Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Riepilogo

Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all'interno dell'embrione con mdc alta frequenza ecografica.

Abstract

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Introduzione

Mdc ecografia fa uso di mezzi di contrasto microbolle di visualizzare e caratterizzare l'ambiente vascolare. Questi agenti consentono la valutazione non invasiva del microcircolo, vascolarizzazione e la funzione cardiovascolare. Inoltre, la modifica della superficie bolla può provocare microbolle mirate legame biomarker endoteliali, come dimostrato in applicazioni preclinici di angiogenesi, aterosclerosi e infiammazione ^1,2 rendendo molecolare ecografico di eventi vascolari possibili. Ultrasuoni può quindi essere utilizzato per identificare gli ambienti complessi e diversi che influenzano gli stati vascolari sani e malati ^3-5.

Nel numero ultimi anni, l'interesse per l'utilità dell'imaging microbolle ha esteso il modello di topo embrione versatile. Come un modello di sviluppo dei mammiferi, l'introduzione di microbolle nel sistema vascolare embrionale migliora fisiologicostudio del sistema circolatorio in via di sviluppo (ad esempio, il flusso di sangue, la gittata cardiaca) e in caso di transgenici e mirati modelli mutanti murini di malattie cardiache ^6,7, può produrre intuizioni come i fattori genetici alterare la funzione cardiovascolare. In realtà, 2D quantitativa e qualitativa di analisi vascolare cerebrale embrionale sono già stati raggiunti ^8. Inoltre, l'embrione del mouse presenta come un ottimo modello per esaminare il legame di microbolle mirati ai marcatori vascolari in vivo. Bartelle et al. ^9, per esempio, hanno introdotto microbolle avidina in embrione ventricoli cardiaci per valutare bersaglio 'vincolante Biotag-Bira embrioni transgenici ed esaminare l'anatomia vascolare. La generazione di modelli eterozigoti e omozigoti mouse può essere utilizzato anche come un surrogato per studi su modelli tumore volti a definire la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare - un punto di riferimento importante nel tradurre questa tecnica per la clinica.

Le microbolle sono più frequentemente introdotta per la circolazione embrionale tramite iniezioni intra-cardiaca in singoli embrioni esposti attraverso una laparotomia ^8-10. In iniezioni utero, tuttavia, affrontare una serie di sfide. Questi includono una guida di iniezione, la necessità di contrastare il movimento nella madre ed embrione esteriorizzato, manutenzione della viabilità emodinamica nella madre ed embrioni esteriorizzato, affrontando gli effetti a lungo termine di anestesia e complicazioni dovute al sanguinamento ^11. Pertanto, l'obiettivo della ricerca è stato quello di sviluppare una tecnica per l'iniezione di microbolle in isolato di vita in fase avanzata di embrioni ^12. Questa opzione offre maggiore libertà in termini di controllo dell'iniezione e posizionamento, riproducibilità del piano di imaging senza ostacoli, e analisi di immagine semplificata e quantificazione.

Nel presente studio, si delineano una nuova procedura per l'iniezione di microbolle in vita embrioni murini for fini di studio del comportamento cinetico microbolle e di studiare legame marcatori di superficie endoteliali endogeni microbolle mirati. Contrasto non lineare specifica ecografia viene utilizzato per misurare una serie di parametri di perfusione di base tra cui la valorizzazione di picco (PE), lavare-in rate e il tempo di picco (TTP) in isolati embrioni E17.5. Abbiamo inoltre dimostrato la validità del modello dell'embrione per valutare la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare in una perdita endoglin embrionale di modello di topo transgenico funzione, dove endoglin è un obiettivo clinicamente rilevante a causa della sua elevata espressione in cellule endoteliali vascolari in siti di angiogenesi attiva ¹³ . L'adesione di endoglin mirati (MB _E), topo IgG ₂ di controllo (MB _C) e non mirati (MB _U) microbolle viene valutato in endoglin eterozigoti (Eng ^+/-) e endoglin omozigote (Ita ^{+ / +)} esprimendo embrioni. Analisi della bindi miratang rivela che gli ultrasuoni molecolare è in grado di distinguere tra genotipi endoglina e relativa densità dei recettori per i livelli quantificabili ultrasuoni molecolare.

Protocollo

NOTA: Le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono stati approvati dal Comitato per animali al Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procedure per il trattamento umano degli animali devono essere rispettate in ogni momento. Si presume che il ricercatore è addestrato nel funzionamento di base di un sistema di imaging ad ultrasuoni. Questo protocollo funziona meglio con due persone.

1. Modelli animali

1. Mate CD-1 maschile e femminile Mus musculus di ottenere embrioni wild type per gli studi di perfusione.
2. Per gli studi di imaging molecolare, generare Eng +/- topi per ricombinazione omologa utilizzando cellule staminali embrionali di 129 / Ola origine come descritto da Bourdeau et al. ^14.
   1. Topi backcross B6- Eng ^+/-, gentilmente acquisiti dal Dr. Michelle Letarte, il CD-1 di sfondo. Uso Eng ^+/- CD-1 embrioni reincrociata, nonché la loro Eng ^{+ / +} littermate controls. Mate i topi di produrre embrioni in scena.

Preparazione 2. sperimentale

1. Iniziato accoppiamento di topi e verificare spine quotidiana. Giorno embrionale 0.5 è definito come ore del giorno un tappo vaginale è osservata.
2. Preparare i media embrione aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di 1 M HEPES e 5 ml di penicillina-streptomicina (10.000 unità di penicillina, 10.000 mg di streptomicina) per 500 ml modificata mezzo di Eagle di Dulbecco (DMEM) con alte concentrazioni di glucosio (4.500 mg / L). Avvolgere la bottiglia in alluminio e mantenere refrigerati a 4 ° C.
3. Centrifuga chiaro gel per ultrasuoni in 50 ml provette coniche a 140 xg per 20 min. Disegna gel up in 30 ml siringhe. Riempire supplementari (contrassegnati) 30 ml siringhe con tampone fosfato salino (PBS) e mettere da parte. Una cucciolata di embrioni generalmente richiederà tra 2-3 siringhe di gel per ultrasuoni e 4 siringhe di PBS.
4. Tirare circa 30 aghi di vetro e fissare delicatamente per una striscia di plastilinain un piatto di coltura cellulare 100 x 20 mm. Questo assicura che gli aghi vengono separati e sicura durante la movimentazione. Utilizzando un estrattore di vetro, utilizzare le seguenti impostazioni su 1 x 90 mm capillari di vetro con filamento: Heater 77, Sub magnete 55, magnete principale 70.
5. Preparare 11:50 piastre dissezione (sufficienti a garantire che ogni embrione all'interno di una cucciolata riceverà il proprio piatto), con un rapporto di 1: 8 volume di agente indurente alla base. Versare 40 ml di base in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 5-6 ml agente indurente e mescolare con bastone di legno.
   1. Versare in 60 x 15 mm piatti della cultura, riempiendo ogni a circa la metà. Lasciate riposare O / N per impostare.
6. Attaccare Luers femminili a 400 mm lunghi pezzi di cloruro di polivinile (PVC) tubo (diametro interno: 0,79 millimetri). Il tubo deve raggiungere dalla pompa siringa al palco ultrasuoni comodamente.

3. set-up sperimentale

1. Disporre la piattaforma di imaging sotto il microscopio operatorio con un motore 3D e lineare 21 MHtrasduttore z.
   1. Posizionare la piattaforma in modo che la rotaia di montaggio è a sinistra, con la fase posizionato direttamente sotto il microscopio.
   2. Fissare il motore 3D al giunto sferico del braccio della piattaforma allungabile. Avvitare il posto sgancio rapido del morsetto trasduttore nella sgancio rapido montaggio sul motore, rivolto in avanti, e posizionare la testina del trasduttore nel morsetto, fissare il fermo.
   3. Fissare il connettore del trasduttore nella porta attiva sul pannello frontale del carrello. Accendere la macchina.
2. Avviare il 21 MHz trasduttore ad ultrasuoni, selezionando l'impostazione 'Cardiologia' per gli studi di imaging molecolare, e 'generale' per gli studi di perfusione. Maiusc tutti i cursori guadagno indennizzo tempo in posizione centrale esatta. Per 'la modalità di contrasto', impostare i seguenti parametri: Frequenza: 18 MHz, la potenza di trasmissione: 4%, (0,39 MPa), contrasto Guadagno: 30 dB, Foci: 6 e 10 mm, contrasto Modalità: Nonlinear, tempo di Burst: 100% a 0.1larghezza sec, Larghezza: largo.
3. Aliquota mezzi embrione 40 ml ciascuno in quattro 50 ml provette coniche. Mettere in ghiaccio.
4. Riscaldare 1 L di acqua in un becher 2 L su una piastra calda. Mantenere a 45 ° C. Aggiungere una siringa di ultrasuoni gel e PBS al becher per preriscaldare. Mantenere questa temperatura per monitoraggio con un termometro in ogni momento.
5. Mettere da parte dieci a dodici 1 ml siringhe e dieci a dodici 21 aghi G per l'iniezione di microbolle.

4. Procedura chirurgica

NOTA: Avere un assistente preparare le bolle (fase 5) mentre il chirurgo inizia la procedura chirurgica. Il protocollo qui descritto è stato adattato da Whiteley et al. ¹⁵

1. Raccogliere E16.5 E17.5 embrioni o dalla femmina incinta del mouse seguenti dislocazione cervicale.
   NOTA: Gli effetti dell'anestesia sugli embrioni non sono ancora stati studiati in dettaglio ^16. Metodi aggiuntivi, tra cui la decapitazione, può essere appropriato opzioni per il sacrificio dei topi in gravidanza.
   1. Taglio aperto l'addome per rivelare l'utero e gli embrioni. Accuratamente e rapidamente rimuovere l'utero tagliando le punte delle corna uterine (recisione dei vasi ovarici e uterini) e recidere alla vagina e vescica.
   2. Utilizzando pinze scheggia, trasferire l'utero in una provetta da 40 ml di ghiacciata embrione supporti più rapidamente possibile senza danneggiare gli embrioni. Eliminare la carcassa del mouse.
2. Spostare al microscopio e stage. Deposito dell'utero in un piatto di coltura cellulare 100 x 20 mm. Trasferire l'utero in un nuovo piatto pieno di 50 ml di mezzi di embrioni freschi.
3. Utilizzando sterilizzati (70% di etanolo a spruzzo) pinza sottile, strappare delicatamente e tirare via le membrane esterne dell'utero partire da una estremità. Esporre il decidua placentare, parietale sacco vitellino e la membrana di Reichert per separare e rimuovere dal sottostante viscerale sacco vitellino.
4. Sezionare gli embrioni uno per uno, mantenendo la y visceralesac olk intatti e movimentazione la placenta più delicatamente possibile ^17. Fare attenzione ad evitare la rottura del sacco vitellino, come gli embrioni pop fuori immediatamente.
   1. Utilizzare il cucchiaio forato per spostare gli embrioni di un altro piatto tenuti in ghiaccio con i media embrione fresco. Mantenere gli embrioni refrigerate fino a quando necessario. Modificare i media nel piatto embrione ogni 1-1,5 ore. Con queste condizioni embrioni sono vitali per un massimo di 4 ore dopo la dissezione.

5. microbolle Preparazione

NOTA: eseguire l'imaging molecolare con ultrasuoni con entrambe le microbolle mirati e non mirati. Un singolo esperimento può richiedere fino a 3 fiale separate di microbolle: microbolle i) anticorpo mirato microbolle, ii) l'anticorpo controllo isotipico mirati e iii) microbolle non mirati. L'agente di contrasto si presenta come una polvere secca antigelo e deve essere ricostituito con soluzione salina prima dell'iniezione. Ci sono ~ 2 x 10 ⁹ microbolle in ogni MicroB non mirativial ubble e ~ 8.8 x 10 ⁸ microbolle nei destinazione fiale pronte. Le microbolle sono stabili per un massimo di 3 ore dopo la ricostituzione.

1. Ricostituzione del target pronti Fiale
   NOTA: Esempi di bersaglio preparati pronti: endoglina microbolle mirati (MB _E, con topo biotinilato MJ 7/18 anticorpi di topo endoglin, in casa struttura ibridoma); fattore di crescita vascolare endoteliale recettore 2 (VEGFR2) microbolle mirati (MB _V, con biotina anti-topo CD309); topo isotipo anticorpi IgG ₂ di controllo mirati microbolle (MB _C, biotina topo IgG ₂ di controllo di targeting del mouse IgG2a).
   1. Diluire la soluzione di anticorpi (20 mg) in 1 ml (volume finale) di soluzione salina. Mantenere su ghiaccio.
   2. Riempire la siringa con 1 ml di soluzione fisiologica, rimuovendo tutte le bolle d'aria. Collegamento di un G 21 ago, iniettare la soluzione lentamente nel flaconcino di microbolle.
   3. Lentamente ritirare lo stantuffo, eliminando 1 ml di aria, ed estrarre l'ago. Delicatamenteagitate. Lasciate riposare 5 minuti in ghiaccio.
      NOTA: microbolle ultrasuoni possono essere distrutti in ambienti ad alta pressione.
   4. Dopo il tempo trascorso, riempire una nuova siringa con la diluizione degli anticorpi e aggiungere alla fiala appropriata. Agitare delicatamente. Lasciate che la miscela (ora 2 ml) riposare per 10 min. Mantenere su ghiaccio. Assumendo completa coniugazione di superficie, il numero medio di ligando legato per le microbolle è di circa ¹⁸ 7.600 ligandi / micron ^2.
2. Ricostituzione di non mirato Fiale
   1. Riempire la siringa con 1 ml di soluzione fisiologica, rimuovendo tutte le bolle d'aria. Collegamento di un G 21 ago, iniettare la soluzione lentamente nel flaconcino di microbolle.
   2. Lentamente ritirare lo stantuffo, eliminando 1 ml di aria, ed estrarre l'ago. Agitare delicatamente. Lasciate riposare 5 min. Aggiungere un ulteriore 1 ml di soluzione salina, come descritto sopra. Agitare delicatamente e lasciare riposare 10 minuti in ghiaccio.
3. Coulter Conteggio
   1. Agitare delicatamente il flacone microbolle desiderato e disegnare ~50 microlitri della soluzione in una siringa da 1 ml con l'ago 21 G. Iniettare le microbolle in un 2 ml provetta vuota.
   2. Pipettare un campione di 10 microlitri di microbolle soluzione madre in 10 ml di diluente.
   3. Dopo miscelazione delicata, di valutare le distribuzioni di concentrazione e le dimensioni della popolazione di microbolle utilizzando conteggio Coltro (vedi elenco dei materiali). Contare un minimo di tre misurazioni 50 microlitri (per campione flaconcino) utilizzando un diaframma 30 micron.
4. Le microbolle Preparazione per iniezione
   NOTA: L'assistente esegue questo passaggio quando 'iniezione di microbolle in embrioni' (punto 6) è iniziata. Ogni embrione viene iniettato una volta, con il tipo di microbolle scelto per ogni iniezione per selezionare casualmente dal assistente tale che tutti i tipi di microbolle sono distribuiti uniformemente in tutta la procedura ma dato in un ordine casuale. Assicurarsi che il chirurgo è cieco al tipo di bolla viene iniettato.
   1. Determinare the volume della soluzione madre bolla richiesto per produrre una concentrazione finale di 1 x 10 ⁸ MB ​​/ ml in un volume di 400 microlitri (calcolare il volume utilizzando le concentrazioni misurate in archivi 5.3.3). Aliquotare il corrispondente volume di soluzione salina in una provetta vuota.
   2. Agitare delicatamente il flaconcino microbolle selezionato e disegnare un volume in eccesso (~ 50 microlitri maggiore di quello calcolato sopra) della soluzione in una siringa da 1 ml con l'ago 21 G. Iniettare le microbolle in una provetta vuota.
   3. Pipettare il volume necessario di microbolle soluzione madre e aggiungere alla aliquota di soluzione salina. Mescolare agitando delicatamente con la punta della pipetta.
   4. Aspirare la soluzione di microbolle diluita in una siringa pulita utilizzando l'ago 21 G. Rimuovere l'ago, eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa e collegare il luer e il tubo. Lentamente spingere la soluzione alla fine del processo tubo sicuro non generare eventuali bolle d'aria.
   5. Inserire il Syringe in una pompa a siringa per infusione impostato per erogare le microbolle ad una velocità di 20 ml / min per un volume totale di 20 microlitri. Attaccare un ago di vetro tirato alla estremità del tubo. Spostare la pompa vicino alla fase di iniezione.

6. Iniezione di microbolle in embrioni

1. Casualmente selezionare e rimuovere (con il cucchiaio forato) un embrione dal piatto mezzi refrigerati. Mettere nel piatto dissezione situato sul palco ultrasuoni sotto lo stereoscopio e rimuovere il sacco vitellino e membrane amniotiche con le belle pinze, taglio / strappo dal lato che appare almeno vascolarizzato (lato antimesometrial). Questo è più facilmente ottenibile dalla perforazione un'area adiacente alla regione della testa.
   1. Tagliare sufficiente per rimuovere l'embrione all'interno, ma non di più. Stabilizzare i piatti dissezione utilizzando piccoli pezzi di plastilina.
2. Manovrare delicatamente la sacca da tutto l'embrione. Posizionare l'embrione su un lato, con la placenta evasi ombelicali di fronte. Utilizzando i perni di insetti, fissare il sacco vitellino (4 pin consigliato) e bordi della placenta se necessario per apporre sul posto. Evitare grossi vasi.
3. Lavare l'embrione con pre-riscaldato a 45 ° C fino a quando l'embrione PBS ravviva. Identificare la vena ombelicale e la sua rete vascolare associata. Posizionare il piatto in modo che l'iniezione può essere fatto comodamente.
   NOTA: Una volta riscaldato, il sangue nell'embrione inizierà a fluire, visibilmente pompaggio nell'arteria ombelicale. Quando il flusso inizia prima, le vene sarà un rosso brillante, con il sangue in entrambe le navi che appare rapidamente identici. I rami derivanti dalla vena ombelicale solito sovrappongono quelli ombelicale sulla superficie placentare.
4. Una volta che l'embrione ha fatto rivivere, coprirla (ma non la placenta) con il gel US pre-riscaldato, avendo cura di rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria (utilizzando le belle pinze) provenienti da tutto il embrione. Riempire il piatto con pre-riscaldato PBS.
   NOTA: Tenete d'occhio il livello di solutiin in siringhe PBS e gel e aggiungere siringhe backup bicchiere di riscaldamento, se necessario.
5. Montare l'ago di vetro su una grande palla di plastilina sul bordo del piatto dissezione e inserire l'estremità ago nel PBS. La scelta di una vena sulla superficie corionica del disco placentare, come lontano dal ramo principale ragionevole, tagliare la punta di dimensione con le forbici. Injection è più facile se la punta è tagliato con una leggera angolazione. Rimuovere eventuali bordi frastagliati del vetro con il bordo delle forbici primavera.
6. Utilizzando la pompa a siringa, iniettare lentamente la soluzione microbolle a 20 microlitri / min nel ago di vetro fino a quando tutta l'aria viene espulsa dalla punta dell'ago e microbolle può essere visto di fluire liberamente nel PBS. Fermare la pompa e ripristinare un volume di iniezione di 20 ml. Non lasciare entrare aria sistema vascolare dell'embrione durante l'iniezione.
7. Inserire la punta dell'ago bicchiere delicatamente in una delle vene nella placenta e assicurarsi che sia immobile. Scivoli via il steretesta oscope e la posizione del trasduttore sopra l'embrione. Avviare imaging.

7. Ultrasound Imaging Molecolare

NOTA: Utilizzando le condizioni di contrasto di imaging non lineari stabilite in precedenza, posizionare il trasduttore in modo che l'embrione si trova in modo uniforme tra i fuochi a 6 e 10 mm. Una volta posizionato, avviare il bolo delle microbolle. Quando l'iniezione è completa, avviare il timer.

1. Perfusion Imaging
   1. Assicurarsi che il numero massimo di fotogrammi per la modalità di contrasto non lineare viene selezionato premendo il tasto 'di gestione di studio' e cliccando sulla scheda 'Preferenze "nella parte superiore del browser studio. Selezionare la casella appropriata nella finestra 'Preferenze'.
   2. Regolare le impostazioni di imaging avviando immagini non lineare. Premere il pulsante 'modalità di contrasto' sul pannello di controllo. Affinare il guadagno 2D regolando il 'guadagno & #8217; quadrante a 30 dB, ridurre la potenza di 4% con il 'potere' dial, diminuire la frequenza di 1 Hz utilizzando la 'frequenza' dial e impostare la larghezza del fascio (in basso a sinistra) al largo usando il rullo / mouse.
      NOTA: Tutti i comandi sono situati sul pannello di controllo del sistema a ultrasuoni.
   3. Cattura l'intero wash-in e dissipazione del bolo microbolle registrando un ciclo cine 20 minuti a un frame rate di 1 Hz. Premere scan / freeze per avviare l'acquisizione dei dati.
   4. Una volta che l'intera sequenza di immagini è stata catturata, premere il tasto 'negozio cine' situato sul pannello di controllo per salvare la sequenza di immagini nel buffer del sistema. Il sistema crea un cine loop di data-timbrata delle lineari dati del modello di contrasto acquisiti.
2. Mirata microbolle Imaging
   1. Sotto 'Preferenze', impostare il tempo di scatto di 0,1 sec. Impostare i parametri di imaging appropriati utilizzando i controlli desCribed sopra (7.1.2.).
   2. Avviare l'imaging contrasto non lineare premendo il pulsante 'modalità di contrasto' sul pannello di controllo. Verificare l'embrione è situato correttamente sotto il trasduttore e che il flusso del mezzo di contrasto microbolle attraverso l'embrione è visibile l'immagine in modalità di contrasto non lineare.
   3. Per valutare vincolante durante gli studi di imaging molecolare embrionali microbolle mirato, permettono le microbolle di circolare indisturbato per 3 min e 40 sec dopo il completamento dell'iniezione. Questa volta è consentire mantenimento delle microbolle circolanti. Premere 'scan / freeze' per fermare l'imaging in questo periodo.
   4. A 3 min e 40 sec, imaging curriculum per confermare che l'embrione è ancora visibile, è adeguatamente coperto con PBS, e che microbolle continuano a circolare. Premere 'scan / freeze' per avviare l'imaging.
   5. Acquisire la sequenza di interruzione / rifornimento a 3 min e 50 sec dopo l'iniezione registrando un 'pre-distruzioneSequenza risposta acustica ne 'a 29 Hz. Premere 'scan / freeze' per avviare l'acquisizione dei dati. A 4 minuti dopo l'iniezione ^18,19, avviare un 0.1 sec ad alta frequenza acustica raffica. Premere il pulsante 'raffica' di attuare una raffica.
   6. Continuare a registrare fotogrammi per il resto della sequenza (fino a quando la linea di buffer è pieno) e salvare il ciclo cine premendo 'archivio cine'.
   7. Raccogliere un ciclo cine supplementare di microbolle circolanti. Questo successiva sequenza di imaging 'post-distruzione' si assume che contenere solo circolanti segnali bolla che hanno rifornito la trave. Premere 'scan / freeze' per avviare l'imaging e 'negozio cine' per raccogliere le immagini.
   8. Etichettare i loop cine dopo l'imaging ogni embrione. Premere 'gestione studio', evidenziare il file usando il rullo e la 'selezionare', premere il pulsante 'etichetta immagine' e il nome appropriato.

8. Gestione di embrioni dopo iniezione

1. Immagini Post, spostare il trasduttore, sbloccare l'embrione e l'eutanasia (via decapitazione, dislocazione cervicale, anidride carbonica asfissia, o anestesia seguita da congelamento rapido o fissazione) come desiderato.
2. Per ogni successiva iniezione embrione un piatto dissezione, aghi, siringhe e tubi segmento fresco deve essere utilizzato, con la preparazione del prossimo gruppo di iniezione microbolle soluzione che si svolgono durante la dissezione e la rinascita.
3. Salva campioni di tessuto (ad esempio, la coda, cervello) per analisi supplementari (ad esempio, la genotipizzazione determinata mediante analisi PCR di coda DNA isolato, lacZ colorazione, o misure semi-quantitative di espressione biomarker con macchie occidentali ^21).

Risultati

L'iniezione di mezzi di contrasto ad ultrasuoni nella ex utero embrioni di topo dipende l'isolamento successo viventi, embrioni fase tardiva gestazionale dall'utero e manutenzione della redditività nel corso dell'iniezione e relativo ecografica. Una volta che l'embrione è stato esteriorizzato e posizionato, come mostrato in Figura 1, è possibile accurata iniezione di mezzo di contrasto nel sistema vascolare embrionale. Una immagine ecografica B-mode tipiche di un embrione...

Discussione

Mezzi di contrasto ecografici sono state iniettate in fase tardo-embrioni di topo di gestazione e le immagini di contrasto non lineari sono stati acquisiti per misurare parametri di perfusione e mirato microbolle vincolanti. Immagini di successo di microbolle all'interno di vasi embrionali era dipendente da una serie di fattori, il primo embrione di essere redditività. Tutte le attrezzature ed apparecchi sono stati preparati in anticipo in modo da minimizzare il tempo necessario per l'isolamento di embrioni dal...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08