생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

요약

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

초록

고급 장 액성 난소 암 (HGSC)는 광범위한 복막 전이의 원인은 매우 불량한 예후를 계속; 여성의 적은 수의 30 % 이상 5 년 진단 후 생존. 그물막은 HGSC 전이 형성의 바람직한 위치이다. 이 미세 환경의 임상 적 중요성에도 불구하고, 난소 암의 진행에 대망 지방 조직의 기여도는 파악 하였다 남아있다. 이 혈관의 밀도가 둥지를 둘러싼 우유, B, T 구성되어 관광 명소, 그리고 NK 세포, 대 식세포 및 전구 세포로 알려진 구조를 포함한다는 점에서 대망 지방은 이례적인 일이다. 밀키 명소 복막 항상성에 필요한 대망의 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 우리는 우유 반점도 복막 지방의 난소 암 전이성 식민지, 복막 전이의 개발에 중요한 단계를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 여기에서 우리는 접근 방식은 우리가 평가하고 당에 우유 명소를 정량화하기 위해 개발 된 기술지방을 itoneal 및 생체 내 및 생체 외 모두 대망 조직의 난소 암 세포 전이 식민지에 자신의 기능 기여를 공부합니다. 따라서 이러한 접근법은 광범위한 복막 전이 개발 밀키 스폿 구조로 세포의 초기 위치 파악에서 난소 암 전이 형성의 연구를 가능하게 마우스 모델 세포주를 추가로 일반화된다.

서문

대부분의 고형 종양과는 달리, 고급 장 액성 난소 암 (HGSC)에서 전이는 복강 ^1로 제한됩니다. 따라서, 효과적인 복막 치료는 잠재적으로 제어하거나 HGSC을 근절 할 수있다. 현재, 표준 치료 방법은 화학 요법 ^1-3 결합 외과 cytoreduction이다. 불행하게도, 환자의 대부분은 경험과 질병 재발의 합병증에 굴복. 이러한 실력 통계 전이성 콜로니의 이해를 향상에 대한 요구를 표시, 처리되는 암세포는 활용하고, ^{(2) 전이를} 형성하는 호스트 조직 내 증식 지역화.

대망는 HGSC 전이 ^4-7의 바람직한 초기 사이트입니다. 다른 복막 지방 달리, 장간막 지방 조직은 복막 homeos있는 중요한 역할을하는 B, T 및 NK 세포 및 대식 세포를 포함하는 유백색의 반점으로 알려진 특이한 면역 구조를 포함TASIS ^8,9. 자신의 생리적 기능에 더하여, 우리는 우유 빛 반점이 난소 암 전이 식민 ^4에 적극적인 역할을한다는 것을 발견했다. 빠르게 홈 우유 명소 난소 암 세포, 세포가 분비 화성 인자쪽으로 이동하는 것을 제안, 실험 전이 분석, SKOV3ip.1, CaOV3 및 HeyA8 (인간)과 ID8 (C57BL / 6 쥐)에서. 흥미롭게도, 암 세포는 우유 반점 (즉, 성선 및 자궁 지방) ⁴ 부족 복막 지방을 식민지화하지 않습니다.

유백색 스폿 정착 조절 메커니즘을 파악하기 위해, 우리는 전이성 콜로니 ⁴ 시간 과정을 통해 세포 및 분자 사건의 심문을 가능 이종 이식 모델을 최적화하고있다. 여기에 기술 된 방법의 구체적인 장점은 완전히 생체 내에서 통합 및 m의 생체 ​​모델에서 사용자가 가설을 테스트 할 수 있습니다 조직의 구조와 기능에 대한 강조이다etastatic 식민지 ^4,10. 포함 또는 유백색 스폿 부족하거나 복막 지방 저장소에 암세포 지역화 및 성장을 비교함으로써, 연구자들은 숙박과 생리 관련 조직의 난소 암 세포의 점진적인 성장 밀키 스폿 내의 지방 세포와 세포의 상대적 기여도 (들)을 시험 할 수있다.

프로토콜

모든 마우스는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 시카고 동물 자원 센터의 대학의 감독하에 따라, 보관 유지 안락사시켰다.

실험 연구 1. 준비 동물

1. 동물 운송 및 취급의 잠재적 인 생리 학적 효과를 복구하는, 새로운 주택 및 환경에 적응하도록 허용합니다.
   참고 : 다음 기술은 마우스의 모든 시판 균주에 적용 가능하다. 실험에 사용되는 동물의 수는 연구 설계에 의존하고 통계로부터 상담 끝나야한다.

2. 식별 및 복막 지방 종점의 분리.

1. _{이산화탄소} 과다 복용과 사망을 확인하는 보조 물리적 방법을 통해 동물을 안락사.
2. 수확 복막 지방 저장소와 같은 내부 장기의 제거 (보조 방법), 엄마 구성KE 내부 장기 (그림 1A)를 노출하는 복막 벽을 통해 사타구니 유두에 가까운 중간 선 절개.
3. 대망 지방 (OM)의 경우, 집게 (그림 1C)로 복강에서 비장을 확장하여 대망 / 췌장 복잡한 노출됩니다. 밀접하게 모든 조직 연결을 트리밍하여 췌장 및 비장에서 대망을 놓습니다. 남아있는 췌장 조직이 ⁴ 절제되어 있는지 확인합니다.
4. 생식소 지방 (GF)의 경우, 조직의 연결 (그림 1A 상단에 적합한 올바른 T) ^(4)를 절단하여 난소와 소비세를 둘러싼 성선 지방을 들어 올려 집게를 사용합니다.
5. 자궁 지방 (UF)의 경우, 조직의 연결을 절단하여 자궁 뿔과 소비세를 둘러싼 자궁 지방 들어 올려 집게를 사용하여 (그림 1A를 오른쪽) ^4.
6. 장간막 지방 (MF)를 들면, 소장과 유문 간의 접합을 잘랐다. 집게 단단히 그립의 끝을에 사용소장하고 멀리 장간막 지방에서 천천히 "껍질". 해부 가위를 사용하여 장간막 루트에서 장간막 지방 릴리스 (그림 1A 왼쪽) ^4.
7. Splenoportal 지방 (SF)의 경우, 췌장, 비장의 폐문 연결 조직의 얇은 지방산 밴드를 노출하는 집게를 사용하여 비장의 선단을 들어. 먼저 비장에서 해부 조심스럽게 다음 췌장에서 해제,에 의해 splenoportal 지방 소비세 (그림 1B) ^4.

김사 염색을 사용하여 3. 밀키 스팟 확인

1. 소비세 omenta C57BL / 6 마​​우스에서 16 시간 동안 4 ° C (O / N)에서 5 % 중성 포르말린에 고정 (2.3 단계를 참조하십시오).
2. 고정 된 조직을 파라핀 매립 들어, 조직의 크기에 적합한 몰드를 선택한다. 주형을 채우기 위해 파라핀 저장소로부터 용융 파라핀을 붓는다. 카세트를 열고 따뜻한 사용CEPS, 금형에 조직을 전송합니다.
   1. 신중 종단면을 생산 중에 매립 파라핀 조직의 방향. 제자리에서 성형 및 프레스를 통해 표시된 조직 카세트를 놓습니다. 곰팡이가 적어도 30 분 동안 냉각 시키십시오.
3. 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 블록에서 (4 μm의 두께) 시리얼 부분을 잘라. 조직의 리본 파라핀 블록 떨어져 온다 섹션에서 미리 세정 슬라이드를 놓습니다.
4. 직렬 섹션 전체 대망; 수집 김사 얼룩 (3.6 참조)에 대한 모든 세 번째 섹션을 얼룩. 실온에서 O / N 바람직하게는, 공기 건조에 섹션으로 유리 슬라이드를 허용합니다. 말린 슬라이드 고정을위한 준비가되어 있습니다. 김사 염색 슬라이드에 비교를 위해 헤 마톡 실린 및 에오신에 대한 첫 번째 섹션 얼룩.
5. 자일 렌에서 두 개의 연속 5 분 배양하여 슬라이드를 Deparaffinize. 다음의 두 개의 연속 배양에 의해 슬라이드를 재수 : 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 마지막 WA를 탭터.
   1. 건조에서 슬라이드를 방지하기 위해 적절한 조치를 취하십시오. 실온에서 모든 단계를 수행합니다.
6. 완전 5 % 김사 솔루션을 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 담그고 실온에서 4 분 동안 품어 (수돗물에서 제조 된 V / W). 공기 건조, 60 초 동안 수돗물에 슬라이드를 씻어 설치 미디어를 사용하여 coverslip에 마운트.
7. 이미지 제조 업체 소프트웨어와 전체 슬라이드 스캐너 및 프로세스를 사용하여 염색 슬라이드. ImageJ에 소프트웨어 ^(4)를 사용하여 김사 염색 대망 섹션의 우유 자리 볼륨을 정량화.

생체 내 및 생체 외 연구 난소 암 세포의 4. 전파 및 준비

1. 열 욕조에 37 ° C의 세포 성장 매체의 사전 따뜻한 15 ml의. 세포주, 통로 번호, 날짜 및 동결 스톡을 제조하는 사람의 이름, 날짜 표시하여 적절한 크기의 조직 배양 플라스크 (예를 들어, 75cm ² 표면적)을 제조와 사람 세포를 도금 / 해동 누가.
   주의 : 아래 동결 통로 번호 날짜 전이성 표현형에 영향을 미칠 수 있기 때문에 전이의 연구에서, 이러한 상세한 내용은, 매우 중요하다.
2. 생물학적 안전 후드, 피펫 T-75 배양 플라스크에 배지 10 ㎖의 멸균 환경을 사용. 액체 질소 시스템에서 셀의 유리 병을 제거하고 세포 유형을 확인하기 위해 라벨을 참조. 37 ° C 열 욕에서 예열하여 한번에 하나의 셀의 바이 얼을 해동.
3. 멸균 기법을 사용하여, 피펫 1 × ^6은 배양 플라스크에 세포를 해동. 세포 부착 할 수 있도록 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. 부드럽게 균일 한 세포 현탁액을 형성 앞뒤로 플라스크를 흔들어.
   1. 조직 문화 인큐베이터에서 플라스크를 놓고 CO ₂ 환경 5 %에서 37 ℃로 유지한다. 세포는 O / N을 준수하도록 허용합니다.
4. 대기음 매체는 신선한 사전 예열 성장 용지로 교체합니다. 인큐베이터 모두에 플라스크를 배치유동 세포는 성장한다. 거꾸로 현미경을 사용하여 2-3 일마다 육안 검사에 의해 매일 세포의 성장을 모니터링합니다. 70-80% 합류 통로에 도달하면 세포 표준 세포 배양 기술을 사용한다.
   참고 : 실험 분석은 세포가 활발하게 확산되는 것을 보장하기 위해 70 %의 합류에 세포를 수확.
5. 배양 배지를 흡인하고 멸균 인산 완충 식염수 10 ㎖ (PBS)로 헹군다. 대기음 PBS 및 0.25 % 트립신 / EDTA (75cm ² 표면적 2-3 ml)에 추가하고 37 ºC에서 5 분 동안 배양한다. 시각 세포가 분리 된 것을 확인하고 성장 배지의 동일한 양을 추가하고 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득 상하 세포를 피펫.
   참고 : 그것은 트립신을 불 활성화로 성장 배지는 혈청을 포함하는 것이 중요하다. 후속 단계에서 세포의 손실을 보상하기 위해 소정의 실험에 필요한 수보다 많은 세포를 4 배 이상 -2- 준비
6. 생존 세포의 백분율을 결정hemacytometer 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 트리 판 블루 배제 분석을 통해 서스펜션.
   참고 : 여기에, 단지 세포의 ≥ 96 %가 생존하는 세포 제제를 사용합니다.
7. 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 플라스크에서 세포 현탁액을 전송. 4 ^O ℃에서 1,100 XG에서 5 분 원심 분리하여 펠렛 세포
8. 상등액을 흡인하고 용액 당 2 × ¹⁰⁶ 세포의 농도로 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁.

세포의 5 복강 내 주사

실험에서, 마우스는 분명히이 기술을 설명하기 위해, 병원체 노출 위험을 제한하기 위해 우리의 배리어 시설 내의 층류 또는 바이오 캐비닛 처리 첨부 영상 절차 승인 실험실에서 수행 하였다 : 참고 동물의 작업. 이 특별한 기술은 마취로 동물을 필요로하지 않습니다. 승인 된 프로토콜에 따라,이 techniq을 수행살아있는 동물에 UE. 이 연구를 위해 쥐의 적절한 균주를 사용합니다. 예를 들어 인간의 난소 암 세포 (SKOV3ip.1 및 HeyA8) 식민지의 연구 면역, 무 흉선 누드 마우스를 사용; 마우스 난소 암 세포 (ID8) 식민지의 연구 면역 C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다.

1. 로드 (500) 주사기로 단일 세포 현탁액의 μL 및 멸균 덮인 25 G 바늘에 넣어. 이 주입하기 전에 셀 전단을 줄일 수 있습니다.
2. 목의 목덜미에 의해 마우스를 들고 손바닥과 집게 손가락을 사용하여 꼬리를 잡고 링 (마우스를 왼손으로 억제) 새끼 손가락 사이의 왼쪽 뒷다리를 해결.
   참고 :으로 충격을 복부 장기를 피가 주입하는 동안 이동할 수 있도록 잘 마우스를 억제하기.
3. 바로 무릎 위 복부에 걸쳐 라인을 상상하고, 동물의 오른쪽에있는 점을 찾아 중간 선 부근에 있습니다. 항목의 점에 두개골 약간 내측입니다마지막으로 젖꼭지의.
   참고 : 마우스의 오른쪽에있는 바늘을 삽입하는 맹장을 방지하고 장 ^(11)을 천공의 위험을 줄일 수 있습니다.
4. 약 0.5 cm의 깊이로 쥐의 복부의 하부 측면 부분에 바늘을 삽입합니다. 바늘이 혈관 또는 다른 복막 기관에 침투되지 않았 음을 확인하기 위해 플런저를 다시 잡아 당깁니다.
   1. 유체가 흡입하는 경우 주사기 (샘플) ^(11)를 폐기합니다. - 녹색 갈색 또는 노란색 흡인 각각 장 또는 방광에 바늘 침투를 나타냅니다.
5. 느리고, 지속적인 압력을 사용하여 샘​​플을 주입. 바늘을 철회하고 케이지에 마우스를 반환합니다. 날카로운 물건 용기에 처분하기 전에 주사기를 정리해하지 마십시오.
6. 특정 시점에서의 CO ₂ 질식 및 중요한 기관의 제거를 통해 희생 마우스는 주사를 게시합니다.

생체 6. 밀키 자리 식민지

1. Quantita우유 명소 암 세포 현지화의 기 흐름 세포 계측법을 사용하여
   1. (단계 2.3에 설명 된대로 - 2.7) 마우스에서 복막 지방 저장소를 분리은 찬란 주사 얼음처럼 차가운 PBS에 암 세포와 즉각적인 장소 조직 태그.
      1. 이 특정 기술의 경우, 체중 경기 대망의 모든 지방 지방 조직. 전사 조직은 무 혈청 DMEM 1.5 ml의 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민을 함유하는 5 ㎖ 튜브를 분리하는 것. 3 개의 독립적 인 생쥐에서 수확 풀 조직은 유동 세포 계측법에 대한 세포의 충분한 수율을 보장합니다.
   2. 수술 용 가위를 이용하여 추가 민스 조직 (/ V W)는 콜라게나 I. 회전 혼합하면서 30 분 동안 37 ℃에서 조직 현탁액을 부화 0.4 %를 함유하는 무 혈청 DMEM 1.5 ml의.
      1. 선택적인 단계로, 더 저작으로 조직을 끊을. 이 경우에, 회전 방향을, 낮은 10 분간으로 저작, microstomacher 가방에 콜라게나 조직 현탁액을 전송할5 분 후 가방.
   3. 나일론 메쉬 필터 (60 μm의 기공)을 통해 필터 샘플은 큰 이물질을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에서 원심 분리를 통해 세포를 수집하여 상청액 분획을 폐기.
   4. ACK 용해 완충액 900 μL와 결합 PBS 100 ㎕에 세포 펠렛을 재현 탁하고 1 분 동안 RT에서 배양한다. 250 XG에 원심 분리기 세포 5 분 동안 상층 액을 버린다.
      1. 빙냉 PBS 250 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 60 μm의 세공 나일론 메쉬를 통해 샘플을 필터링. 얼음처럼 차가운 PBS 250 μL와 필터를 씻어.
   5. 사이토 561 nm의 옐로우 - 그린 레이저를 구비 한 흐름 및 585 ㎚ / 15 nm의 대역 통과 필터를 이용하여 인구 형광 태그 된 세포의 수를 정량. 부모의 세포 및 / 또는 적절한 음성 대조군 ⁽⁴⁾ 분석을 기반으로 tdTomato 양성 세포에 대한 게이트를 설정합니다.
2. 현미경과 거시적 인 전이의 정량
   1. 원하는 실험 엔드 포인트 (들)에서 분리, 즉시 적절한 고정 매체에 조직을 배치합니다. 이러한 그대로 성선, 자궁, 4 ℃에서 48 시간 동안 10 % 중성 포르말린에 장간막 지방 저장소와 같은 더 큰 샘플을 수정합니다. 2-16 시간 동안 4 ° C에서 5 % 중성 완충 포르말린에 (자궁 및 장간막 지방의 대망과 splenoportal 지방뿐만 아니라 조직에 상응하는) 작은 샘플을 수정합니다.
      1. 대안 적으로, 스냅 10월 같은 동결 배지에 넣어서 조직을 냉동 및 액체 질소의 적당량으로 드롭.
   2. 전송 파라핀에 삽입 할 때까지 4 ° C에서 70 % 에탄올 및 저장에 조직을 고정. 3.2 및 3.3에 기술 된 바와 같이 삽입 및 공정 조직.
      1. 미세 전이의 유무에 대한 조직을 평가하기 위해 H & E 염색 섹션을 사용하여 (즉, 셀 (50)의 클러스터). T 확인그는 이러한 cytokeratin 8/18에 대한 IHC 얼룩 등의 보조 방법으로 미세 전이의 존재는 난소 암 세포를 탐지한다.

7. 밀키 스팟 식민지 전의 VIVO

1. 기본 생체 대망 장기 배양 조건 확립
   1. 20 % FCS를 포함 DME / F12 매체의 500 μl를 포함하는 열두 웰 조직 배양 플레이트 잘 하나에서 하나의 문화 판의 삽입과 장소에 각각의 대망을 놓습니다. 24 ~ 48 시간 및 / 또는 추가 시점에 대한 5 % CO _2의 환경에서 37 ° C에서 기관 배양 물을 유지한다. 각 조건 (예를 들어, 미디어 타입 / 시점)에 대한 3 개의 독립적 인 omenta (세중 샘플)를 사용합니다.
   2. 조직의 무결성을 평가할 수 H & E 부분에 괴사 지방 세포에 비해 건강한 계산 3 단계에 설명 된대로 수정하고 프로세스 샘플, 실험 엔드 포인트에서 조직의 무결성을 확인합니다. 에서의 최소 ~ 120 세포생물학적 시료 5 ¹⁰ 본 살아있는 조직의 비율을 수립 할 필요가있다.
   3. 조직 기능, 20 % FCS와 DME / F12 매체의 500 μl를 포함하는 24 웰 플레이트의 별도의 우물에서 장소 omenta을 (N = 3)를 측정합니다. omenta 24 시간 동안 5 % CO ₂ 환경에서 37 ° C에서 미디어를 조정 할 수 있도록 허용하고 IL-6 ELISA 분석 ^(10)에 사용하기 위해 250 μl를 제거합니다.
2. SKOV3ip.1-GFP 세포와 마우스 복막의 생체 공존 배양
   1. 성장과 ml의 당 2 × 10 ⁶ 세포의 농도 섹션 4에 resuspend에 설명 된대로 찬란 태그 세포를 준비합니다.
   2. 문화 삽입의 막에 조직 접착제 ~ 6 μl를 적용하고 공기 건조에 있습니다. 과도한 접착제를 제거하기 위해 멸균 물을 두 번 막 씻으십시오. 공기 층류 후드 아래에있는 세포막을 건조.
   3. 조심스럽게 omenta을 절제하고, 접착제 코팅 MEMB에 첨부RANE 멸균 집게를 사용. 조직이 이전에 미디어를 추가로 1 분 동안 멤브레인을 준수하도록 허용합니다. 각 배양 인서트의 각 대망의 상부에 세포 현탁액 500 μl를 추가. DME / F-12 ⁽¹⁰⁾ 2.5 mL로 트랜스 웰 챔버 주위를 채 웁니다.
   4. 5 % CO _2의 환경에서 37 ℃에서 6 시간 동안 세포 현탁액 omenta 배양한다. 조심스럽게 제거하고 PBS ~ 10 ㎖를 가진 omenta을 씻는다. 적절한 형광 이미징 시스템 ^10을 이용하여 형광 암세포 병소를 시각화.

결과

복막 지방 종점의 식별 및 조직 학적 검사

총 해부학 적 절개는 복막 지방 (그림 1A)의 다섯 가지 주요 자료의 네 식별 할 수 있습니다. 상단 중앙에서 시계 방향으로 이동 : 대망 (OM, 설명) (어) 왼쪽 난소 (OV), 자궁 지방 (UF)가 자궁 뿔에 연결된 주변 위장과 비장, 성선 지방 (GF) 위에 위치 및 장간막는 (내) 소장 (SI)에 연결합니다. 난소 (OV), 자궁 (어), 소?...

토론

파종 세포를 표적으로하는 치료법의 개발은 전이성 식민지의 기계론의 이해, 복막 질환의 개발에 중요한 첫 번째 단계가 필요합니다. 우리가 대망의 독특한 조직 조성 및 구조는 난소 암, 전이성 콜로니를 촉진하는 방법을 식별하는 데 사용할 수있는 방법을보고하는 이러한 문제를 해결하기. 우리의 접근 방식의 구별 기능은 다음과 같습니다 식민지화 과정에서 초기 이벤트 1) 초점; 우유 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240