Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

Özet

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Özet

Yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSC), yaygın periton metastazı nedeni, son derece kötü prognoz devam eder; Kadınların% 30'dan azının 5 yıl teşhisten sonra hayatta. Omentum HGSC metastaz oluşumunun tercih edilen bir edilir. Bu mikro-klinik önemine rağmen, yumurtalık kanseri ilerlemesine omental adipoz dokudan katkısı örüntüsü oldukça kalır. Bu damar yoğun yuvalar çevreleyen süt B, T oluşmaktadır noktalar, ve NK hücreleri, makrofajlar ve projenitör hücreleri olarak bilinen yapılar içeren, omental adipoz olağan değildir. Sütlü noktalar periton homeostazı için gerekli olan omentum fizyolojik fonksiyonları, önemli bir rol oynamaktadır. Bu süt noktalar da periton adipoz yumurtalık kanseri, metastatik kolonizasyonunu periton metastaz gelişimini önemli bir adım teşvik göstermiştir. Burada yaklaşımlar biz değerlendirmek ve başına sütlü noktalar ölçmek için geliştirilen açıklamakadipoz itoneal ve in vivo ve ex vivo hem de omental doku yumurtalık kanseri hücresi metastatik kolonizasyon işlevsel katkı çalışma. Bu yaklaşımlar, böylece yaygın periton metastazı gelişimine sütlü nokta yapılarına hücrelerin ilk lokalizasyonu yumurtalık kanseri metastazı oluşumu çalışma sağlayan, fare modelleri ve hücre hatları ek genelleştirilebilir.

Giriş

En katı tümörlerin aksine, yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri (HGSC) için metastazlar periton boşluğuna ¹ ile sınırlıdır. Böylece, etkili periton tedaviler potansiyel kontrol etmek veya ortadan kaldırmak HGSC olabilir. Şu anda, standart bir tedavi yaklaşımı kemoterapi ^1-3 ile kombine cerrahi sitoredüksiyon olduğunu. Ne yazık ki, hastaların büyük çoğunluğu deneyim ve hastalığın tekrarlama komplikasyonlara yenik. Bu kasvetli istatistikler metastatik kolonizasyon geliştirilmiş anlayış ihtiyacını göstermek, süreç hangi kanser hücreleri, kullanmak ve metastaz ² oluşturmak için konak dokuları içinde çoğalmaya lokalize.

Omentum metastazı HGSC ^4-7 tercih edilen erken bir sitedir. Diğer periton adipoz aksine, omentum yağ dokusu, periton homeos kilit rol oynayan B, T ve NK hücreleri ve makrofajlar bulunur sütlü noktalar, olarak bilinen sıradışı bağışıklık yapıları içeriyortasis ^8,9. Fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, süt noktalar, yumurtalık kanseri, metastatik kolonizasyon ⁴ aktif bir rol oynadığı bulunmuştur. Hızlı ana süt noktalar yumurtalık kanser hücreleri, salgılanan bir kemotaktik faktör doğru hareket ettiğini göstermektedir; deneysel metastaz tahlilleri, SKOV3ip.1, CaOV3 ve HeyA8 (insan) ve ID8 (C57BL / 6 fare) kullanılmaktadır. İlginçtir, kanser hücreleri sütlü noktalar (yani, gonad ve rahim yağ) ⁴ eksik periton adipoz kolonize yok.

Sütlü nokta kolonizasyonu düzenleyen mekanizmaları belirlemek amacıyla, biz metastatik kolonizasyon ⁴ süresi boyunca hücresel ve moleküler olayların sorgulama sağlayan ksenogref modellerini optimize ettik. Bu tarifnamede tarif edilen yaklaşımların özel bir avantajı, tam olarak, in vivo olarak entegre edilmiştir ve m ex vivo modeller kullanıcıların hipotezleri test sağlayan doku mimarisi ve işlevi üzerinde vurgulamasıdıretastatic kolonizasyon ^4,10. Içeren veya sütlü noktalar eksikliği ya periton yağ depolarında kanser hücre lokalizasyonu ve büyümeyi karşılaştırarak, araştırmacılar arasında ve fizyolojik ilgili dokularda yumurtalık kanseri hücrelerinin ilerleyici büyüme için sütlü noktalar içinde adipositlerde ve hücrelerin göreceli katkısını (ler) test edebilirsiniz.

Protokol

Tüm fareler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine ve Chicago Hayvan Kaynak Merkezi'nde Üniversitesi gözetiminde göre, muhafaza korunur ve ötenazi uygulandı.

Deneysel Çalışmalar 1. hazırlanması Hayvanlar

1. Hayvanlar taşıma ve kullanım potansiyeli fizyolojik etkilerinden kurtarmak için, yeni konut ve çevre gelmesini bekleyin.
   Not: Aşağıdaki tekniğin tüm fareler ticari olarak temin edilebilir suşlar için de geçerlidir. Bir deney için kullanılan hayvanların sayısı, çalışma tasarımına bağlıdır ve istatistik gelen istişare ile yapılmalıdır.

2. Kimlik ve Periton Fat Depolarında İzolasyonu.

1. CO ₂ doz aşımı ve ölüm onaylamak için ikincil bir fiziksel yöntemle hayvanların Euthanize.
2. Hasat periton yağ deposu olarak iç organ çıkarılması (ikincil yöntemi), anne oluşturmaktadırke iç organları (Şekil 1A) ortaya çıkarmak için periton duvar üzerinden kasık papilla yakın bir orta hat kesi.
3. Omentum Fat (OM) için, forseps (Şekil 1C) ile periton boşluğuna gelen dalak uzatarak omental / pankreas kompleksi açığa. Yakından doku bağlantıları kırparak pankreas ve dalak omentum bırakın. Kalan pankreas dokusu ⁴ eksize emin olun.
4. Gonadal Fat (GF) için, doku bağlantıları (Şekil 1A üst righ t) ⁴ keserek yumurtalıklar ve rüsumat çevreleyen gonadal yağ kaldırmak için forseps kullanabilir.
5. Rahim Fat (UF) için, doku bağlantıları keserek rahim boynuzları ve rüsumat çevreleyen rahim yağ kaldırmak için forseps kullanabilir (Şekil 1A sağ alt) ^4.
6. Mezenterik Fat (MF) için, ince bağırsak ve pilor arasındaki kavşak kesti. Forseps sıkıca kavrama serbest ucunu için kullanınince bağırsak ve uzak mezenterik yağ yavaş yavaş "soyma". Diseksiyon makas kullanarak mezenterik kökünden mezenterik yağ bırakın (Şekil 1A sol alt) ^4.
7. Splenoportal Fat (SF) için, pankreas dalak hilusu bağlayan doku ince yağlı bandı ortaya çıkarmak için forseps kullanarak dalak distal ucunu kaldırın. İlk dalak onu diseksiyon dikkatlice ardından pankreas onu bırakmadan tarafından splenoportal yağ tüketim (Şekil 1B) ^4..

Giemsa boyanması Kullanılması 3. Sütlü Nokta Kimlik

1. Tüketim omenta C57BL / 6 farelerinden alınan ve 16 saat süre ile 4 ° C'de (O / N)% 5 nötr tamponlu formalin içinde çözmek (2.3 adım bakınız).
2. Sabit doku gömme parafin için, doku boyutu için uygun olan bir kalıbın seçin. Kalıbı doldurmak için parafin hazneden erimiş parafin dökün. Kaseti açın ve sıcak kullanmaAk, kalıp içine doku aktarın.
   1. Dikkatle uzunlamasına bölümleri üretmek için gömme parafin sırasında dokuları yönlendirin. Sıkıca yerinde kalıp ve basın üzerinde etiketli doku kasetini yerleştirin. Kalıp en az 30 dakika soğumasını bekleyin.
3. Formalin ile fikse parafin gömülü (FFPE) doku blok uzaklıkta (4 mikron kalınlığında) seri kesitler kesin. Doku şerit parafin bloğu kapalı geliyor gibi bölümlere altında önceden temizlenir slayt yerleştirin.
4. Seri bölüm tüm omentum; toplamak ve Giemsa (3.6 bakınız) her üçüncü bölümü leke. Oda sıcaklığında O / N, tercihen hava ile kurumaya bölümleri ile cam slayt izin verir. Kurutulmuş slaytlar sabitlenmesi için hazırız. Giemsa lekeli slaytlar karşılaştırmalar için hematoksilen ve eozin ilk bölümü Leke.
5. Kisilenler iki ardışık 5 dk inkubasyon tarafından slaytlar Deparaffinize. Aşağıdaki iki sıralı inkubasyon slaytlar rehidrate:% 100 etanol,% 95 etanol ve son olarak da wa dokununter.
   1. Kurutma slaytları önlemek için gerekli önlemleri alın. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın.
6. Tamamen% 5 Giemsa çözeltisi ihtiva eden bir Coplin kavanoza slaytlar daldırın ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca inkübe (musluk suyu hazırlanan a / h). Hava-kuru, 60 saniye musluk suyunda slaytlar durulayın ve montaj medyayı kullanarak lamel ile monte edin.
7. Görüntü üretici yazılımı ile Tüm Slayt Tarayıcı ve işlem kullanılarak boyandı slaytlar. ImageJ yazılımı kullanarak ⁴ Giemsa lekeli omental bölümlerde sütlü nokta hacmini ölçmek.

İn vivo ve in vivo çalışmalar için Ex Yumurtalık Kanseri Hücreleri 4. Yayılım ve Hazırlama

1. Bir ısı banyosu içinde 37 ° C hücre büyüme ortamının önceden sıcak 15 mi. Hücre hattı, geçit numara, tarih ve dondurulmuş stok hazırlayan kişinin adı ve tarih ile etiketleme uygun boyutta doku kültürü şişesi (örneğin, 75 cm ² yüzey alanı) hazırlayınve kişinin hücreleri kaplama / çözülme kim.
   Not: Aşağı donma ve geçit sayısının tarihi metastatik fenotip etkileyebilir olarak metastaz çalışmalarda böyle ayrıntılı bilgi çok önemlidir.
2. Biyolojik güvenlik kabini, bir pipet, T-75 kültür şişesi içine 10 ml ortamda steril bir ortam kullanılması. Sıvı azot sisteminden hücrelerin bir şişe çıkarın ve hücre tipini onaylamak için etiketi kontrol edin. 37 ° C ısıya banyosunda ısıtılarak bir zamanda hücrelerin sadece bir şişe çözülme.
3. Steril tekniği kullanarak, pipet ^1x10 6 kültür şişesi içine hücreleri çözülmüş. Hücreler takmak için izin inkübatör şişeyi yerleştirin. Yavaşça düzgün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ileri ve geri şişeyi sallayın.
   1. Doku kültürü inkübatöründe içine yerleştirilir _ve CO2 ortamında% 5 37 ° C'da koruyun. Hücreler O / N uymak için izin verin.
4. Aspire medya ve taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile değiştirin. Kuvöz ve tüm şişeyi koyunow hücreleri büyümek. Devrik bir mikroskop kullanarak her 2-3 günde bir görsel kontrol ile günlük olarak, hücre büyümesini izlemek. % 70-80 izdiham ulaştıktan sonra geçiş hücreleri standart hücre kültürü teknikleri kullanın.
   Not: Deneysel analizler hücreler aktif çoğalan emin olmak için% 70 izdiham hücreleri hasat için.
5. Kültür ortamı aspire ve steril fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) ile durulayın. PBS aspire ve% 0.25 tripsin / EDTA (75 cm ² yüzey alanı için 2 ila 3 ml) ekleyin ve 37 ° C 'de 5 dakika inkübe edilir. Görme hücreler müstakil teyit ve büyüme ortamı eşit hacimde ekleyin ve hafifçe tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı hücreleri pipetle.
   Not: It tripsin inaktive gibi büyüme ortamı serumu içeren önemlidir. Sonraki adımları sırasında hücre kaybını telafi etmek için verilen bir deney için gerekli olan sayıdan daha fazla hücreler 4 kat en az 2- hazırlanın
6. Yaşayabilir hücrelerin yüzdesini belirlemekHemasitometre veya otomatik bir hücre sayacı tripan mavi dışlama tahlili ile süspansiyon.
   Not: Burada, sadece hücre ≥% 96 uygulanabilir olduğu hücre preparatları kullanılır.
7. Bir 50 ml konik bir tüp şişeye hücre süspansiyonu aktarın. 4 ^o C'de, 1100 x g'de 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri
8. Süpernatant aspire ve ml başına 2x10 ⁶ hücre bir konsantrasyona PBS içinde hücre pelletini.

Hücreleri 5. intraperitoneal enjeksiyon

Deneylerde, fareler açıkça bu tekniği göstermek için, patojen maruz kalma riskini sınırlamak amacıyla bizim bariyer tesis içinde laminer hava akımı ya da biyogüvenlik kabini işlenir, beraberindeki video prosedürleri onaylı bir laboratuarda yapılmıştır: Not Hayvan çalışmaları için. Bu tekniğin anestezi altında hayvanlara gerektirmez. Onaylanmış protokoller kapsamında, bu TECHNIQ gerçekleştirmekCanlı hayvanlar üzerinde ue. Bu çalışma için, farelerin ilgili suşlarının kullanın. Örneğin: insan yumurtalık kanseri hücresinin (SKOV3ip.1 ve HeyA8) kolonizasyonu çalışması için immün sistemi baskılanmış, atimik çıplak farelerin kullanın; Fare yumurtalık kanseri hücreleri (ID8) kolonizasyon çalışma için, immunokompetan C57BL / 6 fareleri kullanır.

1. Yük 500 şırıngaya tek bir hücre süspansiyonu ul ve steril kapaklı 25 G iğne koymak. Bu enjeksiyondan önce hücre kesme azaltır.
2. Ensesinden fare Pick up ve palmiye ve işaret parmağı ile kuyruk tutun ve halka ve (fare sol el ile sınırlandığını) küçük parmak arasında sol arka bacak düzeltmek.
   Not: travmatik karın organları önlemek o enjeksiyon sırasında hareket edemez, böylece de fareyi dizginlemek için.
3. Sadece dizlerinin üstünde karın üzerinde bir çizgi düşünün, ve hayvanın sağ tarafında bir noktayı bulmak ve orta hatta yakın. Giriş noktası için kranial ve biraz medialGeçen meme.
   Not: Farenin sağ tarafındaki iğneyi takma çekum önler ve bağırsak ¹¹ delme riskini azaltır.
4. Yaklaşık 0,5 cm derinliğe kadar farelerin karın alt yan bölgesinde iğne takın. İğne kan damarı ya da diğer organlara nüfuz periton olmadığını doğrulamak için pistonu geri çekin.
   1. Herhangi bir sıvı aspire edilirse şırınga (ve ^örnek) 11 atın. A-yeşilimsi kahverengi veya sarı aspirat sırasıyla bağırsak veya mesane içine iğne penetrasyonu gösterir.
5. Yavaş, sabit bir basınç kullanarak örnek enjekte edilir. İğneyi geri çek ve kafes fare dönün. Kesici kapta atmadan önce şırıngayı tekrarlamak etmeyin.
6. Belirli zaman noktalarında CO ₂ boğulma ve hayati organ aracılığıyla Kurban fareler enjeksiyon sonrası.

In vivo 6. Sütlü nokta kolonizasyonu

1. Quantitasütlü noktalar kanser hücresi lokalizasyonu yon akışı sitometri kullanılarak
   1. (Adım 2.3 anlatıldığı gibi - 2,7) farelerin periton yağ depoları yalıtmak floresan enjekte edilen buz gibi soğuk PBS kanser hücrelerini ve acil yer dokuları etiketledi.
      1. Bu özel tekniğin için, ağırlık-maç omentum tüm adipoz yağ dokuları. Aktarım dokular serumsuz DMEM 1.5 ml ve% 0.1 (w / v) sığır serum albümini içeren 5 ml tüpler ayırmak için. Üç bağımsız farelerden toplanan Havuz dokular akış sitometrisi için yeterli bir hücre verimi sağlamak.
   2. Cerrahi makas kullanılarak ekleyin kıyma dokular (w / v) kollajenaz I. dönme karıştırma ile 30 dakika için 37 ° C 'de doku süspansiyonu inkübe% 0.4 ihtiva eden serumsuz DMEM 1,5 mi.
      1. Tercihe bağlı bir adım olarak, daha da çiğnenmesi ile doku ilişkisini. Bu durumda, yönlendirme döner düşük üzerinde 10 dakika süreyle masticate bir microstomacher torbasına doku kolajenaz süspansiyonu transfer5 dakika sonra torba.
   3. Bir naylon örgü filtre (60 mikron gözenek) aracılığıyla filtre örnekleri büyük enkaz kaldırmak için. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yoluyla hücreler toplamak ve süpernatan fraksiyonu atın.
   4. ACK lisiz tamponu 900 ul ile birlikte 100 ul PBS hücre pelletini ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 250 x g'de santrifüjleyin hücreler 5 dakika süreyle tavlandı ve süpernatant atılır.
      1. Buz soğukluğunda PBS 250 ul hücre pelletini. Tek hücre süspansiyonu sağlamak için 60 mikron gözenek naylon örgü ile örnekler Filtre. Buz soğukluğunda PBS 250 ul ile durulayın.
   5. Sitometresi bir 561-nm sarı-yeşil lazer ile donatılmış bir akış ve 585 nm / 15 nm bant geçiren filtre kullanarak nüfusun floresan levhası 'hücre sayısını quantitate. Parental hücreler ve / veya uygun negatif kontroller ⁴ analizine dayanan tdTomato-pozitif hücreler için kapı ayarlayın.
2. Mikroskobik ve makroskobik metastaz kantitasyonu
   1. İstenilen deneysel bitiş noktası (ler), izole ve hemen uygun sabitleme medyada dokuları yerleştirin. Örneğin sağlam gonadal, rahim ve 4 ° C'de 48 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde mezenterik yağ deposu olarak daha büyük bir numune, düzeltildi. 2-16 saat boyunca 4 ° C 'de% 5 nötral tamponlu formalin içine (rahim ve mezenterik yağ omental ve splenoportal yağ, ve doku eşdeğer) daha küçük örnekler düzeltildi.
      1. Alternatif olarak, çıtçıt OCT gibi bir dondurma ortamda koyarak dokuları dondurma ve sıvı azot uygun bir miktarda içine bırakın.
   2. Aktarım, parafin içine gömülmek kadar 4 ° C 'de% 70 etanol ve saklamak için dokuların sabit. 3.2 ve 3.3 açıklandığı gibi gömün ve süreç doku.
      1. Mikroskobik metastazları varlığında ya da yokluğunda dokuları değerlendirmek için H & E ile boyanmış bölümü kullanarak (örneğin, 50 hücre kümeleri). T onaylaböyle sitokeratin 8/18 için bir IHC leke olarak ikincil bir yöntem ile mikroskobik metastazlarının varlığı yumurtalık kanser hücrelerini tespit etmek.

7. Sütlü Nokta Kolonizasyon Ex Vivo

1. Temel ex vivo omental organ kültürü koşullarının oluşturulması
   1. % 20 FCS içeren DME / F12 ortamı, 500 ul ihtiva eden bir on-çukurlu doku kültürü plakasının bir oyuk içinde tek bir kültür plakası takılır ve her omentum yerleştirin. 24 ila 48 saat ve / veya ek bir zaman noktası için _bir% 5 CO2 ortamında 37 ° C 'de, organ kültürleri koruyun. Her durumda (örneğin, ortam türü / zaman noktası) için üç bağımsız omenta (üçlü numuneler) kullanın.
   2. Doku bütünlüğünün değerlendirir H & E bölümlerinde nekrotik adipositler karşı sağlıklı Sayma Adım 3'te açıklandığı gibi düzeltmek ve süreç örnekleri, deneysel uç noktalar da dokuların bütünlüğünü doğrulamak için. Den en az ~ 120 hücre5 biyolojik örnekler ^{10, bu} canlı doku yüzdesini formüle etmek gereklidir.
   3. Doku fonksiyonu,% 20 FCS ile DME / F12 ortamı, 500 ul ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka ayrı kuyularda yer omenta (n = 3) ölçmek. Omenta 24 saat boyunca _bir% 5 CO2 ortamında 37 ° C 'de ortam koşullandırılması için izin verin ve daha sonra, bir IL-6, ELISA tahlilinde ¹⁰ kullanım için 250 ul çıkarın.
2. SKOV3ip.1-GFP hücreleri ile fare omentum ex vivo ko-kültür
   1. Büyüme ve ml başına 2 x 10 ⁶ hücre konsantrasyonunda bölüm 4 ve tekrar süspansiyon tarif edildiği gibi floresan etiketlendi hücrelerini hazırlamak.
   2. Kültür ucun zara doku yapıştırıcısı ~ 6 ul uygulayın ve hava ile kurumaya için izin verir. Herhangi bir aşırı yapıştırıcı kaldırmak için steril su ile iki kez zarı yıkayın. Hava laminar kaputun altında membranlar kurulayın.
   3. Dikkatle omenta tüketim ve yapışkan kaplı memb ekleyinrane steril forseps kullanılarak. Doku öncesinde medya ekleyerek 1 dakika zarının uymak için izin verin. Her kültür insert her omentum üstüne hücre süspansiyonu 500 ul ekleyin. DME / F-12 ¹⁰ 2,5 ml transwell odasının çevresini doldurun.
   4. % 5 _CO2 ortamında 37 ° C 'de 6 saat süre ile hücre süspansiyonu ile omenta inkübe edin. Dikkatle çıkarın ve ~ 10 ml PBS ile omenta yıkayın. Uygun bir floresan görüntüleme sistemi ^{10 kullanılarak} floresan kanser hücresi odaklar gözünüzde canlandırın.

Sonuçlar

Periton Fat Depolarında Tanımlanması ve Histolojik İnceleme

Brüt anatomik diseksiyon periton yağ (Şekil 1A) beş başlıca kaynaklarından dört belirlenmesini sağlar. Üst merkezine saat yönünde hareket eden şunlardır: omentum (OM; özetlenen) (ah), sol yumurtalık (ov), rahim yağ (UF) rahim boynuzları bağlı çevreleyen mide ve dalak, gonadal yağ (GF) üzerinde bulunan ve mezenter (MY) ince bağırsağın (si) bağlı. Yumurtalık (ov), ute...

Tartışmalar

Development of therapies to target disseminated cells requires a mechanistic understanding of metastatic colonization, the critical first step in the development of peritoneal disease. To address these issues we report approaches that can be used to discern how the omentum’s unique tissue composition and architecture promote ovarian cancer metastatic colonization. Distinguishing features of our approach are: 1) the focus on early events in the colonization process; 2) comparison of milky spot-containing an...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240