En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

Resumen

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Resumen

Alto grado de cáncer de ovario seroso (HGSC), la causa de metástasis peritoneales generalizadas, sigue teniendo un muy mal pronóstico; menos del 30% de las mujeres están vivos 5 años después del diagnóstico. El epiplón es un sitio preferido de la formación de metástasis HGSC. A pesar de la importancia clínica de este microambiente, la contribución del tejido adiposo omental a la progresión del cáncer de ovario sigue siendo poco estudiada. Adiposo omental es inusual, ya que contiene estructuras conocidas como manchas lechosas, que se componen de B, T, y células NK, macrófagos, y células progenitoras que rodean nidos densos de vasculatura. Lechosas manchas juegan un papel clave en las funciones fisiológicas del epiplón, que son necesarios para la homeostasis peritoneal. Hemos demostrado que manchas lechosas también promueven el cáncer metastásico de ovario de la colonización adiposo peritoneal, un paso clave en el desarrollo de metástasis peritoneales. Aquí se describen los métodos que desarrollaron para evaluar y cuantificar manchas lechosas en poritoneal adiposo y estudiar su contribución funcional a célula de cáncer de ovario metastásico la colonización de los tejidos omental tanto in vivo como ex vivo. Estos enfoques son generalizables a modelos de ratón y líneas celulares adicional, permitiendo así que el estudio de la formación de metástasis de cáncer de ovario de localización inicial de las células a las estructuras mancha lechosa para el desarrollo de metástasis peritoneales generalizadas.

Introducción

A diferencia de la mayoría de los tumores sólidos, metástasis de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSC) se limitan a la cavidad peritoneal ^1. Por lo tanto, las terapias peritoneales eficaces potencialmente podrían controlar o erradicar HGSC. Actualmente, una aproximación terapéutica estándar es de citorreducción quirúrgica combinada con quimioterapia ^1.3. Desafortunadamente, la gran mayoría de los pacientes experimentan y sucumben a las complicaciones de la recurrencia de la enfermedad. Estas estadísticas deprimentes muestran la necesidad de mejorar la comprensión de la colonización metastásica, el proceso por el cual las células cancerosas para localizar, utilizar y proliferar dentro de los tejidos del huésped para formar metástasis ^2.

El epiplón es un sitio preferido de principios HGSC metástasis ^4-7. A diferencia de otros peritoneal adiposo, el tejido adiposo omental contiene estructuras inmunes inusuales conocidas como manchas lechosas, que contienen B, T y células NK y macrófagos, que desempeñan papeles clave en HomeOS peritonealesTasis ^8,9. Además de sus funciones fisiológicas, encontramos que manchas lechosas desempeñan un papel activo en el cáncer de ovario colonización metastásica ^4. En los ensayos de metástasis experimentales, SKOV3ip.1, CaOV3 y HeyA8 (humano) y ID8 (murino; C57BL / 6) células ováricas cancerosas rápidamente caseros para manchas lechosas, lo que sugiere que las células se están moviendo hacia un factor quimiotáctico secretada. Curiosamente, las células cancerosas no colonizan adiposo peritoneal que carecen de manchas lechosas (es decir, gonadales y grasa ^uterina) 4.

Con el fin de identificar los mecanismos que regulan la colonización mancha lechosa, hemos optimizado modelos de xenoinjerto que permiten la interrogación de eventos celulares y moleculares en el transcurso de tiempo de la colonización metastásica ^4. Una ventaja específica de los métodos descritos en este documento es su énfasis en la arquitectura y la función del tejido, lo que permite a los usuarios probar hipótesis en integrarse plenamente en vivo y modelos ex vivo de m^4,10 colonización etastatic. Al comparar la localización de células cancerosas y el crecimiento de los depósitos de grasa peritoneal que, o bien contienen o carecen de manchas lechosas, los investigadores pueden probar la contribución (s) relativa de los adipocitos y células dentro manchas lechosas a la presentación y el crecimiento progresivo de las células de cáncer de ovario en los tejidos fisiológicamente relevantes.

Protocolo

Todos los ratones fueron alojados, mantenidos y sacrificados de acuerdo con Animal Institucional de Cuidado y Uso Comisión (IACUC) directrices y bajo la supervisión de la Universidad de Centro de Recursos Animales de Chicago.

1. Los animales Preparación para Estudios Experimentales

1. Permitir que los animales se aclimaten a la nueva vivienda y medio ambiente, para recuperarse de los posibles efectos fisiológicos de transporte y manipulación.
   Nota: La siguiente técnica es aplicable a todas las cepas disponibles en el mercado de los ratones. El número de animales que se utilizarán para un experimento depende del diseño del estudio y se debe hacer con la consulta de un estadístico.

2. Identificación y aislamiento de peritoneales depósitos de grasa.

1. La eutanasia a los animales a través de CO ₂ sobredosis y un método físico secundario a confirmar la muerte.
2. Como cosecha depósitos de grasa peritoneal constituye la extracción de órganos internos (método secundario), make una incisión en la línea media cerca del papilas inguinal a través de la pared peritoneal para exponer los órganos internos (Figura 1a).
3. Para la grasa omental (OM), exponer el complejo omental / pancreática mediante la ampliación del bazo de la cavidad peritoneal con una pinza (Figura 1C). Suelte omento del páncreas y el bazo por el recorte de cerca todas las conexiones de tejido. Asegúrese de que cualquier tejido pancreático restante se escinde ^4.
4. Para la grasa gonadal (GF), utilizar pinzas para levantar la grasa gonadal que rodea los ovarios y los impuestos especiales cortando conexiones de tejido (Figura 1A superior righ t) ^4.
5. Para la grasa uterino (UF), utilizar pinzas para levantar la grasa uterino que rodea a los cuernos uterinos y los impuestos especiales cortando conexiones de tejido (Figura 1 abajo a la derecha) ^4.
6. Para la grasa mesentérica (MF), cortar la unión entre el intestino delgado y el píloro. El uso de fórceps para sujetar firmemente el extremo libreel intestino delgado, y poco a poco "piel" lejos de la grasa mesentérica. Suelte la grasa mesentérica de la raíz mesentérica con unas tijeras de disección (Figura 1A inferior izquierda) ^4.
7. Para el Fat esplenoportal (SF), levantar el extremo distal del bazo utilizando pinzas para exponer la banda delgada de tejido graso que conecta el hilio del bazo para el páncreas. Extirpar la grasa esplenoportal por primera liberándolo del páncreas, y luego, con cuidado disección del bazo (Figura 1B) ^4.

3. Vía Punto de Identificación Utilizando Giemsa tinción

1. Omentos Impuestos Especiales (consulte el paso 2.3) a partir de ratones C57BL / 6 y fijar en el 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 16 horas (O / N).
2. Para parafina del tejido fijo, elegir un molde que es apropiado para el tamaño del tejido. Verter parafina fundida desde el depósito de parafina para llenar el molde. Abra el casete y el uso de calor paraceps, transferir el tejido en el molde.
   1. Orientar cuidadosamente los tejidos durante la incrustación de parafina para producir secciones longitudinales. Coloque el casete de tejido marcado sobre la moldura y presione firmemente en su lugar. Deje que el molde se enfríe durante al menos 30 minutos.
3. Cortar secciones de serie (4 micras de espesor) de la parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) bloque de tejido. Coloque una diapositiva prefiltrado en las secciones como la cinta de tejido se desprende del bloque de parafina.
4. En serie sección de todo el epiplón; recoger y manchar cada tercera sección para Giemsa (consulte 3.6). Deje que el portaobjetos de vidrio con las secciones se sequen al aire, preferiblemente O / N a temperatura ambiente. Diapositivas secas están listos para la fijación. Manchar la primera sección de hematoxilina y eosina para comparaciones con diapositivas Giemsa manchadas.
5. Desparafinar las diapositivas por dos incubaciones secuenciales 5 min en xilenos. Rehidrate diapositivas por dos incubaciones secuenciales en el siguiente: etanol 100%, etanol al 95%, y, finalmente, pulse water.
   1. Tome las precauciones adecuadas para evitar las diapositivas de secado. Realice todos los pasos a TA.
6. Completamente sumergir los portaobjetos en un tarro Coplin que contenía solución de Giemsa al 5% (w / v preparado en agua del grifo) y se incuba durante 4 min a TA. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo durante 60 segundos, aire seco y montar con cubreobjetos utilizando medios de montaje.
7. Imagen de las diapositivas teñidas utilizando un escáner de diapositivas entera y el proceso con el software del fabricante. Cuantificar el volumen mancha lechosa en secciones epiplón teñidas con Giemsa utilizando el software ImageJ ^4.

4. Propagación y Preparación de las células del cáncer ovárico para los estudios in vivo y ex vivo

1. Pre-caliente 15 ml de medio de crecimiento celular a 37 ° C en un baño de calor. Preparar un tejido tamaño adecuado cultivo en matraz (por ejemplo, 75 cm de área ² de superficie) por medio del etiquetado con el nombre de la línea celular, número de pases, la fecha y la persona que preparó la acción congelada, y la fechay persona que está descongelando / placas las células.
   Nota: En los estudios de la metástasis dicha información detallada es crucial, ya que la fecha de congelación abajo y número de pases puede afectar el fenotipo metastásico.
2. Mediante el entorno estéril de la campana de seguridad biológica, una pipeta 10 ml de medio en el matraz de cultivo T-75. Retirar un vial de células del sistema de nitrógeno líquido y se revise la etiqueta para confirmar el tipo de célula. Descongelar sólo un vial de células en un momento por calentamiento en baño de 37 ° C de calor.
3. Utilizando una técnica estéril, pipeta de 1x10 ⁶ células descongeladas en el frasco de cultivo. Colocar el matraz en la incubadora para permitir que las células se unan. Agite suavemente el frasco de un lado a otro para formar una suspensión celular uniforme.
   1. Colocar el frasco en cultivo de tejidos incubadora y se mantiene a 37 ° C en 5% de CO ₂ medio ambiente. Permitir que las células se adhieran O / N.
4. Aspirar los medios de comunicación, y reemplazar con medio de crecimiento pre-calentado fresco. Colocar el matraz en la incubadora y todocélulas ujo crezcan. Monitorear el crecimiento celular diariamente por inspección visual cada 2-3 días utilizando un microscopio invertido. Utilice técnicas de cultivo celular estándar a las células de paso al llegar a un 70-80% de confluencia.
   Nota: Para los ensayos experimentales cosechan las células a 70% de confluencia para asegurar que las células proliferan activamente.
5. Aspirar el medio de cultivo y enjuague con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Aspirar PBS y añadir 0,25% de tripsina / EDTA (de 2 a 3 ml de una superficie 75 cm ²⁾ e incubar 5 min a 37 ºC. Visualmente confirman que las células se han separado y añadir un volumen igual de medio de crecimiento, y la pipeta suavemente las células arriba y abajo para obtener una suspensión de células individuales.
   Nota: Es muy importante que el medio de crecimiento contiene suero, ya que inactiva la tripsina. Preparar al menos 2 a 4 veces más células que el número requerido para un experimento dado para compensar la pérdida de células durante los pasos subsiguientes
6. Determinar el porcentaje de células viables en elsuspensión a través de ensayo de exclusión con azul de tripano usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
   Nota: En este caso, utilice únicamente preparaciones de células en la que ≥ 96% de las células son viables.
7. Transferir la suspensión celular del matraz a un tubo cónico de 50 ml. Células de pellets por centrifugación de 5 min a 1.100 xg, ^a 4 ° C.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en PBS a una concentración de 2x10 ⁶ células por ml.

5. inyección intraperitoneal de células

Nota: En nuestros experimentos, los ratones se manejan en un flujo de aire laminar o gabinete de bioseguridad dentro de nuestras instalaciones de barrera con el fin de limitar el riesgo de exposición a agentes patógenos, el fin de demostrar esta técnica con claridad, se llevaron a cabo los procedimientos en el vídeo que acompaña en un laboratorio autorizado para el trabajo animal. Esta técnica en particular no requiere que los animales bajo anestesia. Bajo los protocolos aprobados, realice este technique en animales vivos. Utilice cepas adecuadas de ratones para este estudio. Por ejemplo: utilizar ratones desnudos atímicos inmunodeprimidos, para el estudio de las células del cáncer de ovario humano (SKOV3ip.1 y HeyA8) la colonización; utilizar inmunocompetentes C57BL / 6 ratones para el estudio de células de ratón de cáncer de ovario (ID8) la colonización.

1. Carga 500 l de la suspensión de células individuales en la jeringa y poner en el tapado de la aguja 25 G estéril. Esto reduce de cizallamiento de células antes de la inyección.
2. Escoja el ratón por la piel del cuello y sostenga la cola con la palma y el dedo índice y fijar la pata trasera izquierda entre el anular y el meñique (cuando el ratón está restringido con la mano izquierda).
   Nota: Para evitar los órganos abdominales traumatizantes, restringir el ratón también de modo que no se pueda mover durante la inyección.
3. Imagina una línea a través del abdomen justo por encima de las rodillas, y localizar un punto en el lado derecho del animal y cerca de la línea media. El punto de entrada es craneal y ligeramente medialdel último pezón.
   Nota: La inserción de la aguja en el lado derecho del ratón evita el ciego y reduce el riesgo de perforar el intestino ^11.
4. Insertar la aguja en la región lateral inferior del abdomen de los ratones a una profundidad de aproximadamente 0,5 cm. Tire hacia atrás el émbolo para confirmar que la aguja no ha penetrado un vaso sanguíneo u otros órganos peritoneales.
   1. Si se aspira cualquier fluido desechar la jeringa (y de la muestra) ^11. Un aspirado marrón verdoso o amarillo indica penetración de la aguja en los intestinos o la vejiga, respectivamente.
5. Inyectar la muestra usando presión suave y constante. Retire la aguja y volver el ratón a su jaula. No vuelva a tapar la jeringa antes de su eliminación en el contenedor de objetos punzantes.
6. Ratones Sacrificio vía _asfixia con CO2 y la extracción de órganos vitales en puntos específicos de tiempo después de la inyección.

6. Vía punto de colonización En vivo

1. Quantitación de la localización celular de cáncer de manchas lechosas mediante citometría de flujo
   1. Aislar los depósitos de grasa peritoneales de ratones (como se describe en el paso 2.3 a 2.7) inyectados con fluorescencia etiquetados células cancerosas y tejidos lugar inmediatos en helado de PBS.
      1. Para esta técnica en particular, el peso del partido todos los tejidos adiposos de grasa a epiplón. Tejidos de transferencia para separar tubos de 5 ml que contienen 1,5 ml de DMEM libre de suero y 0,1% (w / v) de albúmina de suero bovino. Tejidos piscina cosechadas de tres ratones independientes para asegurar un rendimiento suficiente de células para citometría de flujo.
   2. Tejidos de carne picada utilizando tijeras quirúrgicas y añadir 1,5 ml de DMEM libre de suero que contiene 0,4% (w / v) de colagenasa I. incubar la suspensión de tejido a 37 ° C durante 30 min con mezcla rotacional.
      1. Como paso opcional, desvincularse aún más el tejido por la masticación. En este caso, la transferencia de la suspensión de tejido-colagenasa a una bolsa de microstomacher, masticar durante 10 min a baja, girando la orientaciónde las bolsas después de 5 min.
   3. Filtrar las muestras a través de un filtro de malla de nylon (60 micras de poro) para eliminar los residuos más grandes. Recoger las células por medio de centrifugación a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar la fracción sobrenadante.
   4. Resuspender el sedimento de células en 100 l de PBS combinados con 900 l de tampón de lisis ACK y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Células centrifugar a 250 xg durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
      1. Resuspender el sedimento de células en 250 l de PBS enfriado con hielo. Filtrar las muestras a través de una malla de nylon de poro 60 micras para garantizar la suspensión de células individuales. Enjuague el filtro con 250 l de helado de PBS.
   5. Cuantificar el número de células marcadas fluorescentemente en la población usando un citómetro de flujo equipado con un láser de color verde amarillo 561-nm y A / 15 nm de paso de banda 585 nm filtro. Establezca la puerta para que las células tdTomato positivos basados ​​en el análisis de las células de los padres y / o controles negativos adecuados ^4.
2. La cuantificación de las metástasis microscópicas y macroscópicas
   1. En el punto final experimental deseada (s), aislar, e inmediatamente colocar los tejidos en los medios de fijación apropiado. Fijar las muestras más grandes, como las gónadas intactas, de útero, y los depósitos de grasa mesentérica en 10% de formalina tamponada neutra para 48 horas a 4 ° C. Fijar las muestras más pequeñas (y grasa omental esplenoportal, así como equivalentes de tejido uterino y de la grasa mesentérica) en 5% de formalina tamponada neutra al 4 ° C durante 2-16 h.
      1. Alternativamente, broche congelar tejidos colocándolos en un medio de congelación como octubre y colocar en una cantidad apropiada de nitrógeno líquido.
   2. Transferencia fija tejidos a etanol al 70% y se almacena a 4 ° C hasta su inclusión en parafina. Insertar y el tejido proceso como se describe en 3.2 y 3.3.
      1. Utilice la sección H & E manchado para evaluar los tejidos para la presencia o ausencia de metástasis microscópicas (es decir, grupos de 50 células). Confirme tél presencia de metástasis microscópicas por un método secundaria como una mancha de IHC para citoqueratina 8/18 para detectar células de cáncer de ovario.

7. Vía punto Colonización Ex Vivo

1. Establecimiento de condiciones de cultivo básicas ex vivo de órganos omental
   1. Coloque cada epiplón en un solo inserto de placa de cultivo y sitúa dentro de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de doce pocillos que contenía 500 l de DME media / F12 que contiene 20% de FCS. Mantener cultivos de órganos a 37 ° C en un entorno de _5% de CO2 durante 24 a 48 horas y / o puntos de tiempo adicionales. Usar tres omentos independiente (muestras por triplicado) para cada condición (por ejemplo, tipo de papel / punto de tiempo).
   2. Para confirmar la integridad de los tejidos en los puntos finales experimentales, fijar y muestras de proceso como se describe en el Paso 3. Contando sana frente adipocitos necróticas en secciones de H & E puede evaluar la integridad del tejido. Un mínimo de 120 células de ~Se requiere 5 muestras biológicas para formular un porcentaje de tejido vivo presente ^10.
   3. Para medir la función del tejido, lugar omentos (n = 3) en pocillos separados de una placa de 24 pocillos que contenía 500 l de DME media / F12 con 20% de FCS. Permita omentos para acondicionar los medios de comunicación a 37 ° C en un ambiente de _CO2 al 5% durante 24 horas, y luego eliminar 250 l para su uso en un IL-6 ELISA ensayo ^10.
2. Ex vivo de co-cultivo del epiplón ratón con células SKOV3ip.1-GFP
   1. Crecer y preparar células con fluorescencia etiquetados como se describe en la sección 4 y resuspender a una concentración de 2 × 10 ⁶ células por ml.
   2. Aplicar ~ 6 l del adhesivo tisular a la membrana de la inserción de la cultura y deje que se seque al aire. Lavar la membrana dos veces con agua estéril para eliminar cualquier exceso de adhesivo. Secar las membranas debajo de una campana laminar.
   3. Extirpar con cuidado el omentos y adjuntarlo a la memb recubierto con adhesivorane usando pinzas estériles. Permitir que el tejido se adhiera a la membrana durante 1 min antes de la adición de medios de comunicación. Añadir 500 l de la suspensión celular en la parte superior de cada epiplón en cada inserto de cultivo. Llene el área alrededor de la cámara transwell con 2,5 ml de DME / F-12 ^10.
   4. Incubar omentos con suspensión de células durante 6 horas a 37 ° C en un entorno de 5% de CO _2. Retire con cuidado y lavar el omentos con ~ 10 ml de PBS. Visualice fluorescentes focos de células cancerosas mediante un sistema de imagen fluorescente apropiada ^10.

Resultados

Identificación y histológico El examen de peritoneales depósitos de grasa

Disección anatómica bruto permite la identificación de cuatro de los cinco principales fuentes de grasa peritoneal (Figura 1A). Moviéndose a la derecha del centro de la parte superior son: el epiplón (OM; esbozado) situado sobre el estómago y el bazo, la grasa gonadal (GF) que rodea el ovario izquierdo (ov), la grasa uterina (UF) unido a los cuernos uterinos (uh) y el mesenter...

Discusión

El desarrollo de terapias para dirigirse a las células diseminadas requiere una comprensión mecanicista de la colonización metastásica, el primer paso crítico en el desarrollo de la enfermedad peritoneal. Para abordar estas cuestiones que reportamos enfoques que se pueden utilizar para discernir cómo la composición del tejido único del epiplón y la arquitectura promueven la colonización metastásica del cáncer de ovario. Las características distintivas de nuestro enfoque son: 1) el enfoque ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240