dağıtılan ancak rastgele bir sırayla verilmiştir şekilde asistan tarafından seçilecek olan, bir kez enjekte edilir. Kabarcık türü enjekte ediliyor cerrah kör olduğundan emin olun.
   1. Th belirleyin400 ul bir hacim içinde, 1 x 10 ⁸ MB ​​/ ml'lik bir son konsantrasyon üretmek (5.3.3 ölçülen stok konsantrasyonları kullanılarak hacmi hesaplamak) için gerekli olan hazır kabarcık çözeltisi E hacmi. Boş mikrosantrifüj tüpü içine tuz karşılık gelen hacmi alikosu.
   2. Yavaşça seçilen kabarcık flakon ajitasyon ve 21 G iğne kullanılarak 1 ml şırınganın içine çözeltinin (yukarıda hesaplanan daha 50 ul büyük ~) aşırı hacmi çizin. Boş bir mikrosantrifüj tüpe mikrokabarcıkları enjekte edilir.
   3. Kabarcık stok solüsyonu gerekli hacmi Pipet ve tuzlu kana ekleyin. Pipet ucu ile hafifçe karıştırılmıştır karıştırın.
   4. 21 G iğne kullanarak temiz bir şırınga içine seyreltilmiş kabarcık çözüm çizin. İğneyi Çıkarma, şırınga hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak ve dişin ve tüp takın. Yavaş yavaş hava kabarcıklarını oluşturmak için emin boru yapma sonuna kadar çözüm itin.
   5. Enjektörler i takın20 ul bir toplam hacim için 20 ul / dakikalık bir oranda mikro-kabarcıkları dağıtmak için bir şırınga infüzyon pompası, GE. Hortumun ucuna bir çekti cam iğne takın. Enjeksiyon aşamasına yakın pompa taşıyın.

Embriyolar içine Mikrokabarcıkların 6. Enjeksiyon

1. Rasgele seçmek ve soğutulmuş medya çanak (delikli kaşık ile) bir embriyo çıkarın. Stereoskop altında ultrason sahnede bulunan diseksiyon çanak yerleştirin ve en az vaskülarize görünen tarafı (antimesometrial tarafı) yırtılma / kesme, ince forseps ile yumurta sarısı kesesi ve amniyotik membranlar çıkarın. Bu en kolay baş bölgesine bitişik bir alana delinmesi ile elde edilir.
   1. Içinde embriyo kaldırmak için yeterli, ama artık kesin. Hamuru küçük parçalar kullanılarak diseksiyon yemekleri stabilize.
2. Yavaşça embriyo yerinden kese manevra. Plasenta ile, yan embriyo yerleştirin veönünde göbek gemiler. Yumurta sarısı kesesi aşağı pin, böcek işaretçilerine Kullanma (4 pim önerilir) ve gerekli plasenta kenarları yerine sabitlemek için. Büyük damarları kaçının.
3. Embriyo canlandırıyor kadar önceden ısıtılmış 45 ° C PBS ile embriyo yıkayın. Göbek ven ve ilişkili vasküler ağı belirleyin. Enjeksiyon rahatça yapılabilir, böylece çanak yerleştirin.
   NOT: ısındı sonra, embriyo kan gözle umbilikal arterde pompalama, akmaya başlayacak. Akış ilk başladığında, damarlar hem gemiler hızla aynı görünen kanla, parlak kırmızı olacaktır. Göbek ven kaynaklanan dalları genellikle plasenta yüzey üzerinde göbek arter gelenler kaplaması.
4. Embriyo canlandırdı sonra, ince embriyo etrafında (ince forseps kullanarak) herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olmak, önceden ısıtılmış ABD jeli ile (ancak plasenta) kapsamaktadır. Önceden ısıtılmış PBS ile çanak doldurun.
   NOT: soluti düzeyinde bir göz atıngerektiği gibi ve PBS ve jel şırıngalar ısıtma beher yedekleme şırınga ekleyin.
5. Diseksiyon çanak kenarında hamuru büyük bir topa cam iğne takın ve PBS içine iğne ucunu. Kadar ana dal, makul plasental diskin koryonik yüzeyinde damar seçimi, makas kullanılarak boyutuna ucu kırpın. Ucu hafif bir açıyla kesilmiş ise Enjeksiyon kolay olduğunu. Yaylı makas kenarını kullanarak cam herhangi tırtıklı kenarları çıkarın.
6. Tüm hava iğne ucundan dışarı atılır ve mikro-kabarcıklar PBS içine serbestçe akmasına görülebilir kadar şırınga pompası kullanılarak, yavaş yavaş cam iğne içine 20 ul / dk'da mikro-kabarcık solüsyonu enjekte edilir. Pompayı durdurun ve 20 ul bir enjeksiyon hacmi için sıfırlayın. Hava enjeksiyonu sırasında embriyonun damar sistemine girmesine izin vermeyin.
7. Plasenta yavaşça damarların birine cam iğne ucu yerleştirin ve hareketsiz olduğundan emin olun. Stere savurOscope baş ve pozisyon embriyo üzerinde dönüştürücü. Görüntüleme başlatın.

7. Ultrason Moleküler Görüntüleme

NOT: Daha önce ayarlanmış kontrast doğrusal olmayan görüntüleme koşulları kullanarak, embriyo 6 ve 10 mm odaklar arasında eşit bulunmaktadır böylece dönüştürücüyü yerleştirin. Bir kez yerleştirilmiş, kabarcıkların bolus enjeksiyonu başlar. Enjeksiyon tamamlandığında, zaman ölçeri başlat.

1. Perfüzyon Görüntüleme
   1. Doğrusal olmayan kontrast modu için kare sayısı 'çalışma yönetimi' düğmesine basarak ve çalışma Tarayıcınızın üst kısmındaki 'Prefs' sekmesini tıklayarak seçili olduğundan emin olun. 'Tercihler' penceresinde uygun kutuyu işaretleyin.
   2. Doğrusal olmayan görüntüleme başlatarak görüntüleme ayarlarını yapın. Kontrol panelinde 'kontrast modunu' düğmesine basın. 'Kazanç & # ayarlayarak 2B kazanç daraltın8217; 30 dB dial 'güç' dial kullanarak% 4 güç azaltmak, 'frekans' çevirmek ve geniş rulo top / fare kullanarak ışın genişliği (sol alt köşe) set kullanarak 1 Hz frekans azaltmak.
      NOT: Tüm kontroller ultrason sisteminin kontrol panelinde yer almaktadır.
   3. 1 Hz kare hızında bir 20 dakika sine döngü kaydederek kabarcık bolus tüm yıkama-in ve dağılımı yakalayın. Basın tarama / donma veri toplama başlatmak için.
   4. Görüntülerin tam sırası yakalanan edildikten sonra, sistem tampon görüntülerin sırasını kaydetmek için kontrol panelinde bulunan 'sine mağazası' düğmesine basın. Sistem edinilen doğrusal olmayan kontrast modeli veri tarih damgalı sine döngü oluşturur.
2. Hedeflenen kabarcık Görüntüleme
   1. 'Prefs' altında, 0.1 sn patlama saati ayarlayın. Denetimleri des kullanarak uygun görüntüleme parametrelerini ayarlayınyukarıda açıklanan şekilde (7.1.2.).
   2. Kontrol panelinde 'kontrast modunu' düğmesine basarak doğrusal olmayan kontrast görüntüleme başlatın. Embriyo düzgün transdüser altında ve embriyo ile kabarcık kontrast madde akışı doğrusal olmayan kontrast modunu görüntüde görünür olduğunu almaktadır olun.
   3. Embriyonik moleküler görüntüleme sırasında bağlayıcı hedefe Kabarcığa değerlendirmek için, mikro-kabarcıkların 3 dakika enjeksiyonundan sonraki 40 saniye boyunca rahatsız edilmeden dolaşmasına izin verir. Bu kez dolaşımdaki mikro-kabarcık tutma sağlamaktır. Basın 'tarama / dondurma' Bu süre içinde görüntüleme durdurmak için.
   4. 3 dakika ve 40 saniyede, özgeçmiş görüntüleme embriyo yeterince PBS ile kaplıdır, hala görünür olduğunu doğrulamak için, ve mikro kabarcıklar dolaşmaya devam ettiğini. Basın 'tarama / dondurma' görüntüleme başlatmak için.
   5. Bir 'ön-destruc kaydederek 3 dk 50 sn sonrası enjeksiyon de bozulma / ikmal dizisi Edinme29 Hz yon 'akustik tepki dizisi. Basın 'tarama / dondurma' veri toplama başlatmak için. 4 dakika sonrası enjeksiyon ^18,19 itibariyle, 0.1 sn yüksek frekanslı akustik patlaması başlatmak. Bir patlama uygulamak için 'patlama' düğmesine basın.
   6. (Tampon hattı dolana kadar) dizisinin geri kalanı için çerçeveler kayıt ve 'sine mağaza' tuşuna basarak sine döngü kurtarmak için devam edin.
   7. Mikrokabarcıkları dolaşan bir ek cine döngü toplayın. Bu, sonraki post-yıkım 'görüntüleme dizisi ışınını doldurulan yalnızca dolaşan kabarcık sinyallerini içeren varsayılır. Basın 'tarama / dondurma' görüntüleri toplamak için görüntüleme ve 'sine mağaza' başlatmak için.
   8. Her embriyo görüntüleme sonra cine döngüler etiketleyin. Basın 'Çalışma yönetimi', rulo topu kullanarak dosyayı vurgulayın ve uygun düğmesine basın 'görüntü etiketi' ve adını '' seçin.

Enjeksiyon sonrası Embriyolar 8. Taşıma

1. Mesaj görüntüleme, istediğiniz gibi (başları kesilerek, servikal dislokasyon, karbon dioksit boğulma, ya da hızlı dondurma veya tespit takiben anestezi ile), dönüştürücüyü hareket embriyo sabitlemesini kaldırın ve euthanize.
2. Sonraki her embriyo enjeksiyon için yeni bir diseksiyon çanak, iğne, şırınga ve tüp segmenti diseksiyonu ve canlanma sırasında kabarcık enjeksiyon çözümü alma yeri sonraki toplu hazırlanması, kullanılması gerekir.
3. Ek analizler için doku örnekleri (örneğin, kuyruk, beyin) Kaydet (örneğin, izole kuyruk DNA, lacZ boyama, ya da batı blot ²¹ kullanılarak biyomarker ifade yarı-kantitatif tedbirler PCR analizi ile belirlenir genotiplemesi).

Sonuçlar

Eski in utero fare embriyoları ultrason kontrast ajanlarının enjekte enjeksiyonu ve ilgili ultrason görüntüleme boyunca rahim ve canlılığının korunması ile ilgili oturma, geç gebelik aşamasında embriyoların başarılı bir şekilde izole bağlıdır. Embriyo batın ve Şekil 1 'de gösterildiği gibi, konumlandıktan sonra, embriyonik damar içine kontrast maddenin dikkatli bir enjeksiyon mümkündür. Bir E17.5 fare embriyo tipik bir B-kipi ultrason görüntüsü Ş...

Tartışmalar

Ultrason kontrast ajanlar geç evre gebelik fare embriyoları ve doğrusal olmayan kontrast görüntüleri enjekte edildi perfüzyon parametreleri ölçmek için edinilen ve bağlayıcı Kabarcığa hedef alındı. Embriyonik damar sistemi içerisinde mikro-kabarcıkların başarılı görüntüleme bir dizi faktöre, ilk olarak embriyo canlılığı bağımlıydı. Tüm ekipman ve cihaz enjeksiyonun başlangıcında rahim embriyoların izolasyonu için gerekli olan zamanı en aza indirmek için önceden hazırlanmışt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08