Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Ultraschall Mikrobläschenkontrastmittel in Wohn-, isoliert späten Schwangerschaftsphase murine Embryonen zu injizieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Perfusion Parameter und vaskulärer molekularer Marker innerhalb des Embryos mit kontrastverstärkten hochfrequenten Ultraschall-Bildgebung.

Zusammenfassung

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Einleitung

Die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung nutzt Mikrobläschenkontrastmittel sichtbar zu machen und kennzeichnen das Gefäßumgebung. Diese Agenten ermöglichen die nichtinvasive Beurteilung der Mikrozirkulation, Vaskularität und Herz-Kreislauf-Funktion. Zusätzlich kann eine Modifikation der Blasenoberfläche in gezielter Mikrobläschen führen Bindung an Endothelzellen Biomarkern in der präklinischen Anwendungen der Angiogenese, Arteriosklerose und Entzündung ^1,2 Herstellung Molekularultraschallbildgebungs vaskulärer Ereignisse möglich demonstriert. Kontrastverstärkten Ultraschall kann daher verwendet werden, um die komplexen und vielfältigen Umgebungen, die gesunden und erkrankten Gefäßzustände ^3-5 beeinflussen zu identifizieren.

In den vergangenen Jahren hat das Interesse an der Nützlichkeit der Mikroblasenabbildungs ​​der vielseitigen Mausembryo Modell erweitert. Als ein Modell der Entwicklung von Säugetieren, die Einführung von Mikroblasen in der embryonalen Gefäßsystem erhöht physiologischenStudie der Entwicklungskreislauf-System (zB Blutfluss, Herzzeitvolumen) und in Fällen von transgenen und gezielte Mutante Mausmodellen der Herzerkrankungen ^6,7, kann Einblicke in die genetischen Faktoren Herz-Kreislauf-Funktion zu ändern ergeben. Tatsächlich Analysen von embryonalen Gehirngefäß quantitative und qualitative 2D sind bereits verwirklicht ^8. Weiterhin stellt die Mausembryo als ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Bindung von Zielmikrogefäßmarker in vivo. Bartelle et al. ^9, zum Beispiel, haben Avidin Mikroblasen in Embryo Herzkammern eingeführt zu beurteilen, zielgerichtete Bindung in Biotag-BirA transgenen Embryonen und untersuchen Gefäßanatomie. Eine wichtige Benchmark bei der Übersetzung dieser Technik in die Klinik - Die Erzeugung von heterozygote und homozygote Maus-Modelle können auch als Ersatz für die Tumor-Modell-Studien mit dem Ziel, die quantitative Natur der molekularen Ultraschall definieren verwendet werden.

Mikroblasen werden am häufigsten an den embryonalen Kreislauf über intrakardiale Injektionen in einzelnen Embryos durch einen Bauchschnitt ^8-10 ausgesetzt eingeführt. In utero Injektionen, jedoch mit einer Reihe von Herausforderungen. Dazu gehören Injektion Führung, die Notwendigkeit, die Bewegung in der Mutter und exteriorisierten Embryo zu begegnen, die Aufrechterhaltung der hämodynamischen Lebensfähigkeit in der Mutter und außen gelegt Embryonen Bewältigung langfristigen Auswirkungen der Narkose und Komplikationen durch Blutungen ^11. Daher ist das Ziel der Untersuchung war es, eine Technik zum Injizieren von Mikroblasen in isolierte Lebensspätstadium Embryonen ¹² zu entwickeln. Diese Option bietet mehr Freiheit hinsichtlich der Einspritzsteuerung und die Positionierung, die Reproduzierbarkeit der Bildebene ohne Hindernis, und vereinfachte Bildanalyse und Quantifizierung.

In der vorliegenden Studie haben wir in lebende Mäuse-Embryonen fo skizzieren ein neues Verfahren für die Injektion von Mikrobläschenr die Zwecke der Untersuchung von Mikrobläschen Kinetik und des Studiums gezielt Mikroblasen-Bindung an endogene endothelialen Oberflächenmarker. Nicht-lineare Kontrast spezifischen Ultraschall-Bildgebung wird verwendet, um eine Reihe von Grund Perfusionsparameter einschließlich Spitzenverstärkung (PE), Wasch in Rate und Zeit (TTP) in isolierten E17.5 Embryonen Spitze messen. Wir zeigen auch die Wirksamkeit des Embryos Modell zur Bewertung der quantitativen Natur der Molekular Ultraschall in einem embryonalen Endoglin Funktionsverlust transgenes Mausmodell, in dem Endoglin ist ein klinisch relevanten Ziel aufgrund seiner hohen Expression in vaskulären Endothelzellen an Stellen aktiver Angiogenese ¹³ . Die Haftung der Endoglin-bezogene (MB _E), Ratte Isotyp IgG ₂ Steuer (MB _C) und ungezielte (MB _U) Mikroblasen in heterozygote Endoglin (Eng ^+/-) und homozygot Endoglin (Eng ^{+ / +)} exprimieren Embryonen untersucht. Analyse der zielBinding zeigt, dass molekulare Ultraschall in der Lage, die Unterscheidung zwischen Endoglin Genotypen und beziehen Rezeptordichten quantifizierbare molekulare Ultraschall Ebenen ist.

Protokoll

HINWEIS: Die in dieser Studie durchgeführt experimentellen Verfahren wurden von der Animal Care Committee bei Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada) zugelassen. Die Verfahren für die humane Behandlung von Tieren muss jederzeit eingehalten werden. Es wird angenommen, daß der Prüfer in den Grundbetrieb eines Ultraschall-Bilderzeugungssystem ausgebildet. Dieses Protokoll funktioniert am besten mit zwei Personen.

1. Tiermodelle

1. Mate-CD-1 männlich und weiblich Mus musculus zu Wildtyp-Embryonen zu Perfusionsstudien erhalten.
2. Für die molekulare Bildgebung Studien generieren Eng +/- Mäusen durch homologe Rekombination mit embryonalen Stammzellen von 129 / Ola Ursprungs im Sinne der Bourdeau et al. ¹⁴ beschrieben.
   1. Rückkreuzung B6- Eng ^+/- Mäusen, freundlich von Dr. Michelle Letarte erworben, um das CD-1 Hintergrund. Verwendung Eng ^+/- CD-1 gekreuzt Embryonen, sowie deren Eng ^{+ / +} littermate controls. Kamerad die Mäuse inszeniert Embryonen zu produzieren.

2. Versuchsvorbereitung

1. Initiieren Paarung von Mäusen und überprüfen Stecker täglich. Embryonaltag 0,5 als Mittag des Tages ein Vaginalpfropf beobachtet definiert ist.
2. Bereiten Embryomedium durch Zugabe von 50 ml fötalem Rinderserum, 5 ml 1 M HEPES und 5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin, 10.000 & mgr; g Streptomycin) zu 500 ml nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt (4.500 mg / L). Wickeln Sie die Flasche in Folie und halten gekühlt bei 4 ° C.
3. Centrifuge klar Ultraschall-Gel in 50 ml konische Röhrchen bei 140 g für 20 min. Zeichnen Gel in die 30-ml-Spritzen. Füllen Sie zusätzliche (markiert) 30 ml Spritzen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und beiseite stellen. Ein Wurf von Embryonen werden in der Regel verlangen, zwischen 2-3 Spritzen Ultraschallgel und 4 Spritzen von PBS.
4. Ziehen Sie ca. 30 Glasnadeln und sanft befestigen auf einen Streifen aus Plastilinin einer 100 x 20 mm Zellkulturschale. Dies stellt sicher, dass die Nadeln getrennt und während der Handhabung sicher. Mit einem Glasmagnet, verwenden Sie die folgenden Einstellungen auf 1 x 90 mm Glaskapillaren mit Filament: Heizung 77, Sub-Magnet 55, Hauptmagnet 70.
5. Bereiten zehn vor zwölf Dissektion Platten (genug, um jedem Embryo innerhalb eines Wurfs zu gewährleisten wird eine eigene Schale erhalten), unter Verwendung einer 1: 8 Volumenverhältnis von Härter zur Basis. Pour 40 ml Base in ein konisches 50 ml-Röhrchen. Fügen Sie 5-6 ml Härter und rühren Sie mit Holzstab.
   1. Gieße in 60 x 15 mm-Kulturschalen, Füllen jeder auf etwa die Hälfte. Stehen lassen O / N eingestellt.
6. Befestigen weiblichen Luer-Komponenten 400 mm lange Stücke von Polyvinylchlorid (PVC) Rohrleitung (Innendurchmesser: 0,79 mm). Der Schlauch muss von der Spritzenpumpe zum Ultraschall Bühne bequem zu erreichen.

3. Versuchsaufbau

1. Ordnen Sie die Imaging-Plattform unter dem Operationsmikroskop mit einem 3D-Motor und lineare Anordnung 21 MHz Wandlers.
   1. Richten Sie die Plattform, so dass die Schienenmontage ist auf der linken Seite, mit der Bühne direkt unter dem Mikroskop positioniert.
   2. Befestigen des 3D Motor mit dem Kugelgelenk der Verlängerungsarm der Plattform. Schrauben Sie den Schnellspanner nach der Wandlerklemme in die Schnellwechselhalterung am Motor nach vorne, und positionieren Sie den Schallkopf in der Klemme, die Befestigung der Verriegelung.
   3. Sichern Sie den Schallkopfstecker im aktiven Port auf der Vorderseite des Wagens. Schalten Sie das Gerät ein.
2. Initiieren Sie die 21-MHz-Ultraschallwandler, die Auswahl der "Kardiologie" Einstellung für die molekulare Bildgebung Studien und "allgemeine" für Perfusionsstudien. Umschalt alle zeitabhängigen Verstärkungskompensation Schieberegler, um die genaue Mittelstellung. Für "Contrast Mode ', stellen Sie die folgenden Parameter ein: Frequenz: 18 MHz, Sendeleistung: 4% (0,39 MPa), Kontrastverstärkung: 30 dB, Schwerpunkte: 6 und 10 mm, Kontrastmodus: Nichtlineare, Burst-Zeit: 100% bei 0,1sec, Öffnungswinkel: Weitwinkel.
3. Aliquoten 40 ml Embryo Medien jeweils in vier 50 ml konischen Röhrchen. Zeigen auf Eis.
4. Erhitze 1 l Wasser in einem 2 l Becherglas auf einer Heizplatte. Zu halten, bei 45 ° C. Fügen Sie eine Spritze Ultraschallgel und PBS in den Becher zu vorzuwärmen. Diese Temperatur wird durch die Überwachung der mit einem Thermometer zu allen Zeiten.
5. Beiseite zehn vor zwölf 1 ml Spritzen und zehn Minuten vor zwölf 21 G Nadeln für die Injektion von Mikrobläschen gesetzt.

4. Chirurgische Verfahren

ANMERKUNG: Halten Sie ein Assistent bereiten die Blasen (Stufe 5), während der Chirurg beginnt den chirurgischen Eingriff. Das hier beschriebene Protokoll wurde von Whiteley et al angepasst. ¹⁵

1. Sammeln E16.5 E17.5 Embryonen oder von der schwangeren weiblichen Maus nach Genickbruch.
   HINWEIS: Die Auswirkungen der Narkose an Embryonen sind noch nicht im Detail ¹⁶ untersucht. Weitere Methoden, darunter die Enthauptung, so können geeignete op seingungen für die Opfer der schwangeren Mäusen.
   1. Schneiden Sie den Bauch, um die Gebärmutter und Embryonen zu offenbaren. Sorgfältig und schnell entfernen die Gebärmutter durch Abschneiden an den Spitzen der Uterushörner (Durchtrennen der Eierstock- und Gebärmuttergefäße) und Durchtrennen an der Vagina und Blase.
   2. Mit Splitterpinzette, Transfer in die Gebärmutter zu einem Rohr von 40 ml eiskaltem Embryo Medien so schnell wie möglich, ohne die Embryonen. Entsorgen Sie die Maus Karkasse.
2. Sie umziehen, um Mikroskop und Bühne. Zahlen Sie die Gebärmutter in einen 100 x 20 mm Zellkulturschale. Übertragen Sie die Gebärmutter in eine neue Schale mit 50 ml frisch Embryo Medium gefüllt.
3. Mit sterilisiert (70% Ethanol Spray) feinen Pinzette vorsichtig reißen und ziehen weg die äußeren Membranen der Gebärmutter beginnt an einem Ende. Setzen Sie das Plazenta-Dezidua, parietalen Dottersack und Reichert-Membran zu trennen und aus der zugrunde liegenden viszeralen Dottersack zu entfernen.
4. Sezieren die Embryonen eine nach der anderen, wobei die Eingeweide yOlk Säcke intakt und der Handhabung der Plazenta so schonend wie möglich ^17. Achten Sie darauf, Bruch der Dottersack zu vermeiden, da die Embryonen springt heraus sofort.
   1. Verwenden Sie den Schaumlöffel, um die Embryonen zu einem anderen Gericht auf Eis mit frischen Embryo Medien gehalten zu bewegen. Halten Sie die Embryonen gekühlt, bis sie benötigt. Ändern Sie die Medien im Embryo Gericht jeden 1-1,5 Std. Mit diesen Bedingungen Embryos lebensfähig sind für bis zu 4 h nach der Sektion.

5. Mikroblasen Vorbereitung

HINWEIS: Führen Sie die molekulare Bildgebung mit Ultraschall mit beiden gezielte und ungezielte Mikroblasen. I) Antikörper gezielte Mikrobläschen, ii) Steuer Isotyp Antikörper gezielte Mikroblasen und iii) nicht zielgerichtete Mikrobläschen: Ein einziges Experiment kann bis zu 3 separate Ampullen von Mikroblasen benötigen. Das Kontrastmittel wird als Trockenpulver-freeze und müssen mit Kochsalzlösung vor der Injektion rekonstituiert werden. Es gibt ~ 2 x 10 ⁹ Mikroblasen in jedem ungezielte microbubble Fläschchen und ~ 8,8 x 10 ⁸ Mikrobläschen in den Ziel bereit Fläschchen. Die Mikrobläschen sind für bis zu 3 Stunden nach Rekonstitution stabil.

1. Rekonstitution der Ziel Bereit Vials
   ANMERKUNG: Beispiele für Ziel bereit Zubereitungen: Endoglin gezielte Mikrobläschen (MB _E, mit biotinyliertem Ratte MJ 7/18 Antikörper gegen Maus Endoglin; in Haus Hybridom Anlage); vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor Rezeptor 2 (VEGFR2) gezielte Mikrobläschen (MB _V, mit Biotin-Anti-Maus CD309); Ratte Isotyp IgG ₂ Kontrollantikörper gezielte Mikrobläschen (MB _C, Biotin Ratte Isotyp IgG ₂ Steuer Targeting Maus-IgG2a).
   1. Verdünnen Sie die Antikörperlösung (20 ug) in 1 ml (Endvolumen) Kochsalzlösung. Halten Sie auf dem Eis.
   2. Füllen Sie Spritze mit 1 ml Kochsalzlösung, die Beseitigung aller Luftblasen. Anbringen einer 21 G-Nadel, Injizieren Sie die Lösung langsam in die Mikrobläschen Fläschchen.
   3. Ziehen Sie langsam den Kolben, das Entfernen von 1 ml Luft, und die Nadel zurückzuziehen. Sanftagitieren. Lassen Sie Standplatz 5 min auf Eis.
      HINWEIS: Ultraschall Mikroblasen können unter Hochdruckumgebungen zerstört werden.
   4. Nach der abgelaufenen Zeit, füllen Sie eine neue Spritze mit Antikörperverdünnung und fügen Sie den entsprechenden Fläschchen. Vorsichtig geschwenkt. Lassen Sie die Mischung (jetzt 2 ml) stehen für 10 min. Halten Sie auf dem Eis. Unter Annahme einer vollständigen Oberflächen Konjugation, ist die durchschnittliche Zahl der gebundenen Liganden für die Mikroblasen ca. ¹⁸ 7.600 Liganden / & mgr; m ^2.
2. Rekonstitution der ungezielte Vials
   1. Füllen Sie Spritze mit 1 ml Kochsalzlösung, die Beseitigung aller Luftblasen. Anbringen einer 21 G-Nadel, Injizieren Sie die Lösung langsam in die Mikrobläschen Fläschchen.
   2. Ziehen Sie langsam den Kolben, das Entfernen von 1 ml Luft, und die Nadel zurückzuziehen. Vorsichtig geschwenkt. Lassen Sie Standplatz 5 min. Hinzufügen eines zusätzlichen 1 ml Kochsalzlösung, wie oben beschrieben. Vorsichtig geschwenkt und lassen Sie stehen 10 Minuten auf Eis.
3. Coulter Counting
   1. Leicht bewegen die gewünschte Mikroblasen-Fläschchen und ziehen ~50 ul der Lösung in eine 1 ml Spritze mit der 21G Nadel. Injizieren Sie die Mikrobläschen in einen leeren 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Pipettieren Sie 10 ul-Probe von Mikroblasen-Stammlösung in 10 ml Verdünnungsmittel.
   3. Nach vorsichtigem Mischen, bewerten die Konzentration und Größenverteilung der Mikroblasen-Bevölkerung durch die Verwendung Scharzählung (siehe Liste der Materialien). Zählen ein Minimum von drei 50 ul-Messungen (pro Ampulle Probe) unter Verwendung eines 30 & mgr; m Apertur.
4. Vorbereitung Microbubbles for Injection
   HINWEIS: Der Assistent führt Sie diesen Schritt, wenn "Die Injektion von Mikroblasen in Embryonen" (Schritt 6) begonnen wird. Jeder Embryo wird einmal eingespritzt wird, mit dem Typ der Mikrobläschen für jede Injektion gewählt, um nach dem Zufallsprinzip durch den Assistenten, so dass alle Arten von Mikroblasen gleichmäßig während des gesamten Verfahrens verteilt ist, sondern in zufälliger Reihenfolge angegeben gewählt werden. Stellen Sie sicher, der Chirurg ist blind für die Art von Blase injiziert.
   1. Bestimmen Sie, the Volumen erforderlich, um eine endgültige Konzentration von 1 x 10 ⁸ MB ​​/ ml in einem Volumen von 400 ul zu produzieren (berechnet die Lautstärke mit den Stammkonzentrationen in 5.3.3 gemessen) Aktienblase Lösung. Aliquot das entsprechende Volumen Kochsalzlösung in ein leeres Reaktionsgefäß.
   2. Leicht bewegen das ausgewählte Mikroblasen-Fläschchen und ziehen eine Überschussvolumen (~ 50 & mgr; größer als die oben berechneten) der Lösung in einer 1 ml Spritze mit dem 21 G-Nadel. Injizieren Sie die Mikrobläschen in einen leeren Reaktionsgefäß.
   3. Pipettieren Sie das notwendige Volumen der Mikroblasen-Stammlösung und fügen Sie die aliquote Menge Kochsalzlösung. Mischen durch Rühren vorsichtig mit der Spitze der Pipette.
   4. Zeichnen Sie die verdünnte Mikroblasen-Lösung in eine saubere Spritze mit dem 21 G-Nadel. Entfernen der Injektionsnadel, beseitigen alle Luftblasen aus der Spritze und befestigen Sie den Luer und Schläuche. Langsam schieben Sie die Lösung für das Ende des Schlauches darauf achten, dass keine Luftblasen zu erzeugen.
   5. Legen Sie die syringe in eine Spritze Infusionspumpe eingestellt, um die Mikrobläschen mit einer Rate von 20 ml / min mit einem Gesamtvolumen von 20 ul zu verzichten. Bringen Sie ein gezogen Glasnadel bis zum Ende des Schlauchs. Bewegen Sie die Pumpe in der Nähe der Einspritzphase.

6. Die Injektion von Mikroblasen in Embryonen

1. Nach dem Zufallsprinzip auswählen und entfernen (mit Lochlöffel) ein Embryo aus dem Kühlmedium Gericht. Platzieren Sie in Dissektion Gericht auf dem Ultraschall Bühne unter dem Stereoskop befindet und entfernen Sie den Dottersack und Amnionmembranen mit den feinen Pinzette, Schneiden / Reißen von der Seite, die am wenigsten mit Gefäßen erscheint (die antimesometrial Seite). Dies wird am einfachsten durch Durchstoßen einer Fläche benachbart zu dem Kopfbereich erzielt wird.
   1. Geschnitten genug, um die Embryos aus zu entfernen, aber nicht mehr. Stabilisierung der Dissektion Gerichte mit kleine Stücke aus Plastilin.
2. Manöver vorsichtig den Sack aus der ganzen Embryo. Positionieren Sie den Embryo auf der Seite, mit der Plazenta undNabelgefässe vor. Mit den Insekten Stifte, festzunageln den Dottersack (4 Pins empfohlen) und Kanten der Plazenta wie nötig, um an Ort und Stelle zu befestigen. Vermeiden großen Gefäße.
3. Waschen Sie den Embryo mit vorgewärmter 45 ° C PBS, bis der Embryo belebt. Identifizieren Sie die Nabelvene und die damit verbundenen Gefäßnetz. Positionieren Sie den Teller so, dass die Injektion kann bequem durchgeführt werden.
   HINWEIS: Sobald erwärmt wird Blut im Embryo zu fließen beginnen, sichtbar Pumpen in der Nabelarterie. Wenn beginnt Strömungs Zunächst werden die Adern a leuchtend rot, mit dem Blut in beide Behälter schnell identisch erscheinen. Die Äste, die aus der Nabelvene Regel überlagern, die von der Nabelarterie auf der Plazentaoberfläche.
4. Sobald der Embryo wieder, bedecken Sie es (aber nicht die Plazenta) mit vorgewärmter US-Gel, dass auf jeden Fall vorsichtig entfernen Sie alle Luftblasen (mit den feinen Pinzette) aus der ganzen Embryo. Füllen Sie die Schale mit vorgewärmten PBS.
   HINWEIS: Achten Sie auf die Höhe der solutiauf der PBS und Gel Spritzen und fügen Backup Spritzen an die Heizungs Becher nach Bedarf.
5. Montieren Sie die Glasnadel auf einem großen Ball aus Plastilin am Rande der Dissektion Gericht und führen Sie die Nadel Ende in die PBS. Die Wahl einer Vene an der Chorion-Oberfläche der Plazenta-Scheibe, so weit entfernt von der Hauptgeschäftsstelle als angemessen, schneiden Sie die Spitze der Größe mit einer Schere. Injektion ist am einfachsten, wenn die Spitze in einem leichten Winkel schneiden. Entfernen Sie alle scharfen Kanten des Glases an der Kante der Federschere.
6. Verwendung der Spritzenpumpe und injizieren die Mikrobläschenlösung bei 20 & mgr; l / min in die Glasnadel, bis die gesamte Luft aus der Nadelspitze ausgestoßen wird und Mikrobläschen zu erkennen, um frei in den PBS fließt. Stoppen der Pumpe und einem Injektionsvolumen von 20 ul zurückgesetzt. Lassen Sie keine Luft zum des Embryos Gefäßsystem während der Injektion ein.
7. Legen Sie die Glasnadelspitze sanft in eine der Venen in der Plazenta und sicherzustellen, dass es unbeweglich ist. Parallelverschiebung der Steroscope Kopf und Position der Wandler über dem Embryo. Initiieren Bildgebung.

7. Ultraschall Molekulare Bildgebung

HINWEIS: Mit Hilfe der Kontrastnichtlineare Abbildungsbedingungen zuvor einzustellen, setzen Sie den Schwinger so, dass der Embryo wird gleichmäßig zwischen den Brennpunkten bei 6 und 10 mm liegt. Einmal positioniert, starten Sie den Bolus-Injektion der Mikrobläschen. Wenn die Injektion abgeschlossen ist, starten Sie den Timer.

1. Perfusion Imaging
   1. Stellen Sie sicher, dass die maximale Anzahl der Bilder für nichtlineare Kontrastmodus wird durch Drücken der "Studienmanagement" wählen und auf die Registerkarte "Prefs" am oberen Rand der Studie Browser ausgewählt. Überprüfen Sie das entsprechende Kästchen im Fenster "Einstellungen".
   2. Passen Sie die Bildeinstellungen durch die Einleitung lineare Bildgebung. Drücken Sie die "Kontrastmodus-Taste auf dem Bedienfeld. Verfeinern Sie den 2D-Gewinn durch Anpassung der "Gewinn & #8217; wählen, um 30 dB, die Macht zu 4% zu senken mit dem "Power" zu wählen, verringern Sie die Frequenz auf 1 Hz unter Verwendung des "Frequenz" wählen und stellen Sie die Strahlbreite (links unten), um breite Verwendung der Rollerball / Maus.
      HINWEIS: Alle Steuerungen sind auf dem Bedienfeld des Ultraschall-Systems.
   3. Einfangen des gesamten Wasch in und Dissipation des Mikrobläschens Bolus mit einer Aufnahme 20 min Filmschleife mit einer Bildfrequenz von 1 Hz. Drücken Sie Scan / freeze, um die Datenerfassung zu starten.
   4. Sobald die vollständige Sequenz von Bildern eingefangen worden ist, drücken Sie die Taste "Cine-Speicher" auf dem Bedienfeld, um die Sequenz von Bildern in der Systempuffer zu speichern. Das System erstellt einen Datumsstempel versehen Kinoschleife der erworbenen nichtlineare Kontrastmodelldaten.
2. Gezielte Mikroblasen Imaging
   1. Unter "Prefs", stellen Sie den Burst-Zeit 0,1 s. Legen Sie die entsprechenden Aufnahmeparameter mit den Steuerelementen desoben cribed (7.1.2.).
   2. Initiieren nichtlineare Kontrastbildgebung durch Drücken der 'Kontrastmodus-Taste auf dem Bedienfeld. Sicherstellen, dass die Embryos richtig unter dem Wandler und dass die Strömung des Mikrobläschenkontrastmittels durch den Embryo in dem nichtlinearen Bildkontrast-Modus sichtbar entfernt.
   3. Gezielte Mikroblasen verbindlich während der Embryonalentwicklung der molekularen Bildgebung Studien zu bewerten, damit die Mikrobläschen für 3 min und 40 s nach Abschluss der Injektion zirkulieren ungestört. Dieses Mal ist die Beibehaltung der zirkulierenden Mikroblasen zu ermöglichen. Drücken Sie "Scan / einzufrieren", um Bildgebung während dieser Zeit zu stoppen.
   4. Bei 3 min und 40 sec, Lebenslauf Bildgebung, um zu bestätigen, dass der Embryo noch sichtbar ist, ausreichend mit PBS bedeckt, und dass Mikroblasen weiter zirkulieren. Drücken Sie "Scan / einzufrieren", um Imaging zu starten.
   5. Erwerben Sie die Störung / Nachschub Sequenz bei 3 Minuten und 50 Sekunden nach der Injektion durch die Aufnahme eines "Pre-Zerstörungtion "akustische Antwort-Sequenz mit 29 Hz. Drücken Sie "Scan / einzufrieren", um die Datenerfassung zu starten. Bei 4 min nach der Injektion ^18,19, starten Sie eine 0,1 s Hochfrequenz-Lautstärkespitzen. Drücken Sie die "Burst", um einen Ausbruch zu implementieren.
   6. Weiterhin Frames für den Rest der Sequenz aufzeichnen (bis der Puffer Zeile voll) und speichern Sie die Filmschleife mit 'Cine-Speicher'.
   7. Sammeln eine zusätzliche Filmschleife von zirkulierenden Mikroblasen. Das nachfolgende "Post-Zerstörung" Bildsequenz wird angenommen, dass nur umlaufende Blasensignale, die den Strahl wieder aufgefüllt sind, enthalten. Drücken Sie "Scan / freeze 'zu Bildgebung und" Cine-Shop "zu initiieren, um die Bilder zu sammeln.
   8. Beschriften Sie die Cine-Loops nach Abbilden jedes Embryo. Drücken Sie 'Studienmanagement ", markieren Sie die Datei mit Hilfe des Rollkugel und die" Option "-Taste, drücken Sie' Bild Label" und den Namen entsprechend.

8. Handhabung von Embryonen nach Injection

1. Beitrag Bildgebung, bewegen Sie den Wandler, unpin den Embryo und einschläfern (via Enthauptung, Genickbruch, Erstickung mit Kohlendioxid oder Anästhesie, gefolgt von schnellem Gefrieren oder Fixierung) wie gewünscht.
2. Für jede nachfolgende Embryo Injektion eine frische Präparation Gericht, Nadel, Spritze und Schlauchsegment verwendet werden, bei der Vorbereitung der nächsten Charge von Mikroblasen-Injektionslösung stattfindet beim Präparieren und Wiederbelebung.
3. Sparen Gewebeproben (zB Schwanz, Gehirn) für weitere Analysen (zB Genotypisierung mittels PCR-Analyse von Schwanz-DNA isoliert, LacZ-Färbung oder semi-quantitative Maßnahmen der Biomarker Ausdruck mit Western Blots ²¹ bestimmt).

Ergebnisse

Die Injektion von Ultraschallkontrastmitteln in ex utero Mausembryonen ist abhängig von der erfolgreichen Isolierung von lebenden spät Gestationsalter Embryonen aus dem Uterus und Wartung der Lebensfähigkeit im Verlauf der Injektion und ähnliche Ultraschallbildgebung. Nachdem der Embryo wurde nach außen verlagert und so positioniert, wie in Figur 1 gezeigt, ist eine sorgfältige Injektion von Kontrastmittel in den embryonalen Gefßsystems möglich. Eine typische B-Mode-Ultraschallbild eine...

Diskussion

Ultraschallkontrastmittel wurden in der Spätphase der Trächtigkeit Mausembryonen und nichtlineare Kontrastbilder injiziert wurden erworben, um die Perfusion Parameter zu messen und zielgerichtete Mikrobläschen verbindlich. Erfolgreiche Abbildung von Mikrobläschen in embryonalen Vaskulatur war abhängig von einer Reihe von Faktoren, wobei der erste Embryo Lebensfähigkeit. Die gesamte Ausrüstung und die Vorrichtung wurden im Voraus, um die Zeit für die Trennung von Embryonen aus dem Uterus zu Beginn der Einspritzun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08