고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

요약

여기서 우리는 생활에 초음파 미세 기포 조영제, 고립 늦은 임신 단계 쥐의 배아를 주입하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관류의 매개 변수 및 조영 증강 고주파 초음파 영상을 이용한 혈관 내 배아 분자 마커의 연구를 가능하게한다.

초록

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

서문

조영 증강 초음파 영상 시각화하고 혈관 환경의 특성을 미세 기포 조영제를 사용한다. 이러한 에이전트는 미세 순환, 혈관 및 심장 혈관 기능의 비 침습적 평가를 할 수 있습니다. 또한, 기포 표면의 개질이 가능 혈관 질환의 분자 초음파 영상을 혈관 신생, 염증 및 아테롬성 경화증의 임상 ^1,2- 애플리케이션에서 입증 된 바와 같이, 내피 표적 바이오 마커에 ​​대한 결합 미세 기포가 발생할 수있다. 콘트라스트 향상 초음파 따라서 혈관 질병과 건강 상태에 ^{영향 3-5} 복잡하고 다양한 환경을 식별하기 위해 사용될 수있다.

년의 과거 수 년, 마이크로 버블 영상의 유용성에 대한 관심이 다양한 마우스 배아 모델을 확장했다. 포유류의 개발 모델로, 배아 미세 기포 맥관계 내로 도입 생리 향상개발 순환 시스템 (예를 들어, 혈류, 심장 출력) 및 형질 전환 사례 및 심장 질환 ^6,7의 대상으로 돌연변이 마우스 모델에서의 연구는 심장 혈관 기능을 변경하는 방법 유전 적 요인에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 사실, 양적 및 질적 2D는 배아 뇌 혈관 분석 이미 ^8을 달성했다. 더욱이, 마우스의 배아는 생체 내에서 혈관 마커 타겟팅 결합 미세 기포를 검사하는 우수한 모델로서 제시한다. Bartelle 등. ^(9)는, 예를 들어, Biotag - 피라 유전자 변형 배아에 바인딩 및 혈관 해부학을 검토하여 대상을 평가하기 위해 태아 심장의 심실에 아비딘 미세 기포를 도입했습니다. 병원에이 기술을 번역에서 중요한 벤치 마크 - 이질 동형 접합 마우스 모델의 생성은 분자 초음파의 양적 특성을 정의하는 것을 목표로 종양 모델 연구를위한 대리로 사용할 수 있습니다.

마이크로 버블은 자주 개복술 ^8-10 통해 노출로 단일 배아 심장 내 주사를 통해 순환 배아에 도입된다. 자궁 내 주사 그러나 난제에 직면하고있다. 이러한 주입 안내, 어머니 표면화 배아 움직임에 대응하는 필요, 어머니 혈역학 생존을 유지하고 ^(11)에 의한 출혈 합병증 마취 장기적인 효과를 어드레싱 표면화 배아를 포함한다. 따라서, 조사의 목적은 거실 절연 말기 배아 미세 기포 ⁽¹²⁾ 내로 주입하는 기술을 개발하는 것이었다. 이 옵션은 분사 제어 및 위치, 장애물없이 촬상면의 재현성 간단한 이미지 분석 및 정량의 관점에서 더 많은 자유를 제공한다.

본 연구에서는 FO 살아있는 쥐의 배아에 미세 기포를 주입위한 새로운 절차 개요R 마이크로 버블 운동 동작을 연구하고의 목적은 내인성 내피 세포 표면 마커에 결합 마이크로 버블을 목표로 공부. 비선형 대비 특정 초음파 영상은 피크 향상 (PE), 세척 된 속도와 시간 고립 E17.5 배아에 (TTP)을 피크를 포함하는 기본 관류 매개 변수들로 측정하는 데 사용됩니다. 우리는 또한 활성 혈관 ^(13)의 부위에서 혈관 내피 세포에서의 고 발현에 endoglin은 임상 적으로 관련된 대상 함수 트랜스 제닉 마우스 모델의 배아 endoglin 손실 분자 초음파의 정량적 특성을 평가하기위한 배아 모델의 타당성을 입증 . endoglin 타겟 (MB _E) 쥐 이소 IgG의 ₂ 제어 (MB _C) 및 타겟이 불분명 한 (MB _U) 마이크로 버블의 접착 이형 endoglin (영어 ^+/-)과 동형 접합 endoglin (영어 ^{+가 / +)} 표현 배아에서 평가된다. 대상 BINDI 분석NG 분자 초음파 endoglin 유전자형을 구별 정량화 초음파 분자 수준 수용체 밀도를 관련시킬 수 있음을 보여준다.

프로토콜

참고 : 본 연구에서 수행 된 실험 절차는 동물 관리 Sunnybrook 연구소위원회 (토론토, 온타리오, 캐나다)에 의해 승인되었다. 동물의 인도적인 처리를위한 절차는 항상 준수해야합니다. 이는 연구자는 초음파 촬상 시스템의 기본적인 동작에 숙련되어있는 것으로한다. 이 프로토콜은 두 사람이 가장 잘 작동합니다.

1. 동물 모델

1. 메이트 CD-1 남성과 여성 뮤스의 musculus는 관류 연구 야생형 배아를 얻었다.
2. Bourdeau 등. ^(14)에 의해 설명 된 바와 같이 분자 영상 연구를 들어, 129 / 안녕 기원의 배아 줄기 세포를 사용하는 동종 재조합에 의해 영어 +/- 마우스를 생성합니다.
   1. 교잡 B6- 영어 ^+/- 마우스는 친절 CD-1 배경에 박사 미셸 Letarte에서 인수했다. 사용 공학과 ^+/- CD-1 backcrossed 배아,뿐만 아니라 영어 ^{+ / +} 한배 새끼 공동ntrols. 배아를 개최 생산하는 마우스 메이트.

2. 실험 준비

1. 쥐의 짝짓기를 시작하고 매일 플러그를 확인합니다. 배아 하루 0.5 질 플러그가 관찰되는 날 정오로 정의된다.
2. (500)에 소 태아 혈청을 50 ㎖, 5 1 M HEPES ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 5 ㎖ (10,000 유닛의 페니실린, 10,000 μg의 스트렙토 마이신)을 첨가하여 배아 매체를 준비 ml의 둘 베코 변성 이글 배지 고 글루코스 (DMEM) (4500 mg의 / L). 호일로 병을 싸서 4 ℃에서 냉장 보관하십시오.
3. 20 분 140 XG에 50 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 분명 초음파​​ 젤. 30 ml를 주사기로 헤어 젤립니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)와 별도로 설정과 추가 (표시) 30ml의 주사기를 입력합니다. 배아의 한 쓰레기는 일반적으로 초음파 젤의 2 ~ 3 주사기와 PBS의 4 주사기 사이에 필요합니다.
4. 약 30 유리 바늘을 당겨 플라 스티의 스트립에 고정 부드럽게100 × 20mm 세포 배양 접시에. 이것은 바늘을 분리하여 처리하는 동안 보안되도록. 히터 (77) 서브 자석 (55), 메인 자석 70 : 유리 풀러를 사용하여, 필라멘트 1 X 90mm 유리 모세관에 다음과 같은 설정을 사용합니다.
5. 기본에 경화제의 8 부피 비율 : 1을 사용, (자신의 요리를 받게됩니다 담가 내에서 각각의 배아를 보장하기에 충분) 10-12 해부 접시를 준비합니다. 50 ML 원뿔 튜브에베이스 40ml를 붓고. 5-6 ml의 경화제를 추가하고 나무 막대기로 저어.
   1. 약 절반에 각을 작성, 60 X 15mm 배양 접시에 붓는다. 스탠드 O / N 설정할 수 있습니다.
6. (: 0.79 mm 내경) 폴리 염화 비닐 (PVC) 튜브 400mm 긴 조각에 여성 luers를 연결합니다. 튜브 편안 초음파 단계에 주사기 펌프에서 도달해야한다.

3. 실험 장치

1. 3D 및 리니어 모터 (21) 어레이와 MH 수술 현미경 이미징 플랫폼을 마련Z 변환기.
   1. 오리엔트 플랫폼 레일 탑재되도록 현미경의 바로 아래에 위치하는 스테이지와, 좌측에있다.
   2. 플랫폼의 확장 암의 볼 조인트에 3D 모터를 연결합니다. 앞으로 직면, 모터에 장착 퀵 릴리즈로 트랜스 듀서 클램프의 퀵 릴리스 후 나사, 래치를 고정, 클램프에 변환기 헤드를 위치.
   3. 카트의 전면 패널에있는 활성 포트 트랜스 듀서 커넥터를 고정합니다. 컴퓨터를 켭니다.
2. 분자 영상 연구의 '심장'설정을 선택, 21 MHz의 초음파 변환기를 시작하고, 관류 연구를위한 '일반'. 정확한 중간 위치에 모든 시간 이득 보상 슬라이더를 이동. 주파수 : '대비 모드'의 경우 다음 매개 변수 설정 18 MHz의 전력 전송 : 30dB, 초점 : 4 % (0.39 MPa의)를, 이득 대비 비선형, 버스트 시간 : 6 10mm를, 모드 대비 100 % 0.1에서초, 빔 폭 : 와이드.
3. 나누어지는 40 ml의 배아 미디어 넷 50 ML 원뿔 튜브에 각. 얼음에 놓습니다.
4. 핫 플레이트에 2 L 비이커에 물 1 L를 가열. 45 ° C에서 유지한다. 예열 비커에 초음파 젤 PBS의 한 주사기를 추가합니다. 항상 온도계를 모니터링하여이 온도를 유지한다.
5. 열두 1 ml의 주사기와 미세 기포의 주입을위한 열 (21) 십이 G 바늘 옆으로 열 설정합니다.

4. 수술

참고 : 외과 의사가 수술을 시작하면서 조수가 거품 (5 단계)를 준비하게한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 휘 틀리는 등에서 적응하고있다. ⁽¹⁵⁾

1. 자궁 경부 전위 다음 임신 여성 마우스에서 E16.5 또는 E17.5 배아를 수집합니다.
   참고 : 배아 마취의 효과는 아직 세부 사항 ⁽¹⁶⁾ 연구되지 않았다. 목 베기 등의 추가 방법은, 적절한 연산 할 수있다임신 한 쥐의 희생에 대한 TIONS.
   1. 자궁 및 배아를 나타 내기 위해 복부를 오픈. 조심스럽게 빠르게 (난소와 자궁의 혈관 절단) 자궁 뿔의 끝을 절단 및 질과 방광에 절단하여 자궁을 제거합니다.
   2. 가시 집게를 사용하여 배아를 손상시키지 않고 가능한 한 신속하게 빙냉 배아 매체 40ml의 튜브의 자궁에 옮긴다. 마우스 시체를 버리십시오.
2. 현미경 무대 이주. 100 × 20mm 세포 배양 접시에 자궁을 입금. 50 ml의 신선한 배아 매체 가득 새로운 접시에 자궁을 전송합니다.
3. 부드럽게 찢어 한쪽 끝에서 시작하여 자궁의 외부 세포막을 당깁니다, 살균 (70 % 에탄올 스프레이) 미세 집게를 사용. 태반의 탈락, 정수리 난황과 분리 기본 내장 난황에서 제거 할 라이 헤르 트의 막을 노출.
4. 내장 Y를 유지 하나 하나 배아를 해부OLK 주머니에 손상이없고 가능한 한 조심스럽게 ⁽¹⁷⁾ 태반을 처리. 배아는 즉시 팝업으로 난황의 파열을 방지하기 위해주의하십시오.
   1. 신선한 배아 매체와 얼음에 보관 다른 접시에 배아를 이동 천공 숟가락을 사용합니다. 필요할 때까지 냉장 배아를 유지합니다. 배아 접시에 모든 1-1.5 시간을 미디어를 변경합니다. 이러한 조건으로 배아는 해부 후 최대 4 시간 동안 가능한입니다.

5. 마이크로 버블 준비

참고 : 두 대상 및 타겟이 불분명 한 미세 기포를 사용하여 초음파와 분자 이미징을 수행합니다. ⅰ) 항체 표적 미세 기포, ⅱ) 제어 이소 타입 항체 표적 미세 기포 및 ⅲ) 타겟이 불분명 한 미세 기포 : 하나의 실험은 많은 3으로 미세 기포의 별도의 유리 병을 요구할 수 있습니다. 조영제는 동결 건조 분말로서 제공 및 주입 전에 식염수로 재구성되어야한다. 각 타겟이 불분명 한 microb에서 ~ 2 × 10 ⁹ 마이크로 버블이 있습니다ubble 유리 병 ~ 대상 준비가 유리 병에 8.8 × 10 ⁸ 마이크로 버블. 마이크로 버블은 재구성 후 최대 3 시간 동안 안정하다.

1. 대상 준비 튜브의 재구성
   참고 : 대상 준비 준비의 예 : endoglin 대상으로 미세 기포 (마우스 endoglin에 바이오틴 쥐 MJ 7/18 항체 MB _E; 집 하이 브리 도마 시설에서); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2) 타겟 미세 기포 (MB _V, 비오틴 안티 - 마우스와 CD309); 쥐 이소 IgG의 ₂ 제어 항체를 대상으로 미세 기포 (MB _C, 비오틴 쥐 이소 IgG의 ₂ 제어 마우스의 IgG2a를 대상으로).
   1. 식염수 1 ㎖로 항체 용액 (20 μg의) (최종 부피)을 희석. 얼음에 보관하십시오.
   2. 모든 공기 방울을 제거, 1 ml의 생리 식염수와 주사기를 입력합니다. 21 G 바늘을 부착, 마이크로 버블 유리 병에 천천히 솔루션을 주입.
   3. 천천히 1 ml의 공기를 제거하는, 상기 플런저를 철회하고, 바늘을 철회. 부드럽게교반. 얼음에 5 분을 서 보자.
      주 : 초음파 미세 기포는 고압 환경 하에서 파괴 될 수있다.
   4. 경과 시간 후, 항체 희석으로 새 주사기를 작성하고 적절한 바이알에 추가 할 수 있습니다. 부드럽게 교반. 혼합물 (현재 2 ㎖)을 10 분 동안 서 보자. 얼음에 보관하십시오. 전체 표면 접합을 가정하면, 미세 기포에 대한 결합 리간드의 평균 개수가 약 ¹⁸ 7,600 리간드 / ² ㎛이다.
2. 타겟이 불분명 한 유리 병의 재구성
   1. 모든 공기 방울을 제거, 1 ml의 생리 식염수와 주사기를 입력합니다. 21 G 바늘을 부착, 마이크로 버블 유리 병에 천천히 솔루션을 주입.
   2. 천천히 1 ml의 공기를 제거하는, 상기 플런저를 철회하고, 바늘을 철회. 부드럽게 교반. 5 분을 서 보자. 상술 한 바와 같이, 추가 1 ml의 생리 식염수를 추가합니다. 부드럽게 교반과 얼음에 10 분 서 보자.
3. 콜터 계수
   1. 부드럽게 ~ 원하는 미세 기포 유리 병을 선동하고 그릴21 G 바늘을 사용하여 1 ㎖의 용액을 주사기로 50 μL. 빈 2 ML의 microcentrifuge 관에 미세 기포를 주입한다.
   2. 희석제의 10 ㎖ 중에 미세 기포 스톡 용액 10 μL 샘플 피펫.
   3. 부드러운 혼합 한 후, 풀 베는 계수를 (재료의 목록 참조)를 사용하여 마이크로 버블 인구의 농도와 크기 분포를 평가합니다. 30 μm의 조리개를 사용하여 (유리 병 샘플 당) 세 50 μL 측정의 최소를 계산합니다.
4. 주입을위한 준비 마이크로 버블
   참고 : '배아로 마이크로 버블의 주입을'때 조수가이 단계를 수행합니다 (6 단계)가 시작된다. 각각의 배아 각 주사에 대해 선택된 미세 기포의 형태 무작위 마이크로 버블의 모든 유형 균등 절차 걸쳐 분포하지만 임의의 순서로되도록 소정의 보조자로 선택되도록, 한번 주입된다. 거품의 형태가 주입되는 외과 의사가 맹인 확인합니다.
   1. 일 결정400 μL의 부피 1 × 10 ⁸ 메가 바이트 / ㎖의 최종 농도를 생산 (5.3.3 측정 스톡 농도를 이용하여 부피를 계산)하기 위해 필요한 버블 스톡 용액의 전자 볼륨. 빈 microcentrifuge 관에 식염수 해당 볼륨을 나누어지는.
   2. 조심스럽게 선택된 마이크로 버블 유리 병을 선동하고, 21 G 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기로 솔루션 (위의 계산보다 50 μL 이상 ~) 초과 볼륨을 그립니다. 빈 microcentrifuge 관에 미세 기포를 주입한다.
   3. 마이크로 버블 원액 필요한 볼륨을 피펫과 생리 식염수를 나누어 추가 할 수 있습니다. 피펫의 끝으로 가볍게 교반하여 섞는다.
   4. 21 G 바늘을 사용하여 깨끗한 주사기에 희석 마이크로 버블 솔루션을 그립니다. 바늘을 제거, 주사기에서 공기 방울을 제거하고 루어와 튜브를 연결합니다. 천천히 기포를 생성하도록 확실하지 튜브 결정의 단부에 용액을 누른다.
   5. syrin를 삽입20㎕의 전체 부피 20 μL / 분의 속도로 미세 기포를 분배하도록 설정 시린지 주입 펌프로 GE. 튜브의 끝에 뽑아 유리 바늘을 연결합니다. 사출 단계에 가까운 펌프를 이동합니다.

태아에 마이크로 버블의 6 주입

1. 무작위로 선택하고 냉장 미디어 접시에서 (천공 숟가락으로) 한 배아를 제거합니다. 입체경에서 초음파 단계에있는 해부 접시에 놓고 적어도 혈관이 나타나는 측 (antimesometrial 측)에서 찢어 / 절단, 미세 집게와 난황과 양막을 제거합니다. 쉽게이 헤드 영역에 인접한 영역을 관통함으로써 달성된다.
   1. 내에서 배아를 제거하기에 충분하지만, 더 이상을 잘라. 플라 스티의 작은 조각을 사용하여 해부 요리를 안정시킨다.
2. 조심스럽게 배아 주변에서 주머니를 기동. 태반으로, 옆으로 배아를 놓고앞에 제대 혈관. 난황을 핀, 곤충 핀을 사용 (4 핀 권장)하고 필요에 태반의 가장자리가 장소에 부착 할 수 있습니다. 주요 혈관을 피하십시오.
3. 배아가 부활 할 때까지 미리 예열 45 ° C PBS와 배아를 씻으십시오. 제대 정맥 및 관련 혈관 네트워크를 식별합니다. 주사를 편안하게 할 수 있도록 요리를 배치합니다.
   참고 : 따뜻하게되면, 태아의 혈액이 눈에 띄게 제대 동맥에 펌프, 흐름을 시작합니다. 누출을 먼저 시작하면, 정맥 두 배 빠르게 동일한 표시의 피로, 밝은 빨간색 될 것입니다. 제대 정맥에서 발생하는 지점은 일반적으로 태반 표면에 대동맥에서 그 오버레이.
4. 배아가 부활되면, 섬세 배아 주위에서 (미세 집게를 사용) 공기 방울을 제거해야되고, 미리 예열 미국 젤로 (그러나 태반)을 커버한다. 미리 예열 PBS와 요리를 최고.
   참고 : soluti의 수준에 눈을 유지필요에 따라 PBS 젤 주사기에서의 가열 비커에 백업 주사기를 추가합니다.
5. 해부 접시의 가장자리에 플라 스티의 큰 공을 유리 바늘을 마운트하고 PBS로 바늘 끝을 삽입합니다. 지금까지 주요 지점에서, 합리적인 태반 디스크의 융모 표면의 정맥을 선택, 가위를 사용하여 크기로 끝을 잘라. 끝이 약간 비스듬하게 절단 할 경우, 사출있는 가장 쉬운 방법입니다. 봄 가위의 가장자리를 사용하여 유리의 가장자리의 계단 현상을 제거합니다.
6. 모든 공기가 바늘 끝으로부터 배출되고, 미세 기포는 PBS로 자유롭게 유동 보일 때까지 주사기 펌프를 사용하여 천천히 유리 바늘 내로 20 μL / 분 미세 기포 용액을 주입. 펌프를 중지하고 20 μL의 주입 볼륨에 대해 다시 설정합니다. 공기가 주입하는 동안 태아의 혈관 시스템에 흘러 들어 가지 않도록 할 것.
7. 태반에 부드럽게 정맥 ​​중 하나에 유리 바늘 끝을 삽입하고 움직이지되어 있는지 확인합니다. stere 멀리 스윙oscope 헤드와 위치 배아 위의 트랜스 듀서. 영상을 시작합니다.

7. 초음파 분자 영상

참고 : 이전에 설정 한 반면 비선형 영상 조건을 사용하여, 배아가 6, 10mm의 초점에 고르게 위치해 그래서 변환기를 놓습니다. 일단 위치, 미세 기포의 일시 주사를 시작합니다. 주입이 완료되면, 타이머를 시작한다.

1. 관류 영상
   1. 비선형 대비 모드에 대한 프레임의 최대 수는 '연구 관리'버튼을 누르고 연구 브라우저 상단의 '환경 설정'탭을 클릭하여 선택되어 있는지 확인합니다. '환경 설정'창에서 해당 확인란을 선택합니다.
   2. 비선형 영상을 시작하여 이미지 설정을 조정합니다. 제어판의 '대비 모드'버튼을 누릅니다. '# 이득을 조정하여 이득 2D 에이전트8217; 30 dB로 다이얼 '전원'다이얼을 사용하여 4 %의 전원을 절감, '주파수'전화 넓은 롤러 볼 / 마우스를 사용하는 빔 폭 (왼쪽 아래)을 설정을 사용하여 1 Hz로 주파수를 감소.
      참고 : 모든 제어가 초음파 시스템의 제어 패널에 있습니다.
   3. 1 Hz의 프레임 레이트로 20 분 시네 루프를 기록함으로써, 미세 기포의 전체 루스 세척 - 소산 및 캡처. 를 눌러 스캔 / 동결은 데이터 수집을 시작합니다.
   4. 이미지의 전체 시퀀스가 포착되면, 시스템 메모리에 일련의 이미지를 저장하는 제어 패널에 위치한 '시네 가기'버튼을 누른다. 이 시스템은 획득 한 비선형 대비 모델 데이터의 날짜 스탬프 시네 루프를 만듭니다.
2. 대상 마이크로 버블 이미징
   1. '환경 설정'에서 0.1 초에 버스트 시간을 설정합니다. 컨트롤 DES를 사용하여 적절한 촬상 파라미터를 설정위의 cribed (7.1.2.).
   2. 조작부 '콘트라스트 모드'버튼을 눌러 비선형 콘트라스트 촬상을 시작합니다. 배아가 제대로 변환기 하에서 및 배아를 통해 미세 기포 조영제의 흐름 비선형 콘트라스트 모드 화상의 표시되는지 확인 위치해.
   3. 배아 분자 영상 연구 중에 바인딩 표적으로 한 마이크로 버블을 평가하기 위해, 마이크로 버블은 3 분 주입 완료 후 40 초 동안 방해받지 않고 순환 할 수 있습니다. 이 시간은 순환​​ 미세 기포 보유를 허용하는 것이다. 를 눌러 '스캔 / 동결'이 시간 동안 영상을 정지합니다.
   4. 3 분 40 초에, 이력서 영상은 배아가 적절하게 PBS로 덮여, 여전히 볼 수 있는지 확인하고, 미세 기포가 순환 계속. 를 눌러 '스캔 / 동결'촬영을 시작합니다.
   5. '사전 destruc를 기록하여 3 분 50 초 후 분사의 중단 / 보충 순서 획득29 Hz에서 기 '음향 응답 순서. 를 눌러 '스캔 / 동결'는 데이터 수집을 시작합니다. 4 분 포스트 분사 ^18,19에서, 0.1 초 고주파 탄성 버스트를 시작. 버스트를 구현하는 '버스트'버튼을 누릅니다.
   6. (버퍼 라인이 가득 찰 때까지) 순서의 나머지 프레임을 기록하고 '시네 저장'을 눌러 시네 루프를 저장하기 위해 계속합니다.
   7. 마이크로 버블 순환의 추가 시네 루프를 수집합니다. 이 이후의 '포스트 파괴'영상 시퀀스는 빔을 보충 만 순환 거품 신호를 포함하는 것으로 가정한다. 를 눌러 '스캔 / 동결'는 이미지를 수집하는 이미지와 '시네 저장'을 시작합니다.
   8. 각각의 배아를 이미징 후 시네 루프 레이블. 를 눌러 '연구 관리', 롤러 볼을 사용하여 파일을 선택하고 적절하게 버튼을 눌러 '이미지 레이블'와 이름을 '선택'.

주입 후 태아의 8 취급

1. 촬상 후, 원하는대로 (단두, 경추 탈구, 이산화탄소 질식, 또는 급속 냉동 또는 고정 하였다 마취를 통해), 트랜스 듀서를 이동 및 고정 해제 배아를 안락사.
2. 이후의 각 배아 주입을 위해 신선한 해부 접시, 바늘, 주사기와 튜브 세그먼트는 해부 부흥 동안 마이크로 버블 주입 솔루션 일어나는의 다음 배치의 준비를 사용해야합니다.
3. 추가 분석을위한 조직 샘플 (예를 들면, 꼬리, 뇌)을 저장 (예를 들어, 고립 된 꼬리 DNA, LacZ를 염색, 또는 서쪽 오 ^(21)를 사용하여 바이오 마커의 발현을 반 정량적 측정의 PCR 분석에 의해 결정 유전자형).

결과

전 자궁 마우스 배아에 초음파 조영제의 주입은 주입 및 관련 초음파 영상의 과정을 통해 자궁과 생존의 유지 보수에서 생활, 늦은 임신 단계 배아의 성공적인 분리에 따라 달라집니다. 배아가 표면화하고도 1에 도시 된 바와 같이, 위치되면 배아 혈관에 조영제 주입 조심 가능하다. E17.5 마우스 태아의 전형적인 B 모드 초음파 이미지는도 2a에 도시된다. 미세 기포 ?...

토론

초음파 조영제가 말기 임신 마우스 배아 및 비선형 대비 이미지로 주입 하였다는 관류 매개 변수를 측정하기 위해 취득 및 바인딩 마이크로 버블을 대상으로 하였다. 배아의 혈관계 내의 미세 기포 성공적인 이미징은 다수의 인자, 제 인 배아 생존에 의존했다. 모든 장치 및 장치가 분사의 시작에서 배아의 자궁 분리에 필요한 시간을 최소화하기 위해 사전에 준비 하였다. 쥐 배아 마취 단일 또는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08